Nitrogenoksid i utåndingsluft: EN BIOMARKØR FOR ASTMA SAMMENDRAG: Nitrogenoksid (NO) i utåndingsluft er en markør for luftveisinflammasjon ved astma og andre inflammatoriske lungesykdommer. Konsentrasjon av ekspirert NO kan måles online ved hjelp av kommersielt tilgjengelige analysatorer. Målingen gjøres ikke-invasivt og undersøkelsen medfører ingen risiko eller ubehag for pasienten. Dette innebærer høy praktisk anvendbarhet og mulighet til å foreta gjentatte målinger. I løpet av de siste ti årene har metoden fått et utstrakt anvendelsesområde innen forskning, klinikk og epidemiologi. Astmatikere har signifikant høyere NO-konsentrasjoner i utåndingsluft enn lungefriske. Det er påvist positiv korrelasjon mellom ekspirert NO og andre markører for astmatisk luftveisinflammasjon, slik som bronkial hyperreaktivitet, eosinofili i blod og indusert sputum, og eosinofil inflammasjon i bronkialbiopsier. Det er publisert referanseverdier for ekspirert NO. Det er imidlertid store sprik mellom de ulike referansematerialene, og foreløpig er det ikke tilrådelig å angi en øvre grenseverdi for ekspirert NO for å skille en positiv fra en negativ test (astma versus ikke-astma). Nytten av NO-målinger er undersøkt når det gjelder diagnostikk av astma, predikering av astmaeksaserbasjoner og monitorering av medikamentell astmabehandling Fortsatt gjenstår mange spørsmål og metodens endelige plass er ikke avklart. Sannsynligvis vil metoden vise seg å være mest nyttig for spesielle subgrupper av astmapasienter, og da i form av målinger der den enkelte pasient følges over tid. Kontaktadresse: May Brit Lund overlege, dr.med Lungemedisinsk avdeling Hjerte- og lungeklinikken Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet m.b.lund@medisin.uio.no may brit lund, Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet Måling av nitrogenoksid (NO) i utåndingsluft som en markør for luftveisinflammasjon er en metode som ble utviklet på 90-tallet. Metoden fikk raskt en sentral plass i lungemedisinsk forskning og diagnostikk. Et Google-søk på nitric oxide AND asthma resulterer i 442 000 treff. Måling av ekspirert NO gjøres ikke-invasivt og undersøkelsen medfører ingen risiko eller ubehag for pasienten. Dette innebærer høy praktisk anvendbarhet og mulighet til å foreta gjentatte målinger. Målinger kan gjøres også hos personer som har betydelig nedsatt lungefunksjon. Endogen danning av NO Fra 1970-tallet har det vært kjent at vasodilatasjon medieres via frigjøring av en labil endotelavhengig substans, kjent som endotelderivert relakserende faktor (1). I 1987 kunne to uavhengige forskergrupper vise at endotelderivert relakserende faktor var identisk med gassmolekylet NO (2, 3). I 1998 ble forskerne som sto bak denne oppdagelsen tildelt Nobelprisen i medisin. Gassmolekylet NO, som ellers var kjent som en forurensningskilde (sur nedbør, eksos, tobakksrøyk), viste seg altså å være en viktig fysiologisk substans. Substrater for danning av NO er aminosyren l-arginin og oksygen. Enzymet NO-syntase (NOS) katalyserer omdanning av l-arginin til l-citrullin, hvorved NO frigjøres. Reaksjonen ble første gang beskrevet i 1988 (4). Flere isoformer av NOS er senere identifisert. Det finnes to hovedtyper konstitutiv og induserbar NOS (1). De konstitutive isoformene, som er ansvarlig for basalproduksjonen av NO, er kalsiumavhengige og aktiveres av økt intracellulært kalsium. Den induserbare NOS (inos) finnes i aktiverte immunceller. Den er ikke kalsiumavhengig. Den induseres av proinflammatoriske cytokiner. Ved induksjon dannes store mengder NO, opptil tusen ganger mer enn hva som kan produseres via de konstitutive isoenzymene. inos hemmes av kortikosteroider. Det gjør ikke de konstitutive isoformene. Produksjon av NO i lunger/luftveier NO produseres endogent i lunger og luftveier (5) og kan påvises i utåndingsluft hos dyr og mennesker (6, 7). NO spiller en sentral rolle ved inflammatoriske prosesser i lungene, som modulator for vaskulær regulering, neurotransmisjon, vertsforsvar og cytotoksisitet (5). Økte konsentrasjoner av ekspirert NO er påvist hos personer med ulike typer luftveislidelser, men er viktigst som markør for eosinofil inflammasjon ved astma (8, 9). NOS-aktivitet i lungevev kan måles, og økt aktivitet er påvist i biopsier fra pasienter med forskjellige lungesykdommer (10). Økt ekspresjon av den induserbare NOS er vist ved immuncytokjemisk undersøkelse av epitelceller i bronkialbiopsier fra pasienter med astma (11). NO produseres også i svært høye konsentrasjoner i øvre luftveier (paranasale sinus, nasofarynks, nese). Hos friske antas NO fra øvre luftveier å gi det kvantitativt største bidraget til konsentrasjonen i utåndingsluft (12). Måling av NO i utåndingsluft Ettersom NO er et gassmolekyl som produseres endogent i lungene, kan gassen påvises i utåndingsluft. Og ettersom NO er en markør for inflammatoriske prosesser, kan man anta at nivået av NO i utåndingsluft vil være korrelert til betennelsesaktivitet. Måling av NO er basert på fotoemisjon 8 allergi i prakxsis 4/2009
Astmatikere har signifikant høyere nivå av nitrogenoksid i utåndingsluft enn lungefriske. NO-målinger vil derfor være et viktig redskap ved diagnostikk og monitorering av astma. (kjemiluminescence) (7). Når NO reagerer med ozon som genereres i analysatoren, dannes elektronisk eksitert NO 2, som går tilbake til sitt basale energinivå ved å gi fra seg et foton. Analysatoren måler lysintensiteten i denne fotokjemiske reaksjonen. Antall NO-molekyler i reaksjonskammeret vil være direkte proporsjonalt med NO-konsentrasjonen i utåndingsluft. Moderne NO-målere er konstruert slik at pasienten puster direkte inn i en analysator som måler gasskonsentrasjoner, trykk, volum og strømningshastighet, og presenterer dataene grafisk på en monitor via en datamaskin (online-måling). Målingene gjøres under en sakte vitalkapasitetmanøver, dvs under ekspirasjon fra total lungekapasitet til residualvolum. For å unngå en betydelig tilblanding av NO fra de øvre luftveier må ekspirasjonsmålingen skje når den bløte gane er lukket. Det er utarbeidet felles internasjonale retningslinjer fra American Thoracic Society (ATS) og European Respiratory Society (ERS) for standardiserte måleprosedyrer av ekshalert NO (13). Det finnes forskjellige kommersielt tilgjengelige måleapparater på markedet. I tillegg til stasjonære NO-apparater er det i senere år utviklet små, lett transportable, håndholdte analysatorer som kan være velegnet til bruk i feltstudier og epidemiologiske undersøkelser. De stasjonære NO-analysatorene må kalibreres regelmessig i henhold til manual, og kalibreringsgassen må inneholde en stabil konsentrasjon av NO balansert med N 2. Leverandør må kunne garantere at kalibreringsgassen oppfyller spesifiserte krav. Ekshalert NO som en biomarkør for astma Astma kjennetegnes av kronisk luftveisinflammasjon. Metoder som direkte eller indirekte gir et objektivt mål for grad av inflammasjon vil derfor være viktige redskap i diagnostikk og monitorering av astma. Måling av NO i utåndingsluft er for tiden den mest brukte og best kartlagde biomarkøren for astma. Astmatikere har signifikant høyere NO-nivåer i utåndingsluft enn lungefriske (8, 9). Årsaken antas å være cytokinmediert induksjon av inos. inos er påvist i luftveisepitel og inflammatoriske celler hos personer med astma, men svært sjelden hos ikke-astmatikere (11). Hos astmatikere er nivå av ekspirert NO korrelert med ekspresjon av inos i luftveisepitelet, hvilket indikerer at økt inosaktivitet er ansvarlig for økt NO-produksjon (14). Denne oppreguleringen av inos i luftveiene hos astmatikere skjer som et svar på inflammatoriske cytokiner via ulike cellulære mekanismer (11, 15). Steroider hemmer den cytokinmedierte induksjonen av inos, og NO-nivåene hos astmatikere som behandles med steroider (peroralt eller inhalasjon) er ikke signifikant forskjellige fra nivåer hos lungefriske (8, 9). Steroider påvirker ikke konsentrasjonen av ekspirert NO hos lungefriske, hvilket styrker hypotesen om at det er den induserbare NOS som gir økt NO-produksjon ved astma. Det er påvist en positiv korrelasjon mellom ekspirert NO og andre markører for astmatisk luftveisinflammasjon, slik som bronkial hyperreaktivitet (16, 17) allergi i prakxsis 4/2009 9
og eosinofili i blod og i indusert sputum (18, 19). Det er også vist assosiasjon mellom ekspirert NO og eosinofil inflammasjon i bronkialbiopsier fra pasienter med atopisk astma (20). I en populasjonsbasert tvillingstudie ble det vist at genetiske effekter kan forklare 60% av variasjonen i ekspirert NO (21). Ekshalert NO i diagnostikk av astma Måling av NO i utåndingsluft kan være et nyttig hjelpemiddel for å etablere diagnosen astma. Selv om diagnosen vanligvis kan stilles ved konvensjonelle metoder, vil måling av NO kunne gi viktig tilleggsinformasjon og være et nyttig supplement i uklare tilfeller. Det er i løpet av de siste 3-4 årene publisert referanseverdier for ekspirert NO basert på undersøkelser i den generelle befolkning. Studiene viser at det er store sprik mellom de ulike referansematerialene, og det lar seg ikke gjøre å definere en øvre cut-off-verdi som med sikkerhet kan skille en astmatiker fra en ikke-astmatiker. I et svensk referansemateriale (22) er øvre 95% CI for ekspirert NO omkring 47 ppb, mens i en italiensk studie (23) er 90% CI i område18-20 ppb. I studier av barn er det tilsvarende store forskjeller i referanseverdier. Når man sammenlikner referanseverdier, er det viktig å sjekke at målingene er gjort med samme strømningshastighet og at anbefalte retningslinjer fra ATS/ERS er fulgt. Når det gjelder effekt av alder, kjønn og høyde på nivå av ekspirert NO, er det sprikende resultater, men sannsynligvis er effekten beskjeden hos voksne. I en prospektiv studie av 240 pasienter som ble henvist til utredning med spørsmål om astma, fant man at måling av ekshalert NO (cut-off-verdi 16 ppb) hadde 90% spesifisitet for diagnosen astma og positiv prediktiv verdi > 90% (24). Det må imidlertid presiseres at NO-måling alene ikke er tilstrekkelig til å stille diagnosen astma ettersom høy konsentrasjon av NO også kan ha andre årsaker. I en riktig klinisk setting (tilstedeværelse av luftveissymptomer og variabel luftstrømsobstruksjon), kan imidlertid påvisning av høy NO være nyttigere enn andre tester for å etablere diagnosen astma. NO-målinger har vist å ha begrenset nytte hos en stor andel voksne med astma fordi målinger påvirkes av ytre faktorer så eksempelvis alkohol og røyking. illustrasjonsfoto: www.sxc.hu Nytte av NO-måling for å monitorere astma og predikere eksaserbasjoner Hvis konsentrasjon av ekshalert NO er en bedre markør for astmatisk luftveisinflammasjon enn symptomer og spirometri, burde måling av NO kunne benyttes til å identifisere pasienter med dårlig astmakontroll og således fange opp eksaserbasjoner på et tidlig tidspunkt. Enkelte studier har vist at økt ekspirert NO er en prediktor for astmaeksaserbasjoner (25), men andre studier har ikke kunnet vise det samme (26). Endringer i NO har naturlig nok bedre positiv prediktiv verdi enn enkeltmålinger av NO (27). At endring i ekshalert NO reflekterer astmakontroll, har også vært vist hos røykere, selv om disse i utgangspunktet har mye lavere NO-konsentrasjoner enn ikke-røykere (28). I hvilken grad måling av ekshalert NO reflekterer astmakontroll og kan bidra til å predikere eksaserbasjoner er ennå ikke avklart. Sannsynligvis er det slik at seriemålinger av NO kan være av nytte for visse subgrupper av pasienter, men er antagelig av mindre nytte i en velkontrollert pasientpopulasjon. Nytte av NO-måling i behandlingsstrategien av astma Retningslinjer for astmabehandling er basert på symptomer og lungefunksjonstester. Måling av NO i utåndingsluft kan gi tilleggsinformasjon som kan være nyttig for å skreddersy den medikamentelle behandlingen. Noen studier har vist at pasienter som monitoreres med NOmålinger kan oppnå astmakontroll med lavere vedlikeholdsdose inhalasjonssteroider enn når behandlingen styres etter konvensjonelle retningslinjer (29). Andre studier har imidlertid ikke kunnet vise det samme (30). En systematisk gjennomgang basert på Cochranedatabasen (31) har tatt for seg alle randomiserte, kontrollerte studier som sammenlikner astmabehandling styrt ut fra henholdsvis NO-målinger og tradisjonelle metoder (symptomer, spirometri, PEF-målinger). Ingen signifikante forskjeller ble vist, og det konkluderes med at bruk av NO-målinger for å skreddersy doseringen av inhalasjonssteroider er av usikker verdi og metodens rolle i denne sammenheng er ikke endelig avklart (31). Metodens begrensninger Så lenge referanseverdiene er sprikende og det er vanskelig å sette en cut-off for patologisk forhøyet konsentrasjon av NO, må enkeltstående, individuelle måleresultater tolkes med forbehold. Foreløpig er det ikke tilrådelig å angi øvre grenseverdier for ekspirert NO for å skille en 10 allergi i prakxsis 4/2009
positiv fra en negativ test. I enda større grad enn for andre lungefunksjonstester må derfor endringer i individuelle seriemålinger tillegges større vekt enn enkeltstående målinger. Nivået av ekspirert NO påvirkes i større eller mindre grad av ytre faktorer som respirasjonsmønster, vanndamp, røyking, alkohol, matinntak, hormonelle svingninger og antiinflammatoriske medikamenter. Noen av disse faktorene kan det kontrolleres for ved å standardisere målebetingelsene, mens andre må tas med som usikkerhetsfaktorer i fortolkningen av måleresultatene. Fordi økt produksjon av NO er uttrykk for en inflammasjonsprosess i luftveiene, kan høye NO-verdier påvises også hos personer med andre inflammatoriske luftveissykdommer enn astma. Hos ellers friske personer med virale luftveisinfeksjoner er ekspirert NO kraftig økt tre dager etter symptomdebut, men tilbake til normalnivå tre uker senere (32). Metoden har begrenset nytte hos en stor andel voksne astmatikere fordi den er relativt verdiløs hos røykere. Spesielt innen arbeidsmedisin representerer dette en vesentlig begrensning ettersom andelen røykere fortsatt er høy blant industriarbeidere inkludert i industrier der risiko for utvikling av yrkesastma er høy. NO-analysatorene er fortsatt dyre. Stasjonære NO-apparater koster omkring NOK 200 000, mens de små, håndholdte apparatene koster omkring NOK 40 000. De siste har begrenset brukstid. Kalibreringsgassen er også dyr og den må spesialbestilles. Konklusjon NO i utåndingsluft reflekterer luftveisinflammasjon og sykdomsaktivitet ved astma. Måling av NO kan derfor være et nyttig redskap i diagnostikk av astma og monitorering av astmabehandling. Nytten av NO-målinger er undersøkt når det gjelder diagnostikk av astma, predikering av astmaeksaserbasjoner og monitorering av medikamentell astmabehandling. Noen studier indikerer at NO er et nyttig verktøy i disse settingene, men mange spørsmål gjenstår og metodens endelige plass er ikke avklart. Sannsynligvis vil metoden vise seg å være mest nyttig i oppfølgingen av enkeltpasienter med seriemålinger, og sannsynligvis vil det hovedsakelig være blant spesielle subgrupper av pasienter at metoden vil ha en plass. I tillegg til stasjonære NO-apparater er det i senere år utviklet små håndholdte analysatorer som kan være velegnet til bruk i feltstudier og epidemiologiske undersøkelser. Referanser 1. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43: 109 41. 2. Palmer RMJ, Ferridge AG, Moncada S. Nitrix oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987; 327: 524 6. 3. Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 9265 9. 4. Palmer RMJ, Rees DD, Ashton DS, Moncada S. L-arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium-dependent relaxation. Biochem Biophys Res Commun 1988; 153: 1251 6. 5. Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS. The biology of nitric oxides in the airways. Am J Respir Crit Care Med 1994; 149: 538 51. 6. Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogeneous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea-pigs and humans. Biochem Bio-phys Res Commun 1991; 181: 852 7. 7. Borland C, Cox Y, Higenbottam T. Measurement of exhaled nitric oxide in man. Thorax 1993; 48: 1160 2. 8. Kharitonov SA, Barnes PJ. Clinical aspects of exhaled nitric oxide. Eur Respir J 2000;16: 781 92. 9. Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled markers of pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2001;163:1693 722. 10. Belvisi M, Barnes PJ, Larkin S, Yacoub M, Tadjkarimi S, Williams TJ et al. Nitric oxide synthase activity is elevated in inflammatory lung disease in humans. Eur J Pharmacol 1995; 283: 255 8. 11. Hamid Q, Springall DR, Riveros-Moreno V, Chanez P, Howarth P, Redington A et al. Induction of nitric oxide synthase in asthma. Lancet 1993; 342: 1510 3. 12. Lundberg JON, Weitzberg E, Lundberg JM, Alving K. Nitric oxide in exhaled air. Eur Respir J 1996; 9: 2671 80. 13. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 2005;171: 912 930 allergi i prakxsis 4/2009 11
14. Lane C, Knight D, Burgess S et al. Epithelial inducible nitric oxide synthase activity is the major determinant of nitric oxide concentration in exhaled breath. Thorax 2004; 59: 757 60. 15. Guo FH, Comhair SA, Zheng S et al. Molecular mechanisms of increased nitric oxide (NO) synthase in asthma: evidence for transcriptional and posttranslational regulation of NO synthesis. J Immunol 2000; 164: 5970 80. 16. Dupont LJ, Rochette F, Demedts MG, Verleden GM. Exhaled nitric oxide correlates with airway hyperresponsiveness in steroid-naive patients with mild asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 894 8. 17. Henriksen AH, Lingaas-Holmen T, Sue-Chu M, Bjermer L. Combined use of nitric oxide and airway hyperresponsiveness in characterizing asthma in a large population survey. Eur Respir J 2000;15: 849 55. 18. Crater SE, Peters EJ, Martin ML, Murphy AW, Platts-Mills TA. Expired nitric oxide and airway obstruction in asthma patients with an acute exacerbation. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159: 806 11. 19. Jatakanon A, Lim S, Kharitonov SA et al. Correlation between exhaled nitric oxide, sputum eosinophils, and methacholine responsiveness in patients with mild asthma.thorax 1998; 53:91 5. 20. van den Thoorn LM, Overbeek SE, de Jongste JC, Leman K, Hoogsteden HC, Prins JB. Airway inflammation is present during clinical remission of atopic asthma. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164: 2107 13. 21. Lund MB, Kongerud J, Nystad W, Boe J, Harris JR. Genetic and environmental effects on exhaled nitric oxide and airway responsiveness in a population-based sample of twins. Eur Respir J 2007; 29: 1 7. 22. Olin AC, Bake B, Toren K. Fraction of exhaled nitric oxide at 50 ml/s: reference values for adult lifelong never-smokers. Chest 2007;131: 1852 6. 23. Olivieri M, Talamini G, Corradi M, Perbellini L, Mutti A, Tantucci C, Malerba M. Reference value for exhaled nitric oxide (reveno) study. Respir Res 2006: 7:94. 24. Dupont LJ, Demedts MG, Verleden GM. Prospective evaluation of the validity of exhaled nitric oxide for the diagnosis of asthma. Chest 2003;123. 751 6. 25. Harkins MS, Fiato KL, Iwamoto GK. Exhaled nitric oxide predicts asthma exacerbations. J Asthma 2004; 41: 471 6. 26. Shaw DE, Berry MA, Thomas M, Green RH, Brightling CE, Wardlaw AJ, Pavord ID. The use of exhaled nitric oxide to guide asthma management: a randomized controlled trial. Am J Respir Crit Care Med 2007; 176: 231 7. 27. Jones SL, Kittelson J, Cowan JO, et al. The predictive value of exhaled nitric oxide measurements in assessing changes in asthma control. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164: 738 43. 28. Michils A, Louis R, Peche R et al. Exhaled nitric oxide as a marker of asthma control in smoking patients. Eur Respir J 2009; 33: 1295 1301. 29. Smith AD, Cowan JO, Brassett KP, Herbison GP, Taylor DR. Use of exhaled nitric oxide measurements to guide treatment in chronic asthma. N Engl J Med 2005; 352: 2163 73. 30. Szefler SJ, Mitchell H, Sorkness CA, Gergen PJ et al. Management of asthma base don exhaled nitric oxide in addition to guideline-based treatment for innercity adolescents and young adults: a randomized controlled trial. Lancet 2008; 372: 1065 72. 31. Petsky HL, Cates CJ, Li AM, Kynaston JA, Turner C, Chang AB. Tailored interventions based on exhaled nitric oxide versus clinical symptoms for asthma in children and adults. Cochrane Database Syst Rev 2008; 2: CD006340. 32. Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of normal human subjects with upper respiratory tract infections. Eur Respir J 1995; 8: 295 7. 12 allergi i prakxsis 4/2009