progresjonen av disse tumorene (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer,

Transkript

1 1 Område Foreliggende søknad vedrører K-ras-mutasjoner, polynukleotider som koder for mutante K-ras-polypeptider og fremgangsmåter for identifisering av K-rasmutasjoner. Foreliggende søknad vedrører også fremgangsmåter for diagnostisering av kreft, og fremgangsmåter og sett for å forutsi nyttigheten av anti-egfrspesifikke bindingsmidler i behandlingen av tumorer. Bakgrunn Visse anvendelser av monoklonale antistoffer i kreftterapi er avhengig av antistoffets evne til spesifikt å levere til de cytotoksiske effektorfunksjonene i de kreftrammede vevene slik som immunforsterkende isotyper, toksiner eller legemidler. En alternativ tilnærming er å benytte monoklonale antistoffer for direkte å påvirke overlevelsen av tumorceller ved å hindre dem å motta essensielle, ekstracellulære proliferasjonssignaler, slik som de som medieres ved vekstfaktorer via deres cellereseptorer. Ett av de attraktive målene i denne tilnærmingen er epidermalvekstfaktorreseptoren (EGFr) som binder EGF og transformerende vekstfaktor-α (TGFα) (se for eksempel Ullrich et al., Cell 61:3-212, 1990, Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-14, 1994, Mendelsohn et al., Biology Therapy of Cancer , Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 199, Fan et al., Curr. Opin. Oncol. :67-73, 1998). Binding av EGF eller TGFα til EGFr, som er et transmembran-celleoverflateglykoprotein, utløser en kaskade av cellulære, biokjemiske hendelser, inkludert EGFr-autofosforylering og internalisering, som kulminerer i celleproliferasjon (se for eksempel Ullrich et al., Cell 61:3-212, 1990). Flere observasjoner impliserer EGFr i understøttelse av utvikling og progresjon av humane, faste tumorer. EGFr har blitt vist å bli overuttrykt i mange typer humane, faste tumorer (se for eksempel Mendelsohn, Cancer Cells 7:39 (1989), Mendelsohn CancerBiology 1: (1990), Modjathedi og Dean Int l J. Oncology 4: (1994)). EGFr-overuttrykking har for eksempel blitt observert i visse lunge-, bryst-, kolon-, mage-, hjerne-, blære-, hode og nakke-, ovarie- og prostatakarsinomer (se for eksempel Motjahedi og Dean Int l J. Oncology 4: (1994)). Økningen i reseptornivåer har blitt rapportert å være assosiert med en dårlig klinisk prognose (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-14, 1994, Mendelsohn et al., Biology Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Modjtahedi et al., Intl. J. of Oncology 4: , 1994, Gullick, Br. Medical Bulletin, 47:87-98, 1991, Salomon et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: , 199). Både epidermalvekstfaktor (EGF) og transformerende vekstfaktor-alfa (TGFα) har blitt vist å binde til EGF-r og føre til cellulær proliferasjon og tumorvekst. I mange tilfeller ble økt overflate-egfr-uttrykking fulgt av produksjon av TGFα eller EGF ved tumorceller, noe som tyder på involveringen av en autokrin vekstkontroll i

2 2 progresjonen av disse tumorene (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-14, 1994, Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 199, Modjtahedi et al., Intl. J. Oncology 4: , 1994, Salomon et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: , 199) Visse grupper har slik foreslått at antistoffer mot EGF, TGF-α og EGF-r kan være nyttige i terapien av tumorer som uttrykker eller overuttrykker EGF-r (se for eksempel Mendelsohn Cancer Cells, 7:39 (1989), Mendelsohn, Cancer Biology 1: (1990), Modjtahedi og Dean Int l J. Oncology 4: (1994), Tosi et al., Int l J. Cancer 62: (199)). Faktisk har det blitt vist at anti-egf-rantistoffer som blokkerer EGF- og TGF-α-binding til reseptoren ser ut til å inhibere tumorcelleproliferasjon. Samtidig har likevel ikke anti-egf-r-antistoffer sett ut til å inhibere EGF- og TGF-α-uavhengig cellevekst (Modjtahedi og Dean Int l J. Oncology 4: (1994)). Monoklonale antistoffer som er spesifikke mot human EGFr, som er i stand til å nøytralisere EGF- og TGFα-binding til tumorceller og inhibere ligandmediert celleproliferasjon in vitro, har blitt generert fra mus og rotter (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Fan et al., Curr. Opin. Oncol. :67-73, 1998, Modjtahedi et al., Int. J. Oncology 4: , 1994). Noen av disse antistoffene, slik som muse-8, 22 (se for eksempel Aboud- Pirak et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: , 1988) og 28 (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-14, 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer s , Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 199) eller rotte- ICR16, ICR62 og ICR64 (se f.eks. Modjtahedi et al., Int. J. Oncology 4: , 1994, Modjtahedin et al., Br. J. Cncer 67:247-23, 1993, Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993) monoklonale antistoffer, ble evaluert omfattende for deres evne til å påvirke tumorvekst i xenograft-musemodeller. De fleste av de monoklonale anti-egf-r-antistoffene var virkningsfulle i forebygging av tumordannelse i atymiske mus når de ble administrert sammen med de humane tumorcellene (Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64:127-14, 1994, Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993). Når de ble injisert inn i mus som bar på etablerte, humane tumorxenografter så forårsaket de monoklonale muse-antistoffene 22 og 28 delvis tumorregresjon og krevde samtidig administrering med kjemoterapeutiske midler, slik som doksorubicin eller cisplatin, for utryddelse av tumorene (Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Fan et al., Cancer Res. 3: , 1993, Baselga et al., J. Natl. Cncer Inst. 8: , 1993). En kimær versjon av det monoklonale 22-antistoffet (C22), der museantistoffvariabelregionene er koblet til humane konstantregioner, oppviste en forbedret in vivo-antitumoraktivitet men kun ved høye doser (se f.eks. Goldstein et al., Clinical Cancer Res. 1: , 199, Prewett et al., J. Immunother.

3 Emphasis Tumor Immunol. 19: , 1996). Rotte-antistoffene ICR16, ICR62 og ICR64 forårsaket regresjon av etablerte tumorer men ikke deres fullstendig utryddelse (Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993). Disse resultatene etablerte EGFr som et lovende mål for antistoffterapi mot EGFr-uttrykkende, faste tumorer og førte til humane, kliniske utprøvinger med det monoklonale antistoffet C22 i flere humane faste tumorer (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Fan et al., Curr. Opin. Oncol. :67-73, 1998, Modjtahedin et al., Int. J. Oncology 4: , 1994). Noen av disse antistoffene, slik som de monoklonale muse-antistoffene 8, 22 (se for eksempel Aboud-Pirak et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: , 1998) og 28 (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199) eller de monoklonale rotteantistoffene ICR16, ICR62 og ICR64 (se f.eks. Modjtahedi et al., Int. J. Oncology 4: , 1994, Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:247-23, 1993, Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993) ble evaluert omfattende for deres evne til å påvirke tumorvekst i xenograftmusemodeller. De fleste av de monoklonale anti-egfr-antistoffene var virkningsfulle i forebygging av tumordannelse i atymiske mus når de ble administrert sammen med de humane tumorcellene (Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Modjtahedin et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993). Når de ble injisert inn i mus som bar etablerte humane tumorxenografter forårsaket de monoklonale muse-antistoffene 22 og 28 delvis tumorregresjon og krevde den samtidige administreringen med kjemoterapeutiske midler slik som doxorubicin eller cisplatin for utryddelse av tumorene (Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Fan et al., Cancer Res. 3: , 1993, Baselga et al., J. Natl. Cncer Inst. 8: , 1993). En kimær versjon av det monoklonale 22-antistoffet (C22), der museantistoff-variabelregionene er koblet til humane konstantregioner, oppviste en forbedret in vivo-antitumoraktivitet, men kun ved høye doser (se for eksempel Goldstein et al., Clinical Cancer Res. 1: , 199, Prewett et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: , 1996). Rotteantistoffene ICR16, ICR62 og ICR64 forårsaket regresjon av etablerte tumorer men ikke deres fullstendige utryddelse (Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 67:24-261, 1993). Disse resultatene etablerte EGFr som et lovende mål for antistoffterapi mot EGFr-uttrykkende, faste tumorer og førte til humane kliniske utprøvinger med det monoklonale C22-antitstoffet i flere humane, faste kreftformer (se for eksempel Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: , 1994, Mendelsohn et al., i Biologic Therapy of Cancer, s , Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 199, Modjtahedi et al., Int. J. Oncology 4: , 1994).

4 Visse fremskritt på de biologiske fagområdene gjorde det mulig å produsere et fullt humant anti-egfr-antistoff. Ved å benytte mus som er transgene for humane immunoglobulingener (Xenomouse technology, Abgenix, Inc.) ble humane antistoffer spesifikke for human EGFr utviklet (se for eksempel Mendez, Nature Genetics, 1:146-16, 1997, Jakobovitz, Adv. Drug Deliv. Rev., 31(1-2):33-42, 1988, Jakobovits, Expert Opin. Invest Drugs, 7(4): , 1998, Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1):17-23, 01, WO 98/24839, WO 98/0433). Ett slikt antistoff, panitumumab, som er et monoklonalt, humant IgG2-antistoff med en affinitet på x -11 M for human EGFr, har blitt vist å blokkere binding av EGF til EGFr, for å blokkere reseptorsignalisering, og for å inhibere tumorcelleaktivering og proliferasjon in vitro (se for eksempel WO 98/0433, DU patent nr. 6,23,883). Studier i atymiske mus har vist at panitumumab også har in vivo-aktivitet, som ikke bare forhindrer dannelsen av humant epidermoid karsinom A431-xenografter i atymiske mus, men som også utrydder allerede etablerte, store A431- tumorxenografter (se for eksempel Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol., 38(1):17-23, 01, Yang et al., Cancer Res. 9(6): , 1999). Panitumumab har blitt vurdert for behandlingen av nyrekarsinom, kolorektalt adenokarsinom, prostatakreft og ikke-småcellet skvamøst lungekarsinom, blant andre kreftformer (se for eksempel US patentpublikasjon nr. 04/003343), og kliniske utprøvinger er på vei med dette antistoffet. Panitumumab har blitt godkjent av the Food & Drug Administration til behandling av pasienter med metastatisk kolorektalkreft. Aktivering av EGFr utløser minst to signaliseringsveier. I visse celletyper forhindrer aktivering av EGFr apoptose ved stimulering av fosfatidylinositol-3- kinase («PI3K»). PI3K-aktivering utløser en molekylær kaskade som fører til nedreguleringen av de sentrale veiene som kontrollerer programmert celledød (Yao, R., Science 267:03-06, 199). I visse celletyper setter aktivering av EGFr i gang MAPK-kaskaden via Ras/raf. Eberhardt et al., (Journal of Clinical Oncology 0, vol.23(2), s ) rapporterer at mutasjoner i K-ras-kodon 12 og 13 er assosiert med signifikant redusert tid til progresjon og overlevelse hos pasienter som lider av ikke-småcellet lungekreft og som mottar EGFR-kinaseinhibitoren erlotinib i kombinasjon med kjemoterapi, sammenlignet med pasienter som kun får kjemoterapi. Pao et al. (Plos Medicine 0, vol. 2(1), s ) rapporterer dårlig respons hos pasienter med lunge-adenokarsinom som bærer visse mutasjoner i K-ras-kodon 12 og 13 ved behandling med EGFR-kinaseinhibitorene erloitinib eller gefitinib. Liévre et al. (Cancer Reasearch 06, vol.66, s ) beskriver at pasienter med kolorektalkreft som har visse mutasjoner i K-ras-kodon 12 og 13 vil respondere dårlig på behandling med anti-egfr-antistoffet cetuximab. WO 07/ krever en fremgangsmåte for identifisering av en pasient som er ikke-responderende på behandling med en EGFR-inhibitor, for eksempel

5 panitumumab, omfattende bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet av en K- ras-mutasjon og en EGFR, hvorved tilstedeværelsen av både en K-ras-mutasjon og en EGFR indikerer at en pasient ikke vil respondere på nevnte inhibitorbehandling. 1 2 Oppsummering Foreliggende oppfinnelse er definert ved kravene. I én utførelsesform blir en fremgangsmåte for å forutsi hvorvidt en pasient som lider av kolorektalkreft vil være ikke-responderende på behandling med panitumumab tilveiebrakt, omfattende bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet av en K-rasmutasjon i en tumor hos nevnte pasient, der K-ras-mutasjonen er valgt fra G12S, G12V, G12D, G12A, G12C og G13D, og der det er slik at dersom en K-rasmutasjon er til stede så kan pasienten forutsies å være ikke-responderede på behandling med panitumumab. I en annen utførelsesform blir en fremgangsmåte for å forutsi hvorvidt en tumor fra kolorektalkreft vil være ikke-responderende på behandling med panitumumab tilveiebrakt, omfattende bestemmelse av fraværet eller tilstedeværelsen av en K-rasmutasjon i en prøve av nevnte tumor, der K-ras-mutasjonen er valgt fra G12S, G12V, G12D, G12A, G12C og G13D, og der tilstedeværelsen av K-ras-mutasjonen indikerer at tumoren vil være ikke-responderende på behandling med panitumumab. Kort beskrivelse av figurene Figurene 1A til 1I viser cdna- og aminosyresekvensene for villtype-k-ras (SEQ ID NO: 1 og 2), G12S-mutant-K-ras (SEQ ID NO:3 og 4), G12V-mutant-K-ras (SEQ ID NO: og 6), G12D-mutant-K-ras (SEQ ID NO: 7 og 8), G12A-mutant-K-ras (SEQ ID NO: 9 og ), G12C-mutant-K-ras (SEQ ID NO: 11 og 12), G13A-mutant- K-ras (SEQ ID NO: 13 og 14), G13D-mutant-K-ras (SEQ ID NO: 1 og 16) og TM-mutant-K-ras (SEQ ID NO: 17 og 18). Detaljert beskrivelse av visse utførelsesformer 3 Definisjoner Dersom ikke annet er definert så skal vitenskapelige og tekniske uttrykk som benyttes i sammenheng med foreliggende oppfinnelse ha betydningene som vanligvis tillegges dem av fagfolk på området. Dersom det ikke på annen måte er påkrevd i konteksten skal videre singulære uttrykk inkludere flertallsformene og flertallsformer skal inkludere den singulære. Nomenklatur som benyttes i sammenheng med, og teknikker med, celle- og vevskultur, molekylærbiologi og protein- og oligo- eller poynukleotidkjemi og

6 hybridisering som beskrives her er generelt de som er velkjente på fagområdet. Standardteknikker blir benyttet for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese, og vevskultur og transformasjon (for eksempel elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker blir utført i overensstemmelse med produsentens spesifikasjoner eller slik det vanligvis blir utført på fagområdet eller som beskrevet her. De foregående teknikkene og prosedyrene blir generelt utført i overensstemmelse med konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet og slik som beskrevet i ulike generelle og mer spesifikke referanser som er referert og diskutert gjennom foreliggende beskrivelse. Se for eksempel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.utgave, Cols Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)). Nomenklaturen som benyttes i sammenheng med, og laboratorieprosedyrene og teknikkene for, analytisk kjemi, organisk syntesekjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi som beskrives her er de som er velkjente og som vanligvis benyttes på fagområdet. Standardteknikker blir benyttet i kjemisk syntese, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og levering, og behandling av pasienter. I denne søknaden betyr anvendelsen av «eller» også «og/eller» dersom ikke annet er spesifisert. I konteksten av flere avhengige krav refererer anvendelsen av «eller» tilbake til mer enn ett foregående, uavhengig eller avhengig krav i kun alternativet. Videre er ikke anvendelsen av uttrykket «inkludert», i tillegg til andre former slik som «inkluderer» begrensende. Uttrykk slik som «element» eller «komponent» omfatter også både elementer og komponenter som omfatter én enhet og elementer og komponenter som omfatter mer enn én subenhet dersom ikke annet spesifikt er beskrevet. Som benyttet i overensstemmelse med foreliggende beskrivelse skal de følgende uttrykkene, dersom ikke annet er indikert, være forstått å ha den følgende betydningen: Uttrykket «isolert polynukleotid» og «isolert nukleinsyre» blir benyttet om hverandre, og skal slik de benyttes her bety et polynukleotid av genomisk opphav, cdna-opphav eller syntetisk opphav eller en eller annen kombinasjon derav, som i kraft av sitt opphav (1) ikke er assosiert med hele eller en del av et polynukleotid der det «isolerte polynukleotidet» er funnet i naturen (2) er opererbart koblet til et polynukleotid som det ikke er koblet til i naturen eller (3) ikke opptrer i naturen som en del av en større sekvens. Uttrykkene «isolert protein» og «isolert polypeptid» blir benyttet om hverandre, og betyr slik de refereres til her et protein med opphav fra cdna eller rekombinant RNA eller med syntetisk opphav, eller en eller annen kombinasjon derav, som i kraft av sitt opphav, eller kilde for utledning, (1) ikke er assosiert med proteiner funnet i naturen, (2) er fri for andre proteiner fra den samme kilden, for eksempel

7 7 fri for murine proteiner, (3) blir uttrykt av en celle fra en annen art eller (4) forekommer ikke i naturen Uttrykkene «polypeptid» og «protein» blir benyttet om hverandre og blir her benyttet som et generelt uttrykk for å referere til nativt protein, fragmenter, peptider eller analoger av en polypeptidsekvens. Dermed er nativt protein, fragmenter og analoger enheter av polypeptidslekten. Terminologien «X#Y» i konteksten av en mutasjon i en polypeptidsekvens er anerkjent på fagområdet, der «#» indikerer lokaliseringen av en mutasjon i kraft av aminosyrenummeret i polypeptidet, «X» indikerer aminosyren funnet på denne posisjonen i villtype-aminosyresekvensen, og «Y» indikerer den muterte aminosyren på denne posisjonen. Betegnelsen «G12S» med referanse til K-raspolypeptidet indikerer for eksempel at det eksisterer et glysin på aminosyrenummer 12 i villtype-k-rassekvensen, og at glysin er erstattet med en serin i den muterte K- ras-sekvensen. Uttrykket «mutant K-ras-polypeptid» og «mutant K-ras-protein» blir benyttet om hverandre og refererer til et K-ras-polypeptid som omfatter minst én K-ras-mutasjon valgt fra G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A, G13D og TM. Visse eksempler på mutante K-ras-polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, allelvarianter, spleisevarianter, derivatvarianter, substitusjonsvarianter, delesjonsvarianter og/eller innskuddsvarianter, fusjonspolypeptider, ortologer og interarts-homologer. I visse utførelsesformer inkluderer et mutant K-ras-polypeptid ytterligere rester på C- eller N-terminalen, slik som, men ikke begrenset til, ledersekvensrester, målsøkende rester, aminoterminale metioninrester, lysinrester, tag-rester og/eller fusjonsproteinrester. Uttrykket «naturlig forekommende» blir slik det benyttes her brukt på et objekt som refererer til det faktumet at et objekt kan bli funnet i naturen. En polypeptid- eller polynukleotidsekvens som er til stede i en organisme (inkludert virus) som kan bli isolert fra en kilde i naturen og som ikke med vilje har blitt modifisert av mennesker i laboratoriet eller på annen måte er for eksempel naturlig forekommende. Uttrykket «opererbart koblet» refererer slik det blir benyttet her til posisjoneringen av komponenter slik at de foreligger i et forhold som tillater dem å virke på deres tilsiktede måte. En kontrollsekvens som er «opererbart koblet» til en kodende sekvens er ligert på en slik måte at uttrykking av den kodende sekvensen blir oppnådd ved betingelser som er kompatible med kontrollsekvensen. Uttrykket «kontrollsekvens» refererer slik det blir benyttet her til polynukleotidsekvenser som er nødvendige for å få til uttrykkingen og prosesseringen av kodende sekvenser som de er ligert til. Karakteren til slike kontrollsekvenser er forskjellige avhengig av vertsorganismen, og i prokaryotes inkluderer slike kontrollsekvenser generelt promoter-, ribosomalt bindingssete- og

8 transkripsjonstermineringssekvenser, i eukaryoter inkluderer slike kontrollsekvenser generelt promoter- og transkripsjonstermineringssekvenser. Uttrykket «kontrollsekvenser» er ment å skulle inkludere, som et minimum, alle komponenter hvis tilstedeværelse er essensiell for uttrykking og prosessering, og kan også inkludere ytterligere komponenter hvis tilstedeværelse er fordelaktig, for eksempel ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser. Som referert til her betyr uttrykket «polynukleotid» en polymer form av nukleotider med en lengde på minst baser, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av disse typene av nukleotid. Uttrykket inkluderer enkeltog dobbelttrådede former av DNA. Uttrykket «oligonukleotid» inkluderer slik det refereres til her naturlig forekommende og modifiserte nukleotider koblet sammen ved naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende oligonukleotidkoblinger. Oligonukleotider er en polynukleotidundergruppe som generelt omfatter en lengde på 0 eller færre baser. Fortrinnsvis har oligonukleotider en lengde på til 60 baser og mest foretrukket har de en lengde på 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19 eller til 40 baser. Oligonukleotider er vanligvis enkelttrådede, for eksempel for prober, selv om oligonukleotider kan være dobbelttrådede, for eksempel til anvendelse ved konstruering av en gen-mutant. Oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan være enten sens- eller antisens-oligonukleotider. Uttrykkene «mutant K-ras-polynukleotid», «mutant K-ras-oligonukleotid» og «mutant K-ras-nukleinsyre» blir benyttet om hverandre, og referer til et polynukleotid som koder for et K-ras-polypeptid som omfatter minst én K-rasmutasjon som er valgt fra G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A, G13D og TM. Uttrykket «naturlig forekommende nukleotider» inkluderer slik det refereres til her deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Uttrykket «modifiserte nukleotider» referert til her inkluderer nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og liknende. Uttrykket «oligonukleotidkoblinger» inkluderer slik det refereres her til oligonukleotidkoblinger slik som fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforoaniladat, fosforamidat og liknende. Se for eksempel LaPlanche et al., Nucl. Acid. Res. 14:9081 (1986), Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 6:6077 (1984), Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:39 (1988), Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:39 (1991), Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, s.87-8 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991)), Stec et al., US patent nr.,11,, Uhlmann og Peyman, Chemical Review 90:43 (1990). Et oligonukleotid kan inkludere et merke for detektering dersom det er ønskelig. Uttrykket «hybridiserer selektivt» betyr slik det refereres her å binde spesifikt og påvisbart. Polynukleotider, oligonukleotider og fragmenter derav hybridiserer

9 selektivt til nukleinsyretråder under hybridiserings- og vaskebetingelser som minimerer merkbare mengder påvisbar binding til ikke-spesifikke nukleinsyrer. Høyt stringente betingelser kan bli benyttet for å oppnå selektive hybridiseringsbetingelser slik dette er kjent på fagområdet og diskutert her. Generelt vil nukleinsyresekvenshomologien mellom polynukleotider, oligonukleotider og fragmenter og en nukleinsyre av interesse være minst 80 %, og mer typisk med fortrinnsvis økende homologier på minst 8 %, 90 %, 9 %, 96 %, 07 %, 98 %, 99 % og 0 %. To aminosyresekvenser er homologe dersom det er en delvis eller fullstendig identitet mellom deres sekvenser. For eksempel betyr 8 % homologi at 8 % av aminosyrene er identiske når de to sekvensene blir sammenstilt for maksimal matching. Tomrom (i enhver av de to sekvensene som blir matchet) er tillatt for å maksimere matching, tomromlengder på eller færre er foretrukket der 2 eller færre er foretrukket. Alternativt og foretrukket er to proteinsekvenser (eller polypeptidsekvenser avledet fra dem på minst aminosyrer i lengde) homologe, slik dette uttrykket benyttes her, dersom de har en sammenstillingsscoringsverdi på mer enn (i standardavviksenheter) ved å benytte programmet ALIGN med mutasjonsdatamatriksen og tomromsstraffen på 6 eller høyere. Se Dayhoff, M.O., i Atlas of Protein Sequence and Structure, s.1-1 (Volum, National Biomedical Research Foundation (1972)) og supplement 2 til denne utgaven, s.1-. De to sekvensene eller deler derav er mer foretrukket homologe dersom deres aminosyrer er mer eller likt med 0 % identiske når de er optimalt sammenstilt ved å benytte ALIGN-programmet. Uttrykket «tilsvarer» blir her benyttet for å bety at en polynukleotidsekvens er homolog (dvs., er identisk, ikke kun evolusjonært beslektet) med hele eller n del av en referanse-polynukleotidsekvens, eller at en polypeptidsekvens er identisk med en referanse-polypeptidsekvens. I motsetning til dette blir uttrykket «komplementær med» her benyttet for å bety at den komplementære sekvensen er homolog med hele eller en del av en referansepolynukleotidsekvens. Som illustrasjon tilsvarer nukleotidsekvensen «TATAC» en referanse-sekvens «TATAC» og er komplementær med en referanse-sekvens «GTATA». De følgende uttrykkene blir benyttet for å beskrive sekvenssammenhengen mellom to eller flere polynukleotid- eller aminosyresekvenser: «referansesekvens», «sammenligningsvindu», «sekvensidentitet», «prosentvis sekvensidentitet» og «vesentlig identitet». En «referanse-sekvens» er en definert sekvens som benyttes som grunnlag for en sekvenssammenligning, en referansesekvens kan være en del av en større sekvens, for eksempel et segment av en fullengde-cdna-sekvens eller gensekvens gitt i en sekvensliste eller kan omfatte en fullstendig cdna- eller gensekvens. Generelt er en referansesekvens minst 18 nukleotider eller 6 aminosyrer lang, eller minst 24 nukleotider eller 8 aminosyrer lang, eller minst 48 nukleotider eller 16 aminosyrer lang. Fordi to polynukleotider eller aminosyresekvenser hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs., en del av det

10 fullstendige polynukleotid- eller aminosyresekvensen) som er lik mellom de to molekylene, og (2) ytterligere kan omfatte en sekvens som er fravikende mellom de to polynukleotid- eller aminosyresekvensene, så blir sekvenssammenligninger mellom to (eller flere) molekyler typisk utført ved å sammenligne sekvenser for de to molekylene over et «sammenligningsvindu» for å identifisere og sammenligne lokale regioner med sekvenslikhet. Et «sammenligningsvindu» refererer slik det benyttes her til en konseptuelt segment på minst 18 kontinuerlige nukleotidposisjoner eller 6 aminosyrer der en polynukleotidsekvens eller aminosyresekvens kan bli sammenlignet med en referansesekvens på minst 18 kontinuerlige nukleotider eller 6 aminosyresekvenser og der delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner, delesjoner, substitusjoner og liknende (dvs., tomrom) på prosent eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal sammenstilling av de to sekvensene. Optimal sammenstilling av sekvenser for oppstilling i et sammenligningsvindu kan bli utført ved hjelp av den lokale homologialgoritmen til Smith og Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), ved homologi-sammenstillingsalgoritmen til Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), ved søk etter likhets-fremgangsmåten til Pearson og Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8:2444 (1988), ved datamaskinimplementeringer av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 7 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks eller MacVector-programvarepakkene) eller ved inspeksjon, og den beste sammenstillingen (dvs., som fører til den høyeste prosentandelen homologi over sammenligningsvinduet) som genereres av de ulike fremgangsmåtene blir valgt. Uttrykket «sekvensidentitet» betyr at to polynukleotid- eller aminosyresekvenser er identiske (dvs., på en nukleotid-for-nukleotid bais eller rest-for-rest basis) over sammenligningsvinduet. Uttrykket «prosentvis sekvensidentitet» blir beregnet ved å sammenligne to optimalt sammenstilte sekvenser over sammenligningsvinduet, bestemme antallet posisjoner der den identiske nukleinsyrebasen (for eksempel A, T, C, G, U eller I) eller rest forekommer på begge sekvensene for å gi antallet matchede posisjoner, dele antallet matchede posisjoner på det totale antallet posisjoner i sammenligningsvinduet (dvs., vindustørrelsen) og multiplisere resultatet med 0 for å gi prosentandelen av sekvensidentitet. Uttrykket «vesentlig identitet» betegner slik det benyttes her en egenskap for en polynukleotid- eller aminosyresekvens, der polynukleotidet eller aminosyren omfatter en sekvens som har minst 8 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 til 9 prosent sekvensidentitet, mer vanlig minst 96, 97, 98 eller 99 prosent sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens over et sammenligningsvindu på minst 18 nukleotid- (6 aminosyrer) posisjoner, ofte over et vindu på minst nukleotid- (8-16 aminosyrer) posisjoner, der prosentandelen av sekvensidentitet er beregnet

11 11 ved å sammenligne referansesekvensen med sekvensen som kan inkluderer delesjoner eller addisjoner som totalt utgjør prosent eller mindre av referansesekvensen over sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være en del av en større sekvens Som benyttet her følger de tjue konvensjonelle aminosyrene og deres forkortelser den konvensjonelle anvendelsen. Se Immunology A Synthesis (2.utgave, E.S. Golub og D.R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Uttrykket «aminosyre» eller «aminosyrerest» refererer slik de benyttes her til naturlig forekommende L- eller D-aminosyrer. De vanlig benyttede forkortelsene på én eller tre bokstaver for aminosyrene blir benyttet her (Buce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (4.utgave, 02). Stereoisomerer (for eksempel D-aminosyrer) av de tjue konvensjonelle aminosyrene, ikke-naturlige aminosyrer slik som α-,α-disubstituerte aminosyrer, N- alkyl-aminosyrer, melkesyre og andre ikke-konvensjonelle aminosyrer kan også være passende komponenter for polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ikke-konvensjonelle aminosyrer inkluderer: 4-hydroksyprolin, γ- karboksyglutamat, ε-n,n,n-trimetyllysin, ε-n-acetyllysin, O-fosfoserin, N- acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, -hydroksylysin, σ-n-metylarginin og andre liknende aminosyrer og iminosyrer (for eksempel 4-hydroksyprolin). I polypeptidbetegnelsen som benyttes her er venstrehåndsretningen den aminoterminale retningen og høyrehåndsretningen er den karboksyterminale retningen, i overensstemmelse med standard anvendelse og konvensjon. Dersom ikke noe annet er spesifisert så er likeledes den venstre enden av enkelttrådede polynukleotidsekvenser den enden, den venstre retningen av dobbelttrådede polynukleotidsekvenser blir referert til som den retningen. Retningen av til 3 addisjon av nakne RNA-transkripter blir referert til som transkripsjonsretningen. Sekvensregioner på DNA-tråden som har den samme sekvensen som RNA et og som ligger i forhold til den enden av RNAtranskriptet blir referert til som «oppstrømssekvenser». Sekvensregioner på DNAtråden som har den samme sekvensen som RNA et og som ligger 3 for den 3 enden av RNA-transkriptet blir referert til som «nedstrømssekvenser». Slik det benyttes på polypeptider betyr uttrykket «vesentlig identitet» at to peptidsekvenser, når de er optimalt sammenstilt, slik som med programmene GAP og BESTFIT ved å benytte standard tomromsvekting, deler minst 80 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 prosent sekvensidentitet, mer foretrukket minst 9, 96, 97 eller 98 prosent sekvensidentitet, og mest foretrukket minst 99 prosent sekvensidentitet. Restposisjonene som ikke er identiske er fortrinnsvis forskjellige ved konservative aminosyresubstitusjoner. Som diskutert her er mindre variasjoner i aminosyresekvensene til antistoff- eller immunoglobulinmolekyler kontemplert som å være omfattet av foreliggende oppfinnelse, gitt at variasjonene i aminosyresekvensen opprettholder minst 7 %, mer foretrukket minst 80 %, 90 %,

12 % og mest foretrukket fortrinnsvis 99 %. Konservative aminosyresubstitusjoner er de som finner sted innenfor en familie med aminosyrer som er beslektet i forhold til deres sidekjeder. Genetisk kodede aminosyrer blir generelt delt i familier: (1) sure = asparaginsyre, glutaminsyre, (2) basiske = lysin, arginin, histidin, (3) ikkepolare = alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan og (4) uladde polare = glysin, asparagin, glutamin, cystein, serin, treonin, tyrosin. Mer foretrukne familier er: serin og treonin er alifatisk-hydroksy-familie, asparagin og glutamin er en amid-inneholdende familie, alanin, valin, leucin og isoleucin er en alifatisk familie, fenylalanin, tryptofan og tyrosin er en aromatisk familie, og cystein og metionin er en svovelinneholdende sidekjedefamilie. Det er for eksempel rimelig å forvente at en isolert erstatning av en leucin med en isoleucin eller valin, en aspartat med glutamat, en treonin med serin, eller en tilsvarende erstatning av en aminosyre med en strukturelt beslektet aminosyre ikke vil ha noen stor effekt på bindingen eller egenskapene til det resulterende molekylet, spesielt dersom erstatningen ikke involverer en aminosyre inne i et rammeverksområde. Foretrukne konservative aminosyresubstitusjonsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanintyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutaminsyre-asparaginsyre, cystein-metionin og asparagin-glutamin. Foretrukne aminosyresubstitusjoner er de som: (1) reduserer mottakelighet for proteolyse, (2) reduserer mottakelighet for oksidasjon, (3) endrer bindingsaffinitet for danning av proteinkomplekser, (4) endrer bindingsaffiniteter og () overfører eller modifiserer andre fysiokjemiske eller funksjonelle egenskaper for slike analoger. Analoger kan inkludere ulike muteiner av en sekvens forskjellig fra den naturlig-forekommende peptidsekvensen. For eksempel kan enkelte eller flere aminosyresubstitusjoner (fortrinnsvis konservative aminosyresubstitusjoner) bli innført i den naturlig forekommende sekvensen (fortrinnsvis i delen for polypeptidet på utsiden av domenet/domenene som danner intermolekylære kontakter. En konservativ aminosyresubstitusjon bør ikke vesentlig endre de strukturelle karakteristikaene for opphavssekvensen (for eksempel erstatningsaminosyren bør ikke ha tendens til å bryte en heliks som forekommer i opphavssekvensen, eller forstyrre andre typer av sekundærstruktur som kjennetegner opphavssekvensen). Eksempler på polypeptid-sekundærstrukturer og tertiærstrukturer som er anerkjente på fagområdet er beskrevet i Proteins, Structure and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden og Tooze, red., Garland Publishing, New York (1991)), og Thornton et al., Nature, 34: (1991). Uttrykket «analog» refererer slik det benyttes her til polypeptider som er omfattet av et segment på minst 2 aminosyrer som har vesentlig identitet med en del av en aminosyresekvens for et naturlig forekommende polypeptid og som har minst én av aktivitetene til det naturlig forekommende polypeptidet. Typiske polypeptidanaloger omfatter en konservativ aminosyresubstitusjon (eller addisjon eller delesjon) med

13 13 hensyn på den naturlig-forekommende sekvensen. Analoger er typisk minst aminosyrer lange, fortrinnsvis minst 0 aminosyrer lange eller lengre, og kan ofte være så lange som et naturlig forekommende fullengde-polypeptid Peptidanaloger blir ofte benyttet i den farmasøytiske industrien som ikke-peptidlegemidler med egenskaper som er analoge med dem for templat-peptidet. Disse typene av ikke-peptid-forbindelse blir betegnet «peptidhermere» eller «peptidohermere». Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 1:29 (1986), Veber og Freidinger TINS s.392 (198) og Evans et al., J. Med. Chem. :1229 (1987). Slike forbindelser har ofte blitt utviklet ved hjelp av molekylær datamodellering. Peptidhermere som er strukturelt like terapeutisk nyttige peptider kan bli benyttet for å produsere en ekvivalent terapeutisk eller profylaktisk effekt. Generelt er peptidhermere strukturelt like et paradigme-polypeptid (dvs., et polypeptid som har en biokjemisk egenskap eller farmakologisk aktivitet)slik som humant antistoff, med som har én eller flere peptidbindinger eventuelt erstattet med en binding som er valgt fra gruppen som består av CH 2 NH-, CH 2 S-, -CH 2 -CH 2., -CH=CH- (cis og trans), -COCH 2 -, -CH(OH)CH 2 - og CH 2 SO-, med fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Systematisk substitusjon av én eller flere aminosyrer i en konsensussekvens med en D-aminosyre av samme typen (for eksempel D-lysin i stedet for L-lysin) kan bli benyttet for å generere mer stabile peptider. I tillegg kan tvungne peptider som omfatter en konsensussekvens eller en vesentlig identisk konsensussekvensvariasjon bli generert ved fremgangsmåter som er kjent på fagområdet (Rizo og Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), for eksempel ved å addere interne cysteinrester som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbruer som sykliserer peptidet. Foretrukne amino- eller karboksyterminaler eller fragmenter eller analoger forekommer nær grenseoverganger for funksjonelle domener. Strukturelle og funksjonelle domener kan bli identifisert ved sammenligning av nukleotid- og/eller aminosyresekvensdata med allmenne eller private sekvensdatabaser. Fortrinnsvis blir datasammenligningsfremgangsmåter benyttet for å identifisere sekvensmotiver eller predikert proteinkonformasjonsdomener som forekommer i andre proteiner med kjent struktur og/eller funksjon. Fremgangsmåter for identifisering av proteinsekvenser som foldes til en kjent tredimensjonal struktur er kjente (se Bowie et al., Science 23:164 (1991)). Fagfolk på området kan gjenkjenne sekvensmotiver og strukturelle konformasjoner som kan bli benyttet for å definere strukturelle og funksjonelle domener i overensstemmelse med oppfinnelsen. Uttrykket «spesifikt bindingsmiddel» refererer til et naturlig eller ikke-naturlig molekyl som spesifikt binder et mål. Eksempler på spesifikke bindingsmidler inkluderer, men er ikke begrenset til, proteiner, peptider, nukleinsyrer, karbohydrater, lipider og småmolekylforbindelser. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel et antistoff. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel en antigenbindende region.

14 Uttrykket «spesifikt bindingsmiddel for et EGFr-polypeptid» refererer til et spesifikt bindingsmiddel som spesifikt binder enhver del av et EGFr-polypeptid. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et EGFr-polypeptid et antistoff mot et EGFr-polypeptid. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et EGFr-polypeptid en antigenbindende region. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et EGFr-polypeptid et antistoff mor EGFr. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et EGFrpolypeptid panitumumab. Uttrykket «spesifikt bindingsmiddel for et K-ras-polypeptid» refererer til et spesifikt bindingsmiddel som spesifikt binder enhver del av et mutant K-raspolypeptid. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et mutant K- ras-polypeptid et antistoff mot et mutant K-ras-polypeptid. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindingsmiddel for et mutant K-ras-polypeptid en antigenbindende region. Uttrykket «spesifikt binder» refererer til et spesifikt bindingsmiddel sin evne til å binde et mål med høyere affinitet enn det binder et ikke-mål. I visse utførelsesformer refererer spesifikk binding til binding av et mål med en affinitet som er minst, 0, 0,, 00 eller 00 ganger høyere enn affiniteten for et ikke-mål. I visse utførelsesformer bestemmes affinitet med en affinitets-elisaanalyse. I visse utførelsesformer blir affinitet bestemt med en BIAcore-analyse. I visse utførelsesformer blir affinitet bestemt med en kinetisk fremgangsmåte. I visse utførelsesformer blir affinitet bestemt med en likevekt/løsningsfremgangsmåte. I visse utførelsesformer blir et antistoff sagt å spesifikt binde et antigen når dissosiasjonskonstanten mellom antistoffet og én eller flere av dets anerkjente epitoper er 1 μm, fortrinnsvis 0 nm og mest foretrukket nm. «Native antistoffer og immunoglobuliner» er i visse tilfeller vanligvis heterotetramere glykoproteiner på omtrent 000 Dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lettkjede er koblet til en tungkjede med én kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom tungkjedene av ulike immunoglobulin-isotyper. Hver tungkjede og lettkjede har jevnt fordelte interkjede-disulfidbroer. Hver tungkjede har på én ende et variabeldomene (VH) etterfulgt av et antall konstantdomener. Hver lettkjede har et variabeldomene på én ende (VL) og et konstantdomene på sin andre ende, der konstantdomenet på lettkjeden er innrettet med det første konstantdomenet på tungkjeden, og der lettkjedevariabeldomenet er innrettet med variabeldomenet på tungkjeden. Spesifikke aminosyrer er antatt å danne en grenseflate mellom lettkjede- og tungkjedevariabeldomenene (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186:61 (198, Novotny og Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:492 (198), Chothia et al., Natyre 342: (1989)).

15 Uttrykket «antistoff» refererer til både et intakt antistoff og et antigenbindende fragment derav som konkurrerer med det intakte antistoffet for spesifikk binding. «Antigenbindende fragment derav» refererer til en del eller fragment av et intakt antistoffmolekyl, der fragmentet opprettholder den antigenbindende funksjonen. Bindingsfragmenter blir produsert ved rekombinante DNA-teknikker, eller ved enzymatisk kløyving av intakte antistoffer slik som med kløyving med papain. Bindingsfragmenter inkluderer Fab, Fab, F(ab ) 2, Fv, enkeltkjedeantistoffer («scfv»), Fd - og Fd-fragmenter. Fremgangsmåter for fremstilling av ulike fragmenter fra monoklonale antistoffer er velkjent for fagfolk på området (se for eksempel Pluckthun, 1992, Immunol. Rev. 1:11-188). Et antistoff forskjellig fra et «bispesifikt» eller «bifunksjonelt» antistoff er forstått å ha hvert av sine bindingsseter identiske. Et antistoff inhiberer vesentlig adhesjon av en reseptor til en motreseptor når et overskudd av antistoff reduserer mengden reseptor som er bundet til motreseptor med minst omtrent %, 40 %, 60 % eller 80 %, og mer vanlig mer enn omtrent 8 %, 90 %, 9 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % (som målt i en kompetitiv in vitro-bindingsanalyse). Et «isolert» antistoff er ett som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i sitt naturlige miljø. Kontaminerende komponenter i sitt naturlige miljø er materialer som kan interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av antistoffet, og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteininneholdende eller ikke-proteininneholdende løste midler. I foretrukne utførelsesformer vil antistoffet være renset (1) mer enn 9 vekt% av antistoff som bestemt ved Lowry-fremgangsmåten, og terminal eller intern aminosyresekvensering ved anvendelse av en spinning-cup sekvensator, eller (2) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å benytte Coomassie-blått eller fortrinnsvis sølvfarging. Et isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ inne i rekombinante celler fordi minst én komponent fra antistoffets naturlige miljø ikke vil være til stede. Ordinært vil likevel isolert antistoff bli klargjort med minst ett rensetrinn. Uttrykket «variabel» refererer til det faktumet at visse deler av variabeldomenene er svært forskjellige i sekvens blant antistoffer og blir benyttet i bindingen og spesifisiteten til hvert spesifikke antistoff for sitt spesifikke antigen. Likevel er ikke variabiliteten jevnt fordelt på variabeldomenene til antistoffer. Den er konsentrert i tre segmenter kalt komplementaritesbestemmende regioner (CDR) eller hypervariabelregioner både på lettkjede- og tungkjedevariabelregionene. De mer konserverte delene av variabeldomenene blir kalt rammeverket (FR). Variabeldomene på de native tunge og lette kjedene omfatter hvert fire FR-regioner, som i stor grad antar en β-flate-konfigurasjon, bundet til tre CDR er, som danner løkker som forbinder, og i noen tilfeller danner en del av, β-flatestrukturen. CDR ene i hver kjede blir holdt tett sammen av FR-regionene, og bidrar sammen med CDR ene fra den andre kjeden til dannelsen av det antigenbindende setet til

16 16 antistoffer (se Kabat et al., (1991)). Konstantdomene er ikke direkte involvert i binding av et antistoff til et antigen, men oppviser ulike effektorfunksjoner, slik som deltakelse for antistoffet i antistoffavhengig cellulær toksisitet «Fv» er det minste antistoffragmentet som inneholder et komplett antigengjenkjennings- og bindingssete. I en tokjedet Fv-enhet omfatter denne regionen en dimer av ett tungkjede- og ett lettkjedevariabeldomene i tett, ikkekovalent assosiasjon. I en enkeltkjede-fv-enhet kan ett tungkjede- og lettkjedevariabeldomene være kovalent koblet ved en fleksibel peptid-linker slik at de lette og tunge kjedene kan assosieres i en «dimer» struktur analog med den i en tokjedet Fv-enhet. Det er i denne konfigurasjonen at de tre CDR ene på hvert variabeldomene interagerer for å definere et antigenbindende sete på overflaten av VH-VL-dimeren. Kollektivt gir de seks CDR ene antigenbindingsspesifisitet til antistoffet. Likevel har til og med et enkelt variabeldomene (eller halvparten av en Fv omfattende kun tre CDR er som er spesifikke for et antigen) evnen til å gjenkjenne og binde antigen, selv om dette foregår ved en lavere affinitet enn for hele bindingssetet. Uttrykket «hypervariabelregion» refererer når det benyttes her til aminosyrerestene på et antistoff som er ansvarlige for antigenbinding. Hypervariabelregionen omfatter generelt aminosyrerester fra en «komplementaritetsbestemmende region» eller «CDR» (for eksempel restene (L1), 0-62 (L2) og (L3) på lettkjedevariabeldomenet og 31- (H1), 0-6 (H2) og 9-2 (H3) på tungkjedevariabeldomenet, Kabat et al., Sequences og Proteins of Immunological Interest,.utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller de restene fra en «hypervariabelløkke» (for eksempel restene (L1), 0-2 (L2) og (L3) i lettkjedevariabeldomenet og (H1), 3- (H2) og 96-1 (H3) på tungkjedevariabeldomenet, Chothia og Lesk, J. Mol. Biol., 196: (1987)). «Rammeverksregion»- eller «FR»-rester er de variabeldomenerestene som er forskjellige fra hypervariabelregionrester som definert her. Uttrykket «komplementaritetsbestemmende regioner» eller «CDR» refererer når de benyttes her til deler av immunologiske reseptorer som kommer i kontakt med en spesifikk ligand og bestemmer dens spesifisitet. CDR ene på immunologiske reseptorer er den mest variable delen av reseptorproteinet, og gir reseptorene deres diversitet, og blir båret på seks løkker på den distale enden av reseptorens variabeldomener, der tre løkker kommer fra hver av de to variabeldomenene til reseptoren. «Antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet» og «ADCC» refererer til en cellemediert reaksjon der ikke-spesifikke cytotoksiske celler som uttrykker Fcreseptorer (FcR) (for eksempel naturlige dreperceller (NK-celler), nøytrofiler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff på en målcelle og deretter forårsaker lysis

17 av målcellen. De primære cellene for mediering av ADCC, NK-celler, uttrykker kun FcγRIII, mens monocytter uttrykker FcγRI, FcγRII og FcγRIII. Fc-uttrykking på hematopoietiske celler er oppsummert i tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:47-92 (1991). For å undersøke ADCC-aktivitet for et molekyl av interesse så kan en in vitro-adcc-analyse, slik som den som er beskrevet i US patent nr.,00,362 eller,821,337 bli utført. Nyttige effektorceller for slike analyser inkluderer perifere mononukleære blodceller (PBMC) og naturlige dreperceller (NK-celler). Alternativt, eller i tillegg, så kan ADCC-aktivitet for molekylet av interesse bli undersøkt in vivo, for eksempel i en dyremodell slik som den som er tilkjennegjort i Clynes et al., PNAS (USA) 9:62-66 (1988). Uttrykket «epitop» inkluderer enhver proteindeterminant som er i stand til å binde spesifikt til et immunoglobulin og/eller T-cellereseptor. Epitopdeterminanter består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler slik som aminosyrer eller sukkersidekjeder og har vanligvis spesifikke, tredimensjonale, strukturelle karakteristikaer, i tillegg til spesifikke ladningsegenskaper. Uttrykket «middel» blir her benyttet for å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt laget fra biologiske materialer. Som benyttet her refererer uttrykkene «merke» eller «merket» til inkorporeringen av em påvisbar markør, for eksempel ved inkorporeringen av en radiomerket aminosyre eller påkobling til et polypeptid med biotinylenheter som kan bli detektert med merket avidin (for eksempel streptavidin inneholdende en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan bli påvist med optiske eller kolorimetriske fremgangsmåter). I visse situasjoner kan merket eller markøren også være terapeutisk. Ulike fremgangsmåter for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent på fagområdet og kan bli benyttet. Eksempler på merker for polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, de følgende: radioisotoper eller radionuklider (for eksempel 3 H, 14 C, 1 N, 3 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 12 I, 131 I), fluorescensmerker (for eksempel FITC, rhodamin, lantanidfosforer), enzymatiske merker (for eksempel pepperotperoksidase, β-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescensgrupper, biotinylgrupper og forhåndsbestemte polypeptidepitoper som gjenkjennes av en sekundær reporter (for eksempel leucinzipperpar-sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitopmerker). I noen utførelsesformer er merker festet med spacer-armer av ulike lengder for å redusere potensiell sterisk hindring. Uttrykket «farmasøytiske middel eller legemiddel» refererer slik det benyttes her til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som er i stand til å indusere en ønsket terapeutisk effekt når de administreres riktig til en pasient. Andre kjemiske uttrykk her blir benyttet i overensstemmelse med konvensjonell bruk på fagområdet, slik