Fremgangsmåte for å produsere en gnager med evne til å produsere et repertoar av kimære antistoffer eller tunge antistoffkjeder, idet fremgangsmåten

Transkript

1 1 Patentkrav 1. Fremgangsmåte for å produsere en gnager med evne til å produsere et repertoar av kimære antistoffer eller tunge antistoffkjeder, idet fremgangsmåten omfatter: innsetting inn i et gnagercellegenom; (a) en mengde av humane IgH V regioner, en eller flere humane D regioner og en eller flere humane J regioner oppstrøms for en konstant region av vertsgnageren; og (b) eventuelt en eller flere humane Ig lett kjede kappa V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede kappa J regioner oppstrøms for vertsgnagerpattedyr kappa konstant region og/eller en eller flere humane Ig lett kjede lambda V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede lambda J regioner oppstrøms for 1 vertsgnagerpattedyr lambda konstant regionen; henholdsvis er innsettingen slik at gnageren har evne til å produsere et repertoar av kimære antistoffer eller tunge antistoffkjeder som har en gnager konstant region og en human variabel region, idet trinnene (a) og (b), når begge er tilstede, kan bli utført i en hvilken som helst rekkefølge, idet, en eller flere innskuddshendelser anvender den setespesifikke rekombinasjonen, 2 idet innsettingsprosessen begynner ved et sete hvor en initieringskassett er blitt satt inn i genomet til gnagercellen, slik som en ES celle, og hvor innsettingen av et første DNA fragment inn i initieringskassetten blir fulgt ved innsetting av et andre DNA fragment inn i en del av det første DNA fragmentet, og hvor innskuddet av det humane DNA blir gjort mellom gnager konstant regionen og den siste, 3, gnager J regionen. 2. Fremgangsmåte for fremstilling av en gnager med evne til å produsere et repertoar av kimære antistoffer eller lette antistoffkjeder, idet fremgangsmåten 3 omfatter innsetting inn i et gnagercellegenom;

2 2 (a) en mengde humane Ig lett kjede kappa V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede kappa J regioner oppstrøms for vertsgnager kappa konstant regionen og/eller en mengde humane Ig lett kjede lambda V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede lambda J regioner oppstrøms for vertsgnager lambda konstant region; og (b) eventuelt en eller flere humane IgH V regioner, en eller flere humane D regioner og en eller flere humane J regioner oppstrøms for vertsgnager konstant regionen; 1 idet innsettingen er slik at gnageren har evne til å produsere et repertoar av kimære antistoffer eller lette antistoffkjeder som har en gnager konstant region og en human variabel region, idet trinnene (a) og (b), når begge er tilstede, kan bli utført i en hvilken som helst rekkefølge, hvor en eller flere innskuddshendelser anvender setespesifikk rekombinasjon, idet innskuddsprosessen begynner ved et sete hvor en initieringskassett er blitt satt inn i genomet til gnagercellen, så som en ES celle; og hvor innsettingen av et første DNA fragment inn i initieringskassetten blir etterfulgt av innsetting av et andre DNA fragment inn i en del av det første DNA fragmentet, og hvor innsettingen av det humane DNA blir utført mellom gnager konstant regionen og den siste, 3, gnager J regionen En fremgangsmåte for å produsere en gnagercelle, idet fremgangsmåten omfatter innsetting inn i et gnagercellegenom; (a) en mengde humane IgH V regioner, en eller flere humane D regioner og en eller flere humane J regioner oppstrøms for en konstant region av vertsgnageren; og (b) eventuelt en eller flere humane Ig lett kjede kappa V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede kappa J regioner oppstrøms for vertsgnagerpattedyr kappa konstant region og/eller en eller flere humane Ig lett kjede lambda V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede lambda J regioner oppstrøms for vertsgnagerpattedyr lambda konstant regionen; henholdsvis, idet trinnene (a) og (b), når begge er tilstede, kan bli utført i en hvilken som helst rekkefølge, hvor, en eller flere innskuddshendelser anvender setespesifikk rekombinasjon, hvor innskuddsprosessen forløper ved et sete hvor en initieringskassett er blitt satt inn i genomet til gnagercellen, så som ES cellen, og hvor innskudd av et første DNA fragment inn i initierinskassetten blir etterfulgt av innsetting av et andre DNA fragment inn i en del av det første DNA fragmentet, og hvor innsettingen av det

3 3 humane DNA blir utført mellom gnager konstant regionen og siste, 3, gnager J regionen En fremgangsmåte for fremstilling av en gnagercelle, idet fremgangsmåten omfatter innsetting inn i et gnagercellegenom; (a) en mengde humane Ig lett kjede kappa V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede kappa J regioner oppstrøms for vertsgnager kappa konstant regionen og/eller en mengde av humane Ig lett kjede lambda V regioner og en eller flere humane Ig lett kjede lambda J regioner oppstrøms for vertsgnager lambda konstant regionen; og (b) eventuelt en eller flere humane IgH V regioner, en eller flere humane D regioner og en eller flere humane J regioner oppstrøms for vertsgnager konstant regionen; idet trinnene (a) og (b), når begge er tilstede, kan bli utført i en hvilken som helst rekkefølge, hvor en eller flere innsettingshendelser anvender setespesifikk rekombinasjon hvor innsettingsprosessen forløper ved et sete hvor initieringskassetten er blitt satt inn i genomet til gnagercellen, så som en ES celle; og hvor innsettingen av et første DNA fragment inn i initieringskassetten blir fulgt ved innsetting av et andre DNA fragment inn i en del av det første DNA fragmentet, og hvor innsettingen av det humane DNA blir utført mellom gnager konstant regionen og siste, 3 gnager J regionen.. En fremgangsmåte ifølge krav 1-4, hvor den setespesifikke rekombinasjonen er RMCE. 6. En fremgangsmåte ifølge krav, hvor RMCE er sekvensiell (SRMCE) En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene omfattende følgende trinn: i. innsetting av DNA som danner en initieringskassett inn i genomet til en celle; ii. innsetting av et første DNA fragment inn i innskuddssete, idet det første DNA fragmentet omfatter en første del av en human VDJ eller VJ DNA region og en første vektordel inneholdende en første selekterbar markør og som danner en selekterbar markør ved innsetting; iii. eventuelt fjerning av en del av vektor DNA; iv. innsetting av et andre DNA fragment inn i den vektordelen til det første DNA fragmentet, idet det andre DNA fragmentet inneholder en andre del av human VDJ eller VJ DNA og en andre vektordel, idet den andre vektordelen

4 4 inneholder en andre selekterbar markør, eller som danner en andre selekterbar markør ved innskudd; v. fjerning av eventuelt vektor DNA for å muliggjøre at første og andre DNA fragmentene danner en sammenhengende sekvens; og vi. gjentagelse av trinnene omfattende innsetting av en del av det humane V(D)J DNA og vektor DNA fjerning, etter behov, for å produsere en celle med hele eller en del av den humane VDJ eller VJ regionen som er tilstrekkelig for å kunne danne et kimært antistoff i sammenheng med en vert konstant region. 8. En fremgangsmåte ifølge krav 7, hvor de tre heterospesifikke og inkompatible IoxP setene blir anvendt En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav hvor de setespesifikke rekombinasjonssetene er IoxP seter, eller varianter derav, eller FRT seter, eller varianter derav.. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav hvor de setespesifikke rekombinase systemene er valgt fra Cre-lox og FLP/FRT, eller kombinasjoner derav En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav som anvender en vektor, idet vektoren omfatter et innskudd omfattende en region av humant DNA fra noen av de humane VDJ eller VJ lokus flankert av DNA som ikke er fra det lokuset, og hvor det flankerende DNA omfatter en eller flere selekterbare markører eller en eller flere setespesifikke rekombinante seter. 12. En fremgangsmåte ifølge krav 11, idet vektoren omfatter 2 eller flere, så som 3, heterospesifikke og inkompatible setespesifikke rekombinasjonsseter. 13. En fremgangsmåte ifølge krav 11 eller 12, idet vektoren omfatter en eller flere transposon ITR (invertert terminale gjentagelse) sekvenser En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, idet initieringskassetten blir satt inn i gnager tung kjede lokuset, for anvendelse ved innskudd av humant tung kjede DNA.

5 1. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, idet initieringskassetten blir satt inn i gnager lett kjede lokuset, for anvendelse ved innsetting av humant lett kjede VJ DNA. 16. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, idet initeringskassetten blir satt inn mellom posisjon 114,667,090 og 114,66,190 av mus kromosom 12 (NCBI m37, April 07 ENSEMBL Release,37h for mus C7BL/6J stammen. 17. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor det første humane variable regionfragmentet blir satt inn med homolog rekombinasjon ved initieringskassett skjelettsekvensen og deretter blir DNA til en hvilken som helst negativ seleksjonsmarkør og initieringskassetten i vektoren deretter fjernet ved rekombinasjon mellom rekombinase målsekvensene En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor enden av det humane innskuddet er forøket i lengde. 19. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor cellen er en ES celle. En fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst foregående krav, hvor: 2 en eller flere gnager kontrollsekvenser så som enhancersekvensen blir opprettholdt oppstrøms for gnager Mu konstant regionen, fortrinnsvis i dets native posisjon med hensyn til avstanden fra konstant region; eller en eller flere gnager kontrollsekvenser så som en enhancersekvens(er) blir opprettholdt nedstrøms for gnager Mu konstant regionen, fortrinnsvis i dets native posisjon med hensyn til avstanden fra konstant region; eller en gnager switch sekvens, fortrinnsvis den endogene switch sekvensen, blir opprettholdt oppstrøms for gnager Mu konstant regionen, fortrinnsvis i dets native posisjon med hensyn til avstanden fra konstant regionen En fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor ES cellen omfatter en fullstendig human VDJ eller VJ sekvens, eller del derav.

6 6 22. En fremgangsmåte for produsering av et antistoff spesifikt for et ønsket antigen, idet metoden omfatter immunisering av en gnager dannet ifølge kravene 1, 2, eller -21, med ønsket antigen og isolering av antistoffet. 23. Fremgangsmåten ifølge krav 22, som videre omfatter isolering av antistoffet eller celler som uttrykker antistoffet, og deretter erstatning av den ikke-humane pattedyr konstant regionen med en human konstant region for å produsere et fullstendig humanisert antistoff. 24. Fremgangsmåte ifølge krav 22 eller krav 23, som videre omfatter dannelse av et kimært antistoff derivat av det kimære antistoffet ifølge krav 22 eller Fremgangsmåte ifølge krav 24, idet de kimære antistoffene ifølge krav 22 eller 23 er manipulerte, eventuelt på DNA nivå, for å danne molekyler med antistofflignende egenskaper eller struktur valgt fra: et domene antistoff; eller en human variabel region med en hvilken som helst konstant region fra enten tung eller lett kjede fra den samme eller annen art; eller human variabel region sammen med en hvilken som helst annen fusjonspartner Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 22 til 2, som videre omfatter fremstilling av en farmasøytisk sammensetning som omfatter kombinering av antistoffet, med en farmasøytisk akseptabel bærer eller en annen eksipient for å produsere sammensetningen. 27. En fremgangsmåte ifølge krav 22, som videre omfatter dyrking eller tilveiebringing av en antistoffproduserende celle eller cellelinje fra gnagercellen, eventuelt hvor antistoffcellen eller cellelinjen er udødeliggjort enten ved fusjon til en tumorcelle for å tilveiebringe en antistoffproduserende celle og cellelinje, eller ved direkte cellulær udødliggjøring. 28. En gnager dannet ved fremgangsmåtene ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller En gnager ifølge krav 28, omfattende en fullstendig human VDJ eller VJ sekvens eller del derav.

7 7. En gnagercelle isolert fra gnageren ifølge krav 28 eller 29, idet cellen omfatter en fullstendig human VDJ eller VJ sekvens, eller del derav.