Amplifikasjonsteknikker - andre metoder

Transkript

1 Amplifikasjonsteknikker - andre metoder Svein Arne Nordbø TH

2 Alternative amplifikasjonsmetoder Templat-amplifikasjons metoder Signal-amplifikasjonsmetoder

3 Templat-amplifikasjons metoder Alle bruker enzym-medierte prosesser til å syntetisere kopier av målsekvensen Amplifikasjonsproduktet produseres av oligonucleotid-primere Produserer kopier av målsekvensen Utsatt for kontaminasjon, falske-positive resultater

4 Templat-amplifikasjons metoder PCR LCR Ligase Chain Reaction NASBA - Nucleic Acid Sequence-Based Amplification TMA Transcription Mediated Amplification SDA - Strand Displacement Amplification RCA - Rolling circle amplification LAMP - Loop-mediated Isothermal Amplification HDA - Helicase dependent amplification

5 Ligase Chain Reaction (LCR) Hvert probe-par hybridiserer nær hverandre på målsekvensen. Når probene har hybridisert, fylles gapet med DNA polymerase og lukkes med ligase-enzymet. De ligerte probe-parene hybridiserer med hverandre, og etter denaturering danner de templat for gjentatte amplifikasjonsrunder. LCR produktet detekteres i et automatisert instrument som bruker et immunkolorimetrisk mikropartikkel capture system. Etter LCR-kjøringen blir amplifikasjonsproduktene inaktivert ved tilsetning av et chelert metallkompleks og et oksyderende stoff.

6 Ligase Chain Reaction Template Probes...GTACTCTAGCT... A G T C...CATGAGATCGA... ligase Target sequences are detected by coupled and.

7 NASBA og TMA Begge er isothermale RNA amplifikasjoner RNA målsekvens blir reverstranskribert til cdna, fulgt av RNA-syntese via RNA polymerase Amplifikasjonen omfatter syntese av cdna fra RNA med en primer som har en T7 RNA pol promoter sekvens Tre enzymer er involvert: RT, RNase H og RNA polymerase Isothermal reaksjon ved 41 C Produserer RNA produkt i stedet for DNA Reduserer risikoen for kontaminasjon (?)

8

9

10

11

12

13 Step 3 - Detection Hybridization Protection Assay Hybridization Protection Assay (HPA) Hybridization rrna AE Dual Kinetic Assay (DKA) DNA Probe AE + AE AE 60 C 1 hour Hybridize AE Hybrids

14 Hybridization Protection Assay Selection/Detection luminometer

15 NASBA System Adapt to regular instrument

16 Strand Displacement Amplification (SDA) Isoterm nukleinsyreamplifikasjon som baserer seg på to polymeriserings-trinn og fjerning av 1 kuttet (nicked) tråd med genmateriale Primere som har et restriksjonssete hybridiserer med templatet Amplifikasjonen skjer ved fast temperatur Nylig syntetisert DNA blir kuttet med restriksjonsenzym, og en Phi 29 polymerase starter amplifikasjonen igjen og fjerner den nylig syntetiserte DNA-tråden 10 9 kopies av DNA kan produseres i en reaksjon Uspesifikke reaksjoner reduseres ved tilsetting av organiske løsemidler som øker stringensen Høy bakgrunn med DNA kan gi uspesifikk amplifikasjon som reduserer sensitiviteten Walker, Linn and Nadeau, Nucleic Acid Research, 1995

17 Strand Displacement Amplification (SDA)

18 Rolling Circle Amplification (RCA) Krever et sirkulært templat og en Phi 29 DNA polymerase Gir en kontinuerlig sirkulær isoterm amplifikasjon Kan amplifisere 10 7 kopier av templatet Kan påvise DNA- eller RNA-sekvenser fra plasmider og bakteriofager

19

20 Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Enkel og billig isoterm reaksjon Målsekvensen amplifiseres ved 65 C og bruker 2 eller 3 sett av primere og en polymerase med høy strand displacement aktivitet Mengden DNA som blir produsert med LAMP er betydelig høyere enn ved PCR Utfelling av Mg pyrofosfat resulterer i en synlig turbiditet som kan ses med det nakne øye Reaksjonen kan følges i real-time enten ved målinger av turbiditet eller signaler fra DNA produsert via fluorescerende fargestoffer (f.eks. SYBR Green)

21 Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Notomi, T. et al.,2000, Nucleic Acids Research. 28, E63.

22 Helicase dependent amplification (HDA)

23 Signal-amplifikasjonsmetoder Basert på at flere grupper av signalmolekyler er festet til hvert probemolekyl slik at man får en forsterkning av signalet uten amplifisering av målsekvensen Medfører mindre sjanse for kontaminasjon Sensitiviteten er noe lavere, mens reproduserbarheten er noe bedre enn genamplifikasjonsmetodene

24 Signal-amplifikasjonsmetoder bdna Hybrid capture

25 Branched DNA (bdna) assay Solid phase signal-amplifikasjonssystem Benytter multiple sett av syntetiske oligonucleotid prober Kan detektere DNA og RNA uten revers transkripsjon

26

27

28

29

30

31 Hybrid Capture Assay (HC2) Nukleinsyre-ekstraksjon Kliniske prøver behandles med en basisk løsning som ødelegger bakterier og virus og frigjør DNA. Hybridisering med RNAprobe Specifikke RNA-prober binder seg til DNAmålsekvens og danner RNA:DNA hybrider

32 Hybrid Capture Assay Binding av hybrider RNA:DNA hybrider bindes til veggen i mikrotiterbrønner ved hjelp av antistoffer specifikke for RNA:DNA hybrider Deteksjon RNA:DNA hybrider som er bundet til mikrotiterbrønnene detekteres med flere antistoffer merket med alkalisk fosfatase

33 Hybrid Capture Assay Signaldeteksjon Bundet alkalisk fosfatase detekteres med chemiluminiscence. Substratet produserer lys som måles i et luminometer i Relative Light Units (RLUs). Intensiteten av lyssignalet er proporsjonal med mengden av DNA i reaksjonen

34 Oversikt over alternative amplifikasjonsteknikker J Pharm Bioallied Sci ; 5(4):

35 Egenskaper til isoterme amplifikasjonsteknikker Nucleotides and Nucleic Acids 2008, 27:3,