(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. G01N 33/574 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (62) Avdelt fra EP , med inndato (73) Innehaver Nuclea Biomarkers LLC, 105 South Street, Pittsfield, MA 01201, USA (72) Oppfinner Muraca, Patrick J., 8A Stratford Avenue, PittsfieldMA 01201, USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge (54) Benevnelse Fremgangsmåte for å forutsi responsen til NSCLC-pasienter på behandling med en EGFR- TK inhibitor (56) Anførte publikasjoner CAPPUZZO F ET AL: "Akt phosphorylation and gefitinib efficacy in patients with advanced nonsmall-cell lung cancer", J NATL CANCER INST, vol. 96, no. 15, 4 August 2004 ( ), pages , XP , HAN S-W ET AL: "Epidermal growth factor receptor (EGFR) downstream molecules as response predictive markers for gefitinib (Iressa(R), ZD1839) in chemotherapy-resistant non-small cell lung cancer", INT J CANCER, vol. 113, no. 1, 1 January 2005 ( ), pages , XP ,

2 1 Beskrivelse 5 Beslektede søknader Denne søknad har prioritet under 35 U.S.C. 119(e) til U.S. Provisional Application Serial No. 60/ innsendt 27. februar Bakgrunn for oppfinnelsen Pasienter diagnostisert med cancer er stilt overfor kostbare og ofte smertefulle behandlingsvalg. Disse behandlinger kan være ineffektive i en subpopulasjon av pasienter, og som et resultat utstår disse pasientene disse behandlingene med liten eller ingen terapeutisk fordel. Noen pasienter kan reagere negativt på visse midler, noe som bevirker ytterligere lidelse og eventuell død. 15 Ineffektiv behandling er også problematisk fordi tid er en nøkkelvariabel med hensyn til cancerbehandling. En som behandler har en mye større sjanse for å beherske og ta hånd om sykdommen dersom canceren diagnostiseres på et tidlig tidspunkt og behandles med et terapeutisk effektivt middel. Et middel kan tilveiebringe store terapeutiske fordeler dersom det administreres på et tidlig stadium av sykdommen, men når tiden går kan det samme middel imidlertid opphøre og være effektivt Lungecancer er et eksempel på en tilstand hvor tidlig diagnose er en nøkkel for effektiv behandling. De fleste lungecancere faller innenfor to kategorier, småcellet lungecancer og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). NSCLC er den mest vanlige typen av lungecancer. Der er tre viktige undergrupper av NSCLS: adenokarsinom, skvamøs celle karsinom og storcellet udifferensiert karsinom Kjemoterapi anvendes ofte for å behandle NSCLC. Erlotinib (TARCEVA ) er et kjemoterapeutisk middel indikert for andrelinjeterapi av NSCLC etter svikt av minst en tidligere kjemoterapikur og gefitinib (IRESSA ) er indikert for fortsatt behandling av NSCLC etter svikt av platinabaserte og docetaksel kjemoterapier. Som med mange kjemoterapeutiske midler, fører administrering av disse legemidler ofte til alvorlige bivirkninger for pasienten, noen pasienter responderer ikke godt eller responderer ikke i det hele tatt på behandling. Noen pasienter gjennomgår således behandling med erlotinib eller gefitinib og lider smertefulle bivirkninger for kun senere å forstå at middelet ikke har vært terapeutisk fordelaktig for deres tilstand. I tillegg til den unødvendige lidelsen, har man mistet kritisk tid i forbindelse med å bestemme alternativ behandling.

3 Han et al., Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Downstream Molecules as Response Predictive Markers for Gefitinib (Iressa, ZD1839) i Chemotherapy- Resistant Non-Small Cell Lung Cancer, Int. J. Cancer (2005) omhandler en metode for å bestemme om en pasient diagnostisert med NSCLC responderer på behandling med EGFR-TK inhibitoren gefitinib basert på en proteinekspresjonsprofil som består av fosfo-akt og fosfo-erk, hvorved oppregulert fosfo-akt og nedregulert fosfo-erk indikerer at pasienten responderer på behandling med gefitinib. Videre, omhandler dokumentet av hverken EGFR eller fosfo-egfr status korrelerer med respons Oppsummering av oppfinnelsen Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder for å anvende proteinekspresjonsprofiler for å identifisere de pasienter som det er sannsynlig vil respondere på behandling med forbindelser som inhiberer den intracellulære fosforylering av tyrosin kinase (TK) assosiert med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) som inkluderer erlotinib og gefitinib (disse pasienter er omtalt som respondere ), så vel som de pasienter som det ikke er sannsynlig har fordel av en slik behandling (disse pasienter er omtalt som ikke-respondere ). Den foreliggende oppfinnelse tillater at en som tilveiebringer behandling kan identifisere de pasienter som responderer på behandling med forbindelser som inhiberer den intracellulære fosforylering av EGFR-assosiert tyrosin kinase, som inkluderer erlotinib og gefitinib, og dem som er ikke-responderer på slik behandling, før administrering av middelet. Forbindelser slik som erlotinib og gefitinib som inhiberer den intracellulære fosforyleringen av EGFR-assosiert tyrosin kinase omtales i det etterfølgende som EGFR-TK inhibitorer Den foreliggende beskrivelse omfatter proteinekspresjonsprofiler så vel som de tilsvarende genekspresjonsprofiler (også omtalt som gensignaturer ) som er en indikasjon på tendensen hos en pasient som er plaget av lungecancer, særlig NSCLC, til å respondere på behandling med en EGFR-TK inhibitor. Proteinekspresjonsprofilen omfatter minst ett, og foretrukket flere, proteiner valgt fra gruppen som består av p70s6k, fosfo-p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo-igfr/lnr, EGFR, fosfo-egfr, fosfo-her2/erbb2, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP. Denne gruppen av proteiner omtales heri som EGFR-TK inhibitor responder proteiner. Ifølge oppfinnelsen er p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin,

4 3 MMP11 og GFAP oppregulert (overuttrykt) i pasienter som responderer på EGFR-TK inhibitorer Den foreliggende beskrivelse omfatter videre genekspresjonsprofiler (også omtalt som gensignaturer ) som er indikasjon på tendensen hos en pasient som er plaget med NSCLC til å respondere på behandling med en EGFR-TK inhibitor. Genekspresjonsprofilen omfatter minst ett, foretrukket flere gener som koder for proteinene valgt fra gruppen som består av p70s6k, fosfo-p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo-igfr/inr, EGFR, fosfo-egfr, fosfo- HER2/ErbB2, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP. Denne gruppen av gener er omtalt heri som EGFR-TK inhibitor responder genene. Ifølge beskrivelsen er noen eller alle av disse genene forskjellig uttrykt (f.eks. oppregulert eller nedregulert) i pasienter som er responder på EGFR-TK inhibitorterapi. Spesifikt er gener som koder for p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP oppregulert (overuttrykt) og gener som koder for fosfo-p70s6k, fosfor MEK, fosfor MARPK, fosfo-igfr/inr, fosfo-egfr og fosfo-her2/erbb2 er nedregulert (underuttrykt) i pasienter som responderer på EGFR- TK inhibitorer. 20 Foreliggende oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for å bestemme om er pasient er en responder eller ikke-responder på behandling med en EGFR-TK inhibitor som definert ved krav Den foreliggende beskrivelse omfatter videre en analyse for å bestemme protein- og/ eller gen-ekspresjonsprofilen i en pasientprøve og instruksjoner for å anvende analysen. 30 Detaljert beskrivelse Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer gen- og protein-ekspresjonsprofiler (GPEP er), og deres anvendelse for å forutsi en pasients responderbarhet på en cancerbehandling. Mere spesifikt er de foreliggende gen- og protein-ekspresjonsprofiler en indikasjon på om en pasient som er plaget av ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er en responder eller en ikke-responder på behandling med en forbindelse som er en EGFR-TK inhibitor, særlig erlotinib (TARCEVA ) eller gefitinib (IRESSA ). 35 Erlotinib og gefitinib er kjemoterapeutiske midler som tilhører gruppen av medisiner betegnet antineoplastika. Disse forbindelsene virker ved å inhibere den intracellulære

5 4 fosforylering av tyrosin kinase assosiert med transmembrancelleoverflatereseptorer, som inkluderer EGFR, en reseptor uttrykt på celleoverflaten til normale celler og cancerceller. Disse forbindelser interfererer med vekst av cancerceller, som til slutt ødelegges Signifikante forbedringer i utfallet av NSCLC i noen pasienter behandlet med erlotinib eller gefitinib er blitt rapportert. Veksten av normale celler er imidlertid ofte påvirket av disse medisiner, som fører til uventede og/eller ubehagelige effekter. Disse andre effekter kan inkludere: diaré, kløe, akne, tørr hud, kvalme (man føler seg uvel) og oppkast, tap av appetitt og vekttap, asteni og pruritt og abdomensmerte. Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer biomarkører som er assosiert med de pasienter som har hatt fordel av behandling med erlotinib og/eller gefitinib. Den foreliggende oppfinnelse muliggjør således at den som gir behandling kan bestemme på forhånd de NSCLC pasienter som sannsynligvis vil dra fordel av behandling med erlotinib eller gefitinib, og vurdere alternative behandlingsvalg for ikke-respondere Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer proteinekspresjonsprofiler som er en indikasjon på om en pasient har en sannsynlighet for å være en responder eller en ikke-responder på EGFR-TK inhibitorterapi. Proteinene som omfatter ekspresjonsprofilen som angitt heri er valgt fra gruppen som består av p70s6k, fosfo-p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo- IGFR/InR, EGFR, fosfo-egfr, fosfo-her2/erbb2, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP. Denne gruppe av proteiner omtales heri som EGFR-TK inhibitor responder proteiner. Ifølge oppfinnelsen er p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfomtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP oppregulert (overuttrykt) i pasienter som responderer på EGFR-TK inhibitorer. 30 Tabell 1 identifiserer EGFR-TK inhibitor responder proteiner, og indikerer om ekspresjon av disse proteiner er opp- eller nedregulerte i pasienter som responderer på terapi med en EGFR-TK inhibitor. Tabell 1 Protein* Over- Under- SEKV ID NR for aksesjonsnummer ekspresjon ekspresjon protein Total p70s6k Pos 17 NP_ Fosfo-p70S6K Pos Samme som over

6 5 Fosfo-S6 NP_ Fosfo-AKT NP_00515 Fosfo-mTOR NP_ Fosfo-PTEN NO_ Fosfor MEK NP_ Fosfor MAPR NP_ Fosfo-IGFR1/InR NP_00557 Total EGFR NP_ Fosfo-EGFR Samme som over Fosfo-HER2(ErbB2) NP_ Fosfo-ER NP_ Fosfo-AR NP_ AIK NP_ Osteopontin NP_ MMP11 NP_ GFAP NP_ Pos 18 Pos 19 Pos 20 Pos 21 Pos 22 Pos 23 Pos 24 Pos 25 Pos Pos 26 Pos 27 Pos 28 Pos 29 Pos 30 Pos 31 Pos 32 *Aksesjonsnr. refererer til ikke-fosforylert protein 5 Den foreliggende beskrivelse omfatter videre genekspresjonsprofiler som er indikasjon på tendensen hos en pasient som er rammet av NSCLC til å respondere på behandling

7 med EGFR-TK inhibitorer. Genekspresjonsprofilen omfatter minst ett, foretrukket flere gener som koder for proteinene valgt fra gruppen som består av p70s6k, fosfop70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo- IGFR/InR, EGFR, fosfo-egfr, fosfo-her2/erbb2, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP. Denne gruppen av proteiner omtales heri som EGFR-TK inhibitor responder gener. Ifølge beskrivelsen er noen eller alle disse genene forskjellig uttrykt (f.eks. oppregulert eller nedregulert) i pasienter som responderer på EGFR-TK inhibitorterapi. Spesifikt er gener som koder for p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfomtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP oppregulert (overuttrykt) og gener som koder for fosfo-p70s6k, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo-igfr/inr, fosfo-egfr og fosfo-her2/erbb2 er nedregulert (underuttrykt) i pasienter som responderer på EGFR-TK inhibitorer. Det er følgelig mulig å bestemme om det er sannsynlig at en pasient har fordel av slik terapi ved å oppnå en genekspresjonsprofil fra pasientens vev og bestemme om ett eller flere av genene i EGFR-TK inhibitor responder genene er opp- eller nedregulert. 20 Tabell 2 identifiserer EGFR-TK inhibitor responder gener og indikerer om ekspresjon av disse gener er opp- eller nedregulert i pasienter som responderer på terapi med en EGFR-TK inhibitor. Tabell 2 viser også NCBI aksesjonsnummeret for minst en variant av disse gener.

8 7 Tabell 2 Genaksesjonsnummer Kodet protein Overekspresjon Underekspresjon SEKV ID NR for gener RPS6KB1 Total p70s6k Pos 1 NM_ Samme som over Fosfo-p70S6 Pos RPS6 Fosfo-S6 Pos 2 NM_ AKT1 Fosfo-AKT Pos 3 NM_ FRAP1 Fosfo-mTOR Pos 4 NM_ PTEN Fosfo-PTEN Pos 5 NM_00314 MAP2K1 Fosfor MEK Pos 6 NM_ MAPK1 Fosfor MAPK Pos 7 NM_ FCGR1A Fosfo- Pos 8 NM_ IGFR1/InR EGFR Total EGFR Pos 9 NM_ Samme som over Fosfo-EGFR Pos ERBB2 Fosfo- Pos 10 NM_ HER2(ErbB2) ESR1 Fosfo-ER Pos 11 NM_ AR Fosfo-AR Pos 12 NM_ AURKA AIK Pos 13 NM_ SPP1 Osteopontin Pos 14 NM_ MMP11 MMP11 Pos 15 NM_ GFAP NM_ GFAP Pos 16

9 8 Andre varianter av disse gener eksisterer (f.eks. se gendatabasene som er tilgjengelig gjennom NCBI Entrez website ( og disse varianter er omfattet av den foreliggende beskrivelse I et foretrukket aspekt av den foreliggende beskrivelse, omfatter proteinekspresjonsprofilene for den foreliggende beskrivelse minst omtrent fire, foretrukket mellom omtrent fire og ni, og mere foretrukket mellom omtrent ni og atten av EGFR-TK inhibitor responder proteinene som er opp- eller nedregulert som anvendbare. I et for tiden foretrukket aspekt omfatter proteinekspresjonsprofilen minst omtrent fire, og foretrukket omtrent seks til tolv, av EGFR-TK inhibitor responder proteinene som er oppregulert, og minst omtrent to, og foretrukket omtrent fire til seks, av EGFR-TK inhibitor responder proteinene som er nedregulert I et foretrukket aspekt av den foreliggende beskrivelse omfatter genekspresjonsprofilene ifølge den foreliggende beskrivelse minst omtrent fire, foretrukket mellom omtrent fire og ni, og mer foretrukket mellom omtrent ni og seksten av EGFR-TK inhibitor responder genene som er opp- eller nedregulert som anvendelige. I et for tiden foretrukket aspekt, omfatter genekspresjonsprofilen minst omtrent fire, og foretrukket omtrent seks til tolv av EGFR-TK inhibitor responder genene som er oppregulert, og minst omtrent to, og foretrukket omtrent fire til seks, av EGFR-TK inhibitor responder genene som er nedregulert Protein- og/eller gen-ekspresjonsprofilene ifølge beskrivelsen kan anvendes for å forutsi responderbarheten hos en NSCLC pasient på terapi med en EGFR-TK inhibitor, særlig erlotinib eller gefitinib. Den foreliggende fremgangsmåte omfatter (a) oppnåelse av en proteinekspresjonsprofil fra en tumorprøve fra en pasient som er rammet av NSCLC; (b) bestemme ut fra proteinekspresjonsprofilen om ekspresjon av alle de etterfølgende proteiner er oppregulert (overuttrykt): p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP. 35 Definisjoner: For letthets skyld er betydningen av bestemte betegnelser og uttrykk som benyttes i beskrivelsen, eksemplene og de vedlagte kravene tilveiebrakt nedenfor. Definisjonene er ikke ment å være begrensende i sin natur og tjener til å tilveiebringe en klarere forståelse av bestemte aspekter av den foreliggende oppfinnelse.

10 9 Betegnelsen genom skal inkludere hele DNA komplementet av en organisme, som inkluderer den nukleære DNA komponenten, kromosomalt eller ekstrakromosomalt DNA, så vel som det cytoplasmiske domenet (f.eks. mitokondrie DNA) Betegnelsen gen refererer til en nukleinsyresekvens som omfatter kontroll- og kodesekvenser som er nødvendige for å fremstille et polypeptid eller forløper. Polypeptidet kan være kodet for av en full lengde kodesekvens eller ved en hvilken som helst del av kodesekvensen. Genet kan i sin helhet eller delvis være avledet fra en hvilken som helst kilde som er kjent innen teknikken, som inkluderer en plante, en sopp, et dyr, et bakteriegenom eller episom, eukaryotisk, nukleær eller plasmid DNA, cdna, viral DNA eller kjemisk syntetisert DNA. Et gen kan inneholde en eller flere modifikasjoner i enten koderegionene eller de ikke-translaterte regionene som vil kunne påvirke den biologiske aktiviteten eller den kjemiske strukturen til ekspresjonsproduktet, ekspresjonsraten eller ekspresjonskontrollmåten. Slike modifikasjoner inkluderer, men er ikke begrenset til, mutasjoner, insersjoner, delesjoner og substitusjoner av ett eller flere nukleotider. Genet kan utgjøre en ikke-avbrutt kodesekvens eller det kan inkludere ett eller flere introner, som er bundet ved passende spleiseforbindelser. Betegnelsen gen som angitt heri inkluderer varianter av genene identifisert i tabell Betegnelsen genekspresjon refererer til prosessen hvorved en nukleinsyresekvens gjennomgår vellykket transkripsjon og translasjon slik at detekterbare nivåer av nukleotidsekvensen uttrykkes. 25 Betegnelsene genekspresjonsprofil eller gensignatur refererer til en gruppe av gener som er uttrykt ved en spesiell celletype eller vevstype hvor tilstedeværelsen av genene sett under ett eller den ulike ekspresjon av slike gener, indikerer/varsler en bestemt tilstand Betegnelsen nukleinsyre som anvendt heri refererer til et molekyl som er omfattet av ett eller flere nukleotider, dvs. ribonukleotider, deoksyribonukleotider eller begge. Betegnelsen inkluderer monomerer og polymerer av ribonukleotider og deoksyribonukleotider, hvor ribonukleotidene og/eller deoksyribonukleotidene er bundet sammen, i tilfellet av polymerene, via 5 til 3 bindinger. Ribonukleotid- og deoksyribonukleotidpolymerene kan være enkelttrådet eller dobbelttrådet. Bindinger kan imidlertid inkludere hvilke som helst av bindingene som er kjent innen teknikken som f.eks. inkluderer nukleinsyrer som omfatter 5 til 3 bindinger. Nukleotidene kan være naturlig forekommende eller kan være syntetisk produserte analoger som er i stand til

11 10 5 å danne baseparforbindelser med naturlig forekommende basepar. Eksempler på ikkenaturlig forekommende baser som er i stand til å danne baseparforbindelser inkluderer, men er ikke begrenset til, aza- og deaza-pyrimidinanaloger, aza- og deaza-purinanaloger og andre heterocykliske baseanaloger, hvor ett eller flere av karbon- og nitrogenatomene i pyrimidinringene er blitt substituert med heteroatomer, f.eks. oksygen, svovel, selen, fosfor og lignende. Videre, omfatter betegnelsen nukleinsyresekvenser den komplementære sekvensen og inkluderer spesifikt en hvilken som helst nukleinsyresekvens som er i alt vesentlig homolog med både nukleinsyresekvensen og dens komplement Betegnelsen array(matrise) og mikroarray(mikromatrise) refererer til typen av gener eller proteiner representert på en array ved oligonukleotider eller proteinfangemidler, og hvor typen av gener eller proteiner representert på arrayen er avhengig av det tilsiktede formål for arrayen (f.eks. for å måle ekspresjon av humane gener eller proteiner). Oligonukleotidene eller proteinfangemidlene på en gitt array kan korrespondere med den samme type, kategori eller gruppe av gener eller proteiner. Gener eller proteiner kan betraktes til å være av samme type dersom de deler noen felles egenskaper slik som opprinnelsesart (f.eks. human, mus, rotte); sykdomstilstand (f.eks. cancer); funksjoner (f.eks. protein kinaser, tumor suppressorer); eller samme biologiske prosess (f.eks. apoptose, signaltransduksjon, cellesyklusregulering, proliferasjon, differensiering). En array type kan f.eks. være en cancer array hvor hvert av array-oligonukleotidene eller proteinkapringsmidlene svarer til et gen eller protein assosiert med en cancer. En epitel array kan være en array av oligonukleotider eller proteinkapringsmidler som svarer til unike epitelgener eller proteiner. Likeledes kan en cellesyklus array være en array type hvor oligonukleotidene eller proteinkapringsmidlene svarer til unike gener eller proteiner assosiert med cellesyklusen. 30 Betegnelsen celletype refererer til en celle fra en gitt kilde (f.eks. et vev, organ) eller en celle i en gitt differensieringstilstand, eller en celle assosiert med en gitt patologi eller genetisk makeup. 35 Betegnelsen aktivering som anvendt heri referer til en hvilken som helst endring av et signaleringsspor eller biologisk respons som f.eks. inkluderer økning over basalnivåer, restaurering til basalnivåer fra en inhibert tilstand og stimulering av sporet over basalnivåer.

12 Betegnelsen differensiell ekspresjon referer til både kvantitative så vel som kvalitative forskjeller i de temporale og vevs-ekspresjonssporene for et gen eller et protein i syke vev eller celler versus normale nærliggende vev. Et differensielt uttrykt gen kan f.eks. ha sin ekspresjon aktivert eller fullstendig inaktivert ved normale versus syke tilstander, eller kan være oppregulert (overuttrykt) eller nedregulert (underuttrykt) i en sykdomstilstand versus en normal tilstand. Et slikt kvalitativt regulert gen kan utvise et ekspresjonsmønster i et gitt vev eller celletype som kan detekteres i enten kontrolltilstander eller sykdomstilstander, men som ikke er detekterbare i forbindelse med begge. Sagt på en annen måte, er et gen eller protein ulikt uttrykt når ekspresjon av genet eller proteinet forekommer ved et høyere eller lavere nivå i de syke vev eller celler hos en pasient i forhold til nivået for dets ekspresjon i normale (sykdomsfrie) vev eller celler til en pasient og/eller kontroll-vev eller -celler. 15 Betegnelsen detekterbar refererer til et RNA ekspresjonsmønster som kan detekteres via standard teknikker med polymerase-kjedereaksjon (PCR), versus transkriptase-(rt) PCR, differensiell display og Northern analyse som er vel kjent for de fagkyndige på området. Likelede kan proteinekspresjonsmønstre detekteres via standard teknikker slik som Western blots Betegnelsen komplementær refererer til den topologiske kompatibiliteten eller sammenmatching av de interagerende overflater hos et probemolekyl, og dets mål. Målet og dets prober kan beskrives som komplementære, og videre er kontaktoverflateegenskapene komplementære med hverandre. Hybridisering eller baseparing mellom nukleotider eller nukleinsyrer, slik som f.eks. mellom de to trådene i et dobbelttrådet DNA molekyl eller mellom en oligonukleotidprobe og et mål er komplementære Betegnelsen biologisk prøve refererer til en prøve oppnådd fra en organisme (f.eks. en human pasient) eller fra komponenter (f.eks. celler) i en organisme. Prøven kan være av et hvilket som helst biologisk vev eller fluid. Prøven kan være en klinisk prøve som er en prøve avledet fra en pasient. Slike prøver inkluderer, men er ikke begrenset til, ekspektorat, blod, blodceller (f.eks. hvite blodceller), fostervann, plasma, sæd, benmarg og vev eller fin-nål biopsiprøver, urin, peritonealfluid og pleuralfluid eller celler derfra. Biologiske prøver kan også inkludere snitt av vev slik som frosne snitt tatt for histologisk formål. En biologisk prøve kan også omtales som en pasientprøve.

13 Et protein betyr en polymer av aminosyrerester som er koblet sammen ved hjelp av peptidbindinger. Betegnelsen, som anvendt heri, refererer til proteiner, polypeptider og peptider av en hvilken som helst størrelse, struktur eller funksjon. Typisk vil imidlertid et protein være som har en lengde på minst seks aminosyrer. Dersom proteinet er et kort peptid, vil det ha en lengde som er på omtrent minst 10 aminosyrerester. Et protein kan være naturlig forekommende, rekombinant eller syntetisk, eller hvilken som helst kombinasjon av disse. Et protein kan også omfatte et fragment av et naturlig forekommende protein eller peptid. Et protein kan være et enkelt molekyl eller kan være et multimolekylært kompleks. Betegnelsen protein kan også anvendes for aminosyrepolymerer hvori en eller flere aminosyrerester er en kunstig kjemisk analog av en tilsvarende naturlig forekommende aminosyre. 15 Et fragment av et protein som anvendt heri refererer til et protein som er en del av et annet protein. Fragmenter av proteiner kan f.eks. omfatte polypeptider oppnådd ved å kutte full lengde protein isolert fra dyrkede celler. I en utførelsesform omfatter et proteinfragment minst omtrent seks aminosyrer. I en annen utførelsesform omfatter fragmentet minst omtrent ti aminosyrer. I en ytterligere utførelsesform omfatter proteinfragmentet minst omtrent seksten aminosyrer. 20 Som anvendt heri er et ekspresjonsprodukt et biomolekyl, slik som et protein, som er produsert når et gen i en organisme uttrykkes. Et ekspresjonsprodukt kan omfatte posttranslasjonsmodifikasjoner. 25 Betegnelsen proteinekspresjon refererer til prosessen hvorved en nukleinsyresekvens gjennomgår vellykket transkripsjon og translasjon slik at detekterbare nivåer av aminosyresekvensen eller proteinet uttrykkes. 30 Betegnelsen proteinekspresjonsprofil eller proteinekspresjonssignatur refererer til en gruppe av proteiner som er uttrykt ved en spesiell celletype eller vevstype (f.eks. nevron, koronararterieendotel eller sykt vev), hvor tilstedeværelse av proteiner sett under ett eller den differensierte ekspresjon av slike proteiner indikerer/varsler om en bestemt tilstand. 35 Betegnelsen antistoff betyr et immunoglobulin, enten naturlig eller delvis eller fullstendig syntetisk produsert. Alle derivater derav som bibeholder spesifikk bindingsevne er også inkludert i betegnelsen. Betegnelsen dekker også et hvilket som helst protein som har et bindingsdomene som er homologt med eller stort sett homologt

14 13 med et immunoglobulin bindingsdomene. Et antistoff kan være monoklonalt eller polyklonalt. Antistoffet kan være et medlem av en hvilken som helst immunoglobulinklasse, som inkluderer hvilken som helst av de humane klassene: IgG, IgM, IgA, IgD og IgE Betegnelsen antistoff fragment refererer til et hvilket som helst derivat av et antistoff som er mindre enn full lenge. I ett aspekt bibeholder antistoff fragmentet minst en signifikant del av full lengde antistoffets spesifikke bindingsevne spesifikt, som en bindingspartner. Eksempler på antistoff fragmenter inkluderer, men er ikke begrenset til, Fab, Fab, F(ab ) 2, scfv, Fv, dsfv diabody og Fd fragmenter. Antistoff fragmentet kan fremstilles ved hjelp av hvilke som helst midler. Antistoff fragmentet kan f.eks. forenes enzymatisk eller produseres kjemisk ved fragmentering av et intakt antistoff eller kan produseres rekombinant fra et gen som koder for den delvise antistoffsekvensen. Alternativt kan antistoff fragmentet være fullstendig eller delvis syntetisk produsert. Antistoff fragmentet kan omfatte et enkelt kjede antistoff fragment. I en annen utførelsesform kan fragmentet omfatte multiple kjeder som er koblet sammen ved f.eks. disulfidbindinger. Fragmenter kan også omfatte et multimolekylært kompleks. Et funksjonelt antistoff fragment kan typisk omfatte minst omtrent 50 aminosyrer, og mere typisk vil det omfatte minst omtrent 200 aminosyrer Bestemmelse av genekspresjonsprofiler Den etterfølgende metode ble anvendt for å identifisere og validere genekspresjonsprofiler som er en indikasjon på om pasienten vil respondere på behandling med en EGFR-TK inhibitor. Andre metoder for å identifisere gen- og/eller protein-ekspresjonsprofiler er kjent; og hvilke som helst av disse alternative metoder kan også anvendes. Se f.eks. Chen et al., NEJM, 356(1):11-20 (2007); Lu et al., PLOS Med., 3(12):e467 (2006); Golub et al., Science, 286: (1999) Den foreliggende metode benytter parallell testing hvori, i ett spor, de gener som er over-/underuttrykt sammenlignet med normale (ikke cancerøse) vevsprøver identifiseres, og i et andre spor, identifiseres de gener som omfatter kromosomale insersjoner eller delesjoner sammenlignet med normale prøver, fra de samme prøvene. Disse to spor i analysene produserer to sett med data. Dataene analyseres ved anvendelse av en algoritme som identifiserer genene til genekspresjonsprofilen (dvs. de gener som er differensielt uttrykt i cancervev). Positive og negative kontroller kan benyttes for å normalisere resultatene, som inkluderer eliminering av de gener og

15 14 proteiner som også er differensielt uttrykt i normale vev fra de samme pasienter, og bekreftelse av at genekspresjonsprofilen er unik for canceren av interesse I det foreliggende tilfellet, som et innledende trinn, ble biologiske prøver fra omtrent tohundreogfemti (250) pasienter som var rammet av NSCLC oppnådd. Omtrent femhundre (500) vevsceller oppnådd fra NSCLC cancerpasienter ble anvendt, som inkluderer tumorvev og nærliggende normalt (ikke sykt) lungevev. Vevsprøvene ble oppnådd fra pasienter som led av forskjellige stadier av NSCLC cancer. Prøvene inkluderte tumorvev fra pasienter som var blitt behandlet med erlotinib og gefitinib, hvor noen av pasientene var respondere på disse forbindelsene og andre var ikke respondere. Klinisk informasjon assosiert med hver prøve som inkluderer behandling med erlotinib eller gefitinib og utkommet av behandlingen (f.eks. lengde på overlevelse), ble registrert i en database. Klinisk informasjon inkluderer også informasjon slik som alder, kjønn, medisinsk historie, behandlingshistorie, symptomer, familiehistorie, tilbakefall (ja/nei), osv. Kontrollprøver som inkluderer prøver av normalt (ikke-cancerholdig) lungevev fra de samme pasientene, og andre typer av cancervev fra andre pasienter (f.eks. fra et respiratorisk vev) ble også oppnådd. Prøver fra normalt ikke-sykt lungevev fra en gruppe friske individer ble anvendt som positive kontroller, tumorprøver fra NSCLC pasienter som var ikke-respondere på erlotinib eller gefitinib terapi ble anvendt som negative kontroller Genekspresjonsprofiler (GEP er) ble deretter dannet fra de biologiske prøvene basert på totalt RNA i henhold til vel etablerte metoder. Kort involverer en typisk metode isolering av totalt RNA fra den biologiske prøve, amplifisering av RNA, syntetisering av cdna, merking av cdna med en detekterbar markør, hybridisering av cdna med en genomisk array, slik som Affymetrix U133 GeneChip, og bestemmelse av binding av merket cdna med den genomiske array ved å måle intensiteten av signalet fra den detekterbare markør bundet til arrayen. Se f.eks. metoden som beskrevet i Lu, et al., Chen, et al. og Golub, et al., supra, og referansene angitt deri. De oppnådde ekspresjonsdataene er matet inn i en database. 35 MRNA er i vevsprøvene kan analyseres ved å anvende kommersielt tilgjengelige eller tilpassede prober eller oligonukleotid-arrayer, slik som cdna- eller oligonukleotidarrayer. Anvendelsen av disse arrayer tillater måling av steady-state mrna nivåer av tusener av gener samtidig, for derved å presentere et kraftig verktøy for å identifisere effekter slik som inntreden, stans eller modulering av ukontrollert celleproliferasjon. Hybridisering og/eller binding av probene på arrayene til nukleinsyrene av interesse

16 15 5 fra cellene kan bestemmes ved å detektere og/eller måle stedet og intensiteten til signalet som mottatt fra den merkede prøve eller anvendt for å detektere en DNA/RNA sekvens fra prøven som hybridiserer til en nukleinsyresekvens ved et kjent sted på mikroarrayen. Intensiteten til signalet er proporsjonalt med mengden av cdna eller mrna til stede i prøvevevet. En rekke arrayer og teknikker er tilgjengelige og anvendbare. Metoder for å bestemme gen- og/eller protein-ekspresjon i prøvevev er f.eks. beskrevet i U.S. patent nr ; U.S. patent nr ; U.S. patent nr og U.S. patent nr og i Wang et al., J. Clin. Oncol., 22(9): (2004); Golub et al, (supra); og Schena et al., Science, 270: (1005) Genanalyseaspektet som benyttes i den foreliggende metode undersøker genekspresjon så vel som insersjons-/delesjonsdata. Som et første trinn ble RNA isolert fra vevsprøvene og merket. Parallelle prosesser ble kjørt på prøvene for å utvikle to grupper av data: (1) over-/underekspresjon av gener basert på mrna nivåer; og (2) kromosomale insersjons-/delesjonsdata. Disse to grupper av data ble deretter korrelert ved hjelp av en algoritme. Over-/underekspresjon av genene i hver cancervevprøve ble sammenlignet ved genekspresjon i normale (ikke-cancerholdige) prøver, og en undergruppe av gener som var forskjellig uttrykt i cancervevet ble identifisert. Foretrukket skjelnes nivåer av opp- og nedregulering basert på ganger forandringer av intensitetsmålinger av hybridiserte mikroarray prober. En forskjell på 2,0 ganger eller større er foretrukket for å gjøre slike distinksjoner, eller en p-verdi som er mindre enn omtrent 0,05. Det vil si at før et gen sies å være differensielt uttrykt i syke versus normale celler, er den syke cellen funnet til å gi minst omtrent 2 ganger større eller mindre intensitet av ekspresjon enn de normale cellene. Generelt, desto større forskjell (eller desto lavere p-verdi), desto mere foretrukket er genet for anvendelse som et diagnostisk eller prognostisk verktøy. Gener valgt for gensignaturene ifølge den foreliggende beskrivelse har ekspresjonsnivåer som resulterer i dannelsen av et signal som kan skjelnes fra dem til de normale eller ikke-modulerte genene ved en mengde som overskrider bakgrunnen ved anvendelse av kliniske laboratorieinstrumenter Statistiske verdier kan anvendes for konfidensielt å skjelne modulerte fra ikkemodulerte gener og støy. Statistiske tester kan identifisere genene som er mest signifikant differensielt uttrykt mellom diverse grupper av prøver. Student s t-testen er et eksempel på en robust statistisk test som kan anvendes for å finne signifikante forskjeller mellom to grupper. Desto lavere p-verdi, desto mere uimotståelig er beviset for at genet viser en forskjell mellom de forskjellige gruppene. Uansett, siden mikroarrayer tillater måling av mere enn ett gen av gangen, kan titusener av statistiske

17 16 5 tester spørres på en gang. På grunn av dette, er det usannsynlig å observere små p- verdier tilfeldig, og justeringer ved å anvende en Sidak korreksjon eller et lignende trinn så vel som et randomiseringsforsøk/permutasjonsforsøk kan gjennomføres. En p- verdi som er mindre enn omtrent 0,05 ved t-testen er et bevis på at ekspresjonsnivået for genet er signifikant forskjellig. Mere overbevisende bevis er en p-verdi som er mindre enn omtrent 0,05 etter at Sidak korreksjonen er innfaktorert. For et stort antall prøver i hver gruppe, er en p-verdi som er mindre enn omtrent 0,05 etter randomiseringstesten/permutasjonstesten det mest overbevisende bevis på en signifikant forskjell En annen parameter som kan anvendes for å selektere gener som genererer et signal som er større enn det til det ikke-modulerte gen eller støy er målingen av absolutt signalforskjell. Signalet dannet ved de forskjellig uttrykte gener avviker foretrukket ved minst omtrent 20 % fra dem til det normale eller ikke-modulerte gen (på en absolutt basis). Det er enda mere foretrukket at slike gener gir ekspresjonsmønstre som er minst omtrent 30 % forskjellige fra dem hos normale eller ikke-modulerte gener Denne differensielle ekspresjonsanalysen kan gjennomføres ved å anvende, kommersielt tilgjengelige arrayer, f.eks. Affymetrix U133 GenChip arrays (Affymetrix, Inc., Disse arrayer har probe-sett for hele det humane genom immobilisert på chipen, og kan anvendes for å bestemme opp- og nedregulering av gener i testprøver. Andre substrater som festet derpå har human genomisk DNA eller prober i stand til å detektere ekspresjonsprodukter, slik som dem tilgjengelig fra Affymetrix, Agilent Technologies, Inc. ( eller Illumina, Inc. ( kan også anvendes. Aktuelle foretrukne gen-mikroarrayer for anvendelse i den foreliggende beskrivelse inkluderer Affymetrix U133 GeneChip arrayer og Agilent Technologies genomic cdna mikroarrayer. Instrumenter og reagenser for å gjennomføres genekspresjonsanalyse er kommersielt tilgjengelig. Se f.eks. Affymetrix GeneChip System ( Ekspresjonsdata oppnådd fra analysen blir deretter matet inn i databasen. 35 I den andre gren av den foreliggende metoden, blir kromosomale insersjons/delesjonsdata for genene i hver prøve sammenlignet med prøver fra normalt vev oppnådd. Insersjons/delesjonsanalysene ble generert ved å anvende en array-basert sammenlignende genomisk hybridisering ( CGH ). Array CGH måler kopiantallvariasjoner ved multiple loci samtidig, og tilveiebringer et viktig verktøy for å studere cancer og ut-

18 17 5 viklingsmessige lidelser og for å utvikle diagnostisk og terapeutiske mål. Mikrochiper for å gjennomføre array CGH er kommersielt tilgjengelige, f.eks. fra Agilent Technologies. Agilent chipen er en kromosomal array som viser lokalisering av gener på kromosomene og tilveiebringer ytterligere data for gensignaturen. Insersjons/delesjonsdata fra denne testing er inndata i databasen. Analysene gjennomføres på de samme prøvene fra de samme pasientene for å danne parallelle data. De samme chiper og prøvepreparat anvendes for å redusere variabilitet Ekspresjonen av bestemte gener kjent som referansegener, kontrollgener eller husholdningsgener bestemmes også, foretrukket samtidig, som et middel for å sikre påliteligheten til ekspresjonsprofilen. Referansegener er gener som uttrykkes konsistent i en rekke vevstyper, som inkluderer cancervev og normalt vev, og er således anvendbare for å normalisere genekspresjonsprofiler. Se f.eks. Silvia et al., BMC Cancer, 6:200 (2006); Lee et al., Genome Research, 12(2): ; Zhang et al., BMC Mol Biol., 6:4 (2005): Bestemmelse av ekspresjonen av referansegener parallelt med genene i den unike genekspresjonsprofilen tilveiebringer ytterligere forsikring om at teknikkene som anvendes for å bestemme genekspresjonsprofilen fungerer riktig. Hvilke som helst referansegener kan anvendes i forbindelse med den foreliggende fremgangsmåte og analyse, som inkluderer f.eks. ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0 og/eller TRFC Datakorrelasjon De forskjellige ekspresjonsdata og insersjons/delesjonsdataen i databasen korreleres med informasjonen om klinisk resultat assosiert med hver vevsprøve også i databasen ved hjelp av en algoritme for å bestemme en genekspresjonsprofil for å bestemme terapeutisk effektivitet av irinotecan, så vel som sent tilbakefall av sykdom og/eller sykdomsrelatert død assosiert med irinotekan terapi. Forskjellige algoritmer er tilgjengelige som er anvendbare for å korrelere dataene og identifisere de spådde gensignaturene. Algoritmer slik som dem identifisert i Xu et al., A Smooth Response Surface Algorithm For Constructing A Gene Regulatory Network, Physiol. Genomics 11:11-20 (2002), kan f.eks. anvendes. 35 En annen metode for å identifisere genekspresjonsprofiler er gjennom anvendelsen av optimaliseringsalgoritmer slik som gjennomsnittlig varians algoritmen som er omfattende anvendt for å etablere stam-porteføljer. En slik metode er detaljert beskrevet

19 18 5 i US patentsøknad nr. 2003/ Metoden krever hovedsakelig etablering av et sett med inndata-ekspresjon som målt ved intensitet som vil optimalisere returen (signalet som er dannet) man mottar for å anvende den mens variabiliteten av returen minimaliseres. Algoritmen beskrevet i Irizarry et al., Nucleic Acids Res., 31:e15 (2003) kan også anvendes. Den for tiden foretrukne algoritmen er JMP Genomics algoritmen tilgjengelig fra JMP Software ( Prosessen ved å selektere genekspresjonsprofiler kan også inkludere anvendelsen av heuristiske regler. Slike regler er formulert på grunnlag av biologi og en forståelse av teknologien som anvendt for å produsere kliniske resultater, og anvendes på utbyttet fra optimaliseringsmetoden. Gjennomsnittlig varians metoden for gensignaturidentifikasjon kan f.eks. anvendes på mikroarray data for en rekke gener differensielt uttrykt i individer med cancer. Utbyttet fra metoden vil være et optimalisert sett av gener som kan inkludere noen gener som uttrykkes i perifert blod så vel som i sykt vev. Dersom prøver anvendt i testmetoden oppnås fra perifert blod og bestemte gener differensielt uttrykt i tilfeller av cancer også kan uttrykkes differensielt i perifert blod, da kan en heuristisk regel anvendes hvori en portefølje velges fra den effektive grense som utelukker dem som er differensielt uttrykt i perifert blod. Regelen kan selvfølgelig anvendes før dannelsen av den effektive grensen ved f.eks. å anvende regelen under data-preseleksjon. 25 Andre heuristiske regler kan anvendes som ikke nødvendigvis er relatert til den aktuelle biologien. Man kan f.eks. anvende en regel om at kun en viss prosentandel av porteføljen kan representeres ved et spesielt gen eller gruppe av gener. Kommersielt tilgjengelig software slik som Wagner software vil lett tilpasse disse typer av heuristiske regler (Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application, Dette kan f.eks. være anvendbart når faktorer annet enn nøyaktighet og presisjon har en innvirkning på ønsket om å inkluderer ett eller flere gener Som et eksempel kan algoritmen anvendes for å sammenligne genekspresjonsprofiler for forskjellige gener (eller porteføljer) for å tilskrive prognoser. Genekspresjonsprofilene for hvert av genene som omfatter porteføljen fikseres i et medium slik som et computer lesbart medium. Dette kan ha en rekke former. En tabell kan f.eks. etableres hvori området av signaler (f.eks. intensitetsmålinger) som indikerer sykdom er input. Aktuelle pasientdata kan deretter sammenlignes med verdiene i tabellen for å bestemme om pasientprøvene er normale eller syke. I et mere sofistikert aspekt blir

20 mønstrene for ekspresjonssignalene (f.eks. fluorescensintensitet) målt digitalt eller grafisk. Genekspresjonsmønstrene fra genporteføljene anvendt sammen med pasientprøvene sammenlignes deretter med ekspresjonsmønstrene. Software for mønstersammenligning kan deretter anvendes for å bestemme om pasientprøvene har et mønster som er indikasjon på at sykdommen vil vende tilbake. Disse sammenligninger kan selvfølgelig også anvendes for å bestemme om pasienten ikke har sannsynlighet for å få tilbakefall av sykdommen. Ekspresjonsprofilen for prøvene sammenlignes deretter med profilen til en kontrollcelle. Dersom prøveekspresjonsmønstrene er konsistente med ekspresjonsmønsteret for tilbakevending av cancer, da (i fravær av kompenserende medisinske betraktninger) behandles pasienten som man ville behandle en pasient med tilbakefall. Dersom prøveekspresjonsmønstrene er konsistente med ekspresjonsmønsteret fra den normale cellen/kontrollcellen da blir pasienten diagnostisert som negativ for canceren En metode for å analysere gensignaturene hos en pasient for å bestemme prognose av cancer er gjennom anvendelsen av et Cox hazard analyseprogram. Analysen kan gjennomføres ved å anvende S-Plus software (kommersielt tilgjengelig fra Insightful Corporation, Ved å anvende slike metoder blir en genekspresjonsprofil sammenlignet med den for en profil som sikkert representerer tilbakefall (dvs. ekspresjonsnivåer for kombinasjonen av gener i profilen er indikasjon på tilbakefall). Cox hazard modellen med den etablerte terskelverdien anvendes for å sammenligne likheten for de to profilene (kjent tilbakefall versus pasient) og deretter bestemmes om pasientprofilen overskrider terskelverdien. Dersom den gjør det, da klassifiseres pasienten som en som vil få tilbakefall og gis behandling slik som adjuvansterapi. Dersom pasientprofilen ikke overskrider terskelverdien, da klassifiseres pasienten som en som ikke får tilbakefall. Andre analytiske verktøy kan også anvendes for å svare på det samme spørsmål slik som lineær diskriminat analyse, logistisk regresjon og neural nettverk metoder. Se f.eks. software tilgjengelig fra JMP statistisk software ( 30 En rekke andre velkjente metoder for gjenkjennelse av mønstre er tilgjengelige. De etterfølgende referanser tilveiebringer noen eksempler: 35 Weighted Voting : Golub, T R., Slonim, D K., Tamaya, P., Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov, J P., Coller, H., Loh, L., Downing, J R., Caligiuri, M A., Bloomfield, C D., Lander, E S. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286: , 1999.

21 20 5 Support Vector Machines : Su, A I., Welsh, J B., Sapinoso, L M., Kern, S G., Dimitrov, P., Lapp, H., Schultz, P G., Powell, S M., Moskaluk, C A., Frierson, H F. Jr., Hampton, G M. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Research 61: , Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: , K-nearest Neighbors : Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: , Correlation Coefficients : van t Veer L J, Dai H, van de Vijver M J, He Y D, Hart A, Mao M, Petersen H L, van der Kooy K, Marton M J, Witteveen A T, Schreiber G J, Kerkhoven R M, Roberts C, Linsley P S, Bernards R, Friend S H. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer, Nature Jan. 31:415 (6871): Genekspresjonsanalysene identifiserer en genekspresjonsprofil (GEP) som er unik for cancerprøvene, dvs. de gener som er forskjellig uttrykt ved cancercellene. Denne GEP valideres deretter, f.eks. ved å anvende sanntid kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR), som kan gjennomføres ved å anvende kommersielt tilgjengelige instrumenter og reagenser, slik som dem som er tilgjengelige fra Applied Biosystems ( I det foreliggende tilfellet viste resultatene fra genekspresjonsanalysene at i NSCLC cancerpasienter som responderte på behandling med en EGFR-TK inhibitor, er genene som koder for p70s6k, fosfo-s6, fosfo-akt, fosfo-mtor, fosfo-pten, EGFR, fosfo-er, fosfo-ar, AIK, osteopontin, MMP11 og GFAP oppregulert (overuttrykt) og genene som koder for fosfo-p70s6k, fosfor MEK, fosfor MAPK, fosfo-igfr/lnr, fosfo-egfr og fosfo- HER2/ErbB2 er nedregulert (underuttrykt) i pasienter som responderer på EGFR-TK inhibitorer, sammenlignet med ekspresjon av disse gener i normale lungevevsprøver fra disse pasienter, og fra de negative kontrollpasienter, dvs. vevsprøver fra pasienter

22 21 som hadde erfart et tilbakefall av deres cancer etter behandling med en EGFR-TK inhibitor. Referansegener som anvendes i den foreliggende beskrivelse, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0 og TRFC ble alle oppregulert Bestemmelse av proteinekspresjonsprofiler Ikke alle gener uttrykt ved en celle translateres til proteiner og derfor, når en GEP er blitt identifisert, er det ønskelig å fastslå om proteiner som svarer til noen av alle av de differensielt uttrykte genene i GEP også uttrykkes differensielt ved de samme celler eller vev. Proteinekspresjonsprofiler (PEP er) dannes derfor fra den samme canceren og kontrollvev anvendt for å identifisere GEP ene. PEP er anvendes også for å bekrefte GEP i andre koloncancerpasienter. 15 Den foretrukne metoden for å danne PEP er ifølge den foreliggende beskrivelse er ved immunohistokjemi (IHC) analyse. I denne metode anvendes antistoffer som er spesifikke for proteinene i PEP for å utspørre vevsprøver fra cancerpasienter. Andre metoder for å identifisere PEP er er kjent, f.eks. in situ hybridisering (ISH) ved anvendelse av proteinspesifikke nukleinsyreprober. Se f.eks. Hofer et al., Clin Can. Res., 11(16):5722 (2005); Volm et al., Clin. Exp. Metas., 19(5):385 (2002). Hvilken som helst av disse alternative metoder kan også anvendes I det foreliggende tilfelle ble prøver av tumorvev og normalt vev oppnådd fra pasienter som var rammet av NSCLC og som hadde gjennomgått vellykket behandling med gefitinib eller med 5-FU, docetaksal eller cisplatin, hvor disse er de samme prøvene som anvendes for å identifisere GEP. Vevsprøvene ble arrayet på vevs-mikroarrayer (TMA er) for å muliggjøre simultananalyse. TMA er består av substrater, slik som preparatglass, på hvilke opp til omtrent 1000 separate vevsprøver er samlet på arraymåte for å tillate samtidig histologisk analyse. Vevsprøvene kan omfatte vev oppnådd fra lagrede biopsiprøver, f.eks. frosne vev eller vev innlemmet i paraffin. Teknikker for å fremstille vevs-mikroarrayer er vel kjent innen teknikken. Se f.eks. Simon et al., BioTechniques, 36(1): (2004); Kallioniemi et al, WO 99/44062; Kononen et al., Nat. Med., 4: (1998). I det foreliggende tilfelle, ble en hul nål anvendt for å fjerne vevskjerner ned til 0,6 mm i diameter fra områder av interesse i paraffinomsluttede vev. Områder av interesse er dem som er blitt identifisert av en patolog til å inneholde det ønskede syke eller normale vev. Disse vevskjerner ble deretter innført i en resipient paraffinblokk i et nøyaktig avstandsmessig arraymønster. Snitt fra denne blokken ble kuttet ved å anvende en mikrotom, anbrakt på et mikroskopglass og deretter analysert ved hjelp av standard biologisk analyse. Hver mikroarray