Oversikt over kap. 11. Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer. Fire klasser av DNA polymorfismer.

Save this PDF as:

WORD PNG TXT JPG

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "Oversikt over kap. 11. Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer. Fire klasser av DNA polymorfismer."

Sunniva Hetland
3 år siden
Visninger:

Transkript

1 Kap. 11 Den direkte påvisning av genotype skiller individuelle genomer Oversikt over kap. 11 Fire klasser av DNA variasjon til direkte påvisning av genotype. Metoder som bruker hybridisering, elektroforese, PCR, mikromatrise og sekvensering Posisjonskloning Hvordan undersøke gener for kompleks arvegang Haplotype assosiasjonstudier brukes til å kartlegge sykdomsloki Høgskolen i Oslo Medlemmer av den samme art viser enorm sekvensvariasjon i sine genomer 1 av 1000 bp er forskjellige i to tilfeldig valgte mennesker Siden det haploide genom er bp, er det 3 millioner forskjeller mellom to tilfeldig valgte individer De fleste differanser er i ikke-kodende, ikke-regulatoriske områder Allel enhver variasjon i genomet ved en spesiell lokalisering (lokus) Polymorf to eller flere alleler ved et lokus Polymorfisme den spesielle variasjon DNA markør polymorft lokus som er nyttig til kartleggingsstudier og sykdomsdiagnose Anonymt lokus position på genomet uten en kjent funksjon Fire klasser av DNA polymorfismer Enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) Enkelt basepar substitusjon Oppstår ved mutagene kjemikalier eller feil under replikasjonen Biallelisk bare to alleler Fordeling av alleler varierer fra 1:100 to 50: over 5 millioner humane SNPer identifisert De fleste skjer på anonyme loki Mutasjonsgrad på 1 X 10-9 per lokus per generasjon Veldig få er derfor nye mutasjoner i arten Nyttige som DNA markører Fig Mikrosatelitter I hvert 30,000 bp Repeterte enheter med en lengde på 2 5 bp Muteres ved replikasjonsfeil Mutasjons grad på 10-3 per lokus per gamete Nyttige som høyt polymorfe DNA markører 1

sykdomsloki Høgskolen i Oslo Medlemmer av den samme art viser enorm sekvensvariasjon i sine genomer 1 av 1000 bp er forskjellige i to tilfeldig valgte mennesker Siden det haploide genom er 3 10 9 bp,

2 Minisatlitter Repeterte enheter på bp lengde Total lengde på kb 1 per 100,000 bp, eller omkring 30,000 i hele genomet Delesjoner, duplikasjoner og innskudd Forlenger eller forkorter lengden av ikkerepetert DNA Små delesjoner og duplikasjoner skjer ved ulik overkrysning Små innskudd kan også forårsakes av transposable elementer Mye mindre vanlig enn andre polymorfismer Fig SNP påvisning ved bruk av southern blot Restriksjons Fragment Lengde Polymorfisme (RFLPs) er størrelses forandringer som skyldes tap eller økning av restriksjonsseter Figure 11.5 Fig SNP påvisning ved PCR Må kjenne sekvens på begge sider av polymorfismen Oppformer fragment Utsett det for restriksjonsenzym Utfør gelelektroforese F.eks, sigdcelle genotyping med en PCR basert metode Fig SNP påvisning ved ASO Fig Veldig korte spesifikke prober (<21 bp) som hybridiserer til det ene eller andre allelet Slike prober kalles allel-spesifikke oligonucleotider (ASOer) 2

ulik overkrysning Små innskudd kan også forårsakes av transposable elementer Mye mindre vanlig enn andre polymorfismer Fig. 11.

3 ASOer kan bestemme genotype ved ethvert SNP lokus Hybridized and labeled with ASO for allele 1 Hybridized and labeled with ASO for allele 2 Fig a-c Fig d, e Stor-skala multipleks ASO analyse med mikromatrise kan påvise BRCA1 mutasjoner Primer utvidelser til å påvise SNPer Fig Hver kolonne inneholder en ASO som skiller seg ut bare ved nukleotidposisjonen som analyseres BRCA1 DNA fra hvilket som helst allel kan bare være en av de fire ASOer I en kolonne Heterozygote påvises lett Fig Mikrosatelittallel påvisning analyse av størrelsesforskjeller Huntington s sykdom er et eksempel på en mikrosatelitt triplett repetisjon i et kodende område Fig

9 d, e Stor-skala multipleks ASO analyse med mikromatrise kan påvise BRCA1 mutasjoner Primer utvidelser til å påvise SNPer Fig. 11.

4 Minisatellite påvisning og DNA fingeravtrykk 1985 Gjorde Alec Jeffreys to nøkkeloppdagelser Hvert minisatelittlokus er sterkt polymorft De fleste minisatelitter finnes på flere steder rundt omkring på genomet DNA fingeravtrykk mønster for simultane genotyper for en gruppe ukoblede loki Bruk restriksjonsenzymer og southern blotting til å påvise lengdeforskjeller ved minisatelittloki De nyttigste minisatelitter har seter rundt omkring på genomet og kan analyseres på gel Fig Minisatelitt analyse DNA fingeravtrykk kan identifisere individer og bestemme foreldreskap E.g., DNA fingeravtrykk bekreftet at sauen Dolly var klonet fra en voksen jurcelle Donor jur (U), celle kultur fra jur (C), Dolly s blod celle DNA (D), og kontroll sau 1-12 Posisjons kloning bruk av polymorfe DNA markører til å klone gener via kobling Et stamtre av den kongelige familie som nedstammer fra dronning Victoria Her segregeres hemophilia A Fig a Fig Blod-koagulasjonskaskade hvor åreskade forårsaker en kaskade av inaktive faktorer til å bli konvertert til aktive faktorer Blodprøver bestemmer om den aktive formen av hver faktor i kaskaden er tilstede Fig b Fig c 4

minisatelitter har 10 20 seter rundt omkring

5 Teknikker som ble brukt til å rense Factor VIII og klone genet Fig d Posisjonskloning trinn 1 Finn storfamilier hvor sykdommen segregerer Bruk et panel av polymorfe markører spredd med 10 cm intervaller over alle kromosomene 300 markører totalt Bestem genotype for alle individer i familier for hver DNA markør Se etter kobling mellom en markør og sykdommens fenotype Fig Når området på kromosomet er identifisert, blir en høyoppløselig kartlegging utført med flere markører for å innsnevre området hvor genet kan ligge Posisjonskloning Trinn 2 identifisering av kandidat gener Når området på kromosomet er blitt innsnevret ved koblingsanalyse til 1000 kb eller mindre, blir alle gener innen området identifisert Kandidat gener Vanligvis omkring 17 gener per 1000 kb fragment Identifiser kodende områder» Datamaskinanalyser til å identifisere konserverte sekvenser mellom arter» Datamaskinanalyseer til å identifisere exon-liknende sekvenser ved å bruke ORFer, og spleise seter» Tilsynekomst av en eller flere EST cloner avledet fra cdna Datamaskinanalyse av genomiske sekvenser for å identifisere kandidatgener Fig Gen uttrykningsmønstre kan peke ut kandidat gener Se i offentlige databaser over EST sekvenser som representerer spesielle vev Northern blot RNA transkripter i cellene til et spesielt vev (e.g., med sykdom) separeres ved elektroforese og probes med kandidatgensekvensen 5

for alle individer i familier for hver DNA markør Se etter kobling mellom en markør og sykdommens fenotype Fig. 11.

6 Northern blot eksempel som viser SRY kandidat for testikkelbestemmende faktor som blir uttrykt i testikler, men ikke lunger eggstokker eller nyrer Posisjonskloning Trinn 3 Fig Finn genet som er ansvarlig for fenotypen Uttrykningsmønstre» RNAutrykning analyseres ved Northern blot eller PCR oppformering av cdna med primere som er spesifikke for kandidat transkriptet» Se etter misuttrykning (Ingen utrykning, under utrykning overutrykning) Sekvens forskjeller» Missens mutasjoner identifisert ved sekvensering av kodentde områder til kandidatgener fra normale og unormale individer Transgen modifisering av fenotype» Innsett mutant genet i en modell organisme Transgen analyse kan bevise at kandidat genet er sykdomslokkuset Eksempel: Posisjonskloning av Cystic Fibrose Genet Koblingsanalyse plasserer CF på kromosom 7 Fig Fig a Northern blot analyse avslører at bare ett av kandidatgenene blir utrykt i lunger og bukspyttkjertel Hver CF pasient har et mutert allel av DFTR genet på begge kromosom 7 homologer Lokalisering og antall mutasjoner er indikert under diagrammet av kromosomet Fig c Fig b 6

etter misuttrykning (Ingen utrykning, under utrykning overutrykning) Sekvens forskjeller» Missens mutasjoner identifisert ved sekvensering av kodentde områder til kandidatgener fra normale og

7 CFTR er et membran protein. TMD-1 and TMD-2 er transmembran domener. Fig d Bevis for at CFTR er det rette genet Fenotype eliminerer genfunksjon Kan ikke bruke transgen teknologi Istedet utføre CRFT gen knockout i mus for å undersøke fenotypen uten CRFT genet Målrettet mutagenese» Introduser mutant CFTR inn i muse embryoniske celler i kultur» Sjeldne doble rekombinater med homologe villtype CFTR gener selekteres» Mutantceller blir satt inn i normale museembryo hvor de settes inn I kjønnscellene» Knockout mus er blitt skapt 7

knockout i mus for å undersøke fenotypen uten CRFT genet Målrettet mutagenese» Introduser mutant CFTR inn i muse embryoniske celler i

Like dokumenter

Genkartlegging. Hva er egentlig et genkart? Genetisk og fysisk kartlegging

Genkartlegging. Hva er egentlig et genkart? Genetisk og fysisk kartlegging NTNU Genkartlegging 1 Termin IC Frank Skorpen Institutt for laboratoriemedisin, barne- og kvinnesykdommer Hva er egentlig et genkart? Kartet over det humane genom gir oss posisjonen av de ca 25,000 genene