(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 16/28 (06.01) A61P 3/00 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato..27 () Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Bristol-Myers Squibb Company, Route 6 and Province Line Road, Princeton, NJ 0840, USA Pfizer Inc., 23 East 42nd Street, New York, NY 017, USA (72) Oppfinner MIN, Jing, 19 Nooning Tree Court, Chesterfield, MO 617, US-USA WU, Yanli, 132 Kiefer Bluffs Drive, Ballwin, MO 621, US-USA FINN, Rory, Francis, 976 Sunburst Court, Manchester, MO 621, US-USA THIELE, Barrett, Richard, 619 Dantonaire Place, Saint Louis, MO 63128, US-USA LIAO, Wei, Hillcrest Meadow Drive, Chesterfield, MO 60, US-USA GLADUE, Ronald, Paul, 83 Rowley Drive, Stonington, CT 06378, US-USA RAJPAL, Arvind, 19 Foerster Street, San Francisco, CA 94127, US-USA PARADIS, Timothy, Joseph, Beaver River Road, Richmond, RI 02892, US-USA BRAMS, Peter, th Avenue, Sacramento, CA 981, US-USA DEVAUX, Brigitte, 3 Duluth Circle, Palo Alto, CA 946, US-USA WU, Yi, 1339 Kennedy Drive, Milpitas, CA 903, US-USA TOY, Kristopher, 1694 Ambergrove Drive, San Jose, CA 9131, US-USA LEBLANC, Heidi, N., 649 Church Street, Mountain View, CA 94041, US-USA HUANG, Haichun, 4329 Crestwood Street, Fremont, CA 9438, US-USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Bindingsmolekyler for den humane OX40 reseptoren (6) Anførte publikasjoner WO-A-03/6498 WO-A-07/06224 WO-A-99/428 BALINT R F ET AL: "Antibody engineering by parsimonious mutagenesis", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 1, 27 December 1993 ( ), pages 9-118, XP , ISSN: , DOI:.16/ (93)9028- [retrieved on ] KJAERGAARD J ET AL: "Augmentation versus inhibition: effects of conjunctional OX-40 receptor monoclonal antibody and IL-2 treatment on adoptive immunotherapy of advanced tumor." JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD. : 190) 1 DEC 01, vol. 167, no. 11, 1 December 01 ( ), pages , XP ISSN: KJAERGAARD J ET AL: "Therapeutic efficacy of OX-40 receptor antibody depends on tumor

2 immunogenicity and anatomic site of tumor growth." CANCER RESEARCH 1 OCT 00, vol. 60, no. 19, 1 October 00 (00--01), pages 14-21, XP ISSN: WEINBERG ANDREW D ET AL: "Anti-OX40 (CD134) administration to nonhuman primates: immunostimulatory effects and toxicokinetic study" JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, HAGERSTOWN, MD, US, vol. 29, no. 6, 1 November 06 ( ), pages 7-8, XP ISSN: XIE F ET AL: "Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against human OX40: costimulation of T cells and expression on tumor as well as normal gland tissues." TISSUE ANTIGENS APR 06, vol. 67, no. 4, April 06 (06-04), pages 7-317, XP ISSN:

3 1 Beskrivelse Bakgrunn Den foreliggende beskrivelse angår antistoffer, og særlig antistoffer som binder til OX40-reseptoren. 1 Forsterking av anti-tumor T-cellefunksjon representerer et kraftfullt og nytt syn på cancerbehandling. Avgjørende komponenter involvert med å generere en effektiv antitumor T-cellerespons inkluderer økning av CD4+ hjelper T-celleaktivitet for å fremme dannelsen av anti-tumorcytolytiske T-celler, og tilveiebringe overlevelsessignaler for hukommelses- og effektor T-celler. En viktig reseptor som er blitt vist til å mediere disse responser er OX40-reseptoren, Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Som målsøker effektor T-celle ko-stimulerende molekyl OX40. Nature Rev. Imm. 4: (04), Hori, T. Roller for OX40 i patogenese og kontroll av sykdommer. Intn. J. Hematology. 83: (06). 2 OX40-reseptoren (OX40R) (også kjent som CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT3 og TXGPIL) er et medlem av TNF-reseptorsuperfamilien. OX40R er funnet til å være uttrykt på aktiverte CD4+ T-celler. Høye antall OX40R+ T-celler er blitt vist med tumorer (tumorer som infiltrerer lymfocytter) og i drenerende lymfeknuter hos cancer pasienter (Vetto, J.T. et al Tilstedeværelse av T-celleaktiveringsmarkøren OX40 på tumorinfiltreringslymfocytter og drenering av lymfeknuteceller fra pasienter med melanom og hode- og nakke cancere. Am. J. Surg. 174: 28-26; Weinberg, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: (00); Petty, J. K., et al., Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). Am. J. Surg. 183: (02)). Det ble vist i tumormodeller i mus at engasjement av OX40R in vivo under tumorpriming utsatte og forhindret signifikant tilsynekomsten av tumorer sammenlignet med kontrollbehandlede mus (Weinberg et al., 00). Det er derfor blitt overveiet å øke immunresponsen av et pattedyr overfor et antigen ved å koble inn OX40R gjennom bruken av et OX40R-bindingsmiddel (WO 99/428, Weinberg et al., 00). 3 Oppsummering Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer isolerte bindingsmolekyler som definert i kravene, som binder til den humane OX40R, som inkluderer OX40R-antistoffer, antigenbindingsfragmenter av OX40R-antistoffene, og derivater av OX40R-

4 2 antistoffene. I noen utførelsesformer binder bindingsmolekylene til den humane OX40R med en K D på 1 x 7 M eller mindre, og har agonistaktivitet på den humane OX40R. I noen ytterligere utførelsesformer er bindingsmolekylet et humant monoklonalt antistoff som spesifikt binder til den humane OX40R med en K 0 på 0 nm eller mindre. Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer også en sammensetning som omfatter ett eller flere av bindingsmolekylene som definert i kravene, og en farmasøytisk aksepterbar bærer. I noen utførelsesformer er bindingsmolekylet et humant monoklonalt OX40R-antistoff, eller et antigenbindingsfragment derav. Sammensetningen kan videre omfatte ytterligere farmasøytiske midler, slik som kjemoterapeutiske midler, immunoterapeutiske midler, og hormonelle terapeutiske midler. 1 Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer videre bindingsmolekyler som definert ovenfor, for anvendelse i terapeutiske og diagnostiske metoder. I noen utførelsesformer er den terapeutiske metoden en metode for å behandle eller forebygge cancer i et pattedyr. I noen andre utførelsesformer er den terapeutiske metoden en metode for å øke immunrespons i et pattedyr. I noen særlige utførelsesformer er bindingsmolekylet som anvendes i metodene et humant monoklonalt OX40R-antistoff, eller et antigenbindingsfragment derav. 2 Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer videre nukleinsyremolekyler som koder for en aminosyresekvens i et bindingsmolekyl, vektorer som omfatter slike nukleinsyrer, vertsceller som omfatter vektorene og fremgangsmåter for å fremstille bindingsmolekylene. Beskrivelsen tilveiebringer også andre aspekter, som vil fremkomme fra hele beskrivelsen, som inkluderer kravene. Kort beskrivelse av tegningene Fig. 1a og 1b er diagrammer som viser at antistoff 11D4 spesifikt binder til OX40R; 3 Fig. 2 er et diagram som viser effekten av tverrbundet antistoff 11D4 på OX40Rstimulert luciferaseaktivitet;

5 3 Fig. 3 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på IL-2-produksjon ved alloantigen primede T-celler; Fig. 4 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på anti-cd3-indusert IL-2- produksjon ved primære T-celler; Fig. er en kurve som viser effekten av antistoff 11D4 på anti-cd3-indusert IL-2- produksjon ved cynomolgus primære T-celler; Fig. 6 viser metningsbindingskurver med antistoff 11D4 ved å anvende cynomolgus PBMC er fra 14 donorer stimulert med anti-cd3 og anti-cd28; Fig. 7 viser metningsbindingskurvene med antistoff 11D4 ved å anvende humane PBMC er fra 17 donorer stimulert med anti-cd3 og anti-cd28; 1 Fig. 8 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på vekst av B-celle lymfom Raji i SCID-mus; Fig. 9 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på veksten av B-celle lymfom Raji 21 dager etter tumorinjeksjon; Fig. er et diagram som viser effekten av en enkelt injeksjon av antistoff 11D4 på vekst av prostatatumor PC-3 i SCID-mus; 2 Fig. 11 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på vekst av prostatatumoren PC-3 i SCID-mus 27 dager etter tumorinjeksjon; Fig. 12 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på vekst av kolonkarsinomet LOVO i SCID-mus; Fig. 13 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på veksten av kolonkarsinomet LOVO i SCID-mus 2 dager etter tumorinjeksjon; 3 Fig. 14 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på veksten av brysttumor BT474 i SCID-mus; og

6 4 Fig. 1 er et diagram som viser effekten av antistoff 11D4 på veksten av brysttumor BT474 i SCID-mus. Detaljert beskrivelse Definisjoner Betegnelsen agonist refererer til et bindingsmolekyl, som definert her, som ved binding til OX40R, (1) stimulerer eller aktiverer OX40R, (2) forsterker, øker, fremmer, induserer eller forlenger en aktivitet, funksjon eller tilstedeværelse av OX40R, eller (3) forsterker, øker, fremmer eller induserer ekspresjonen av OX40R Betegnelsen antistoff refererer til et immunoglobulinmolekyl som typisk er sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, hvor hvert par har én lett (L) kjede og én tung (H) kjede. Humane lette kjeder er klassifisert som kappa og lambda lette kjeder. Tunge kjeder er klassifisert som mu, delta, gamma, alfa eller epsilon, og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgM, IgD, IgG, IgA og IgE. Innen de lette og tunge kjeder, er der variable og konstante regioner som er forenet ved en J -region på omtrent 12 eller flere aminosyrer, hvor den tunge kjeden også inkluderer en D -region på omtrent 3 eller flere aminosyrer. Hver tunge kjede omfatter en tung kjede variabel region (forkortet her som HCVR eller V H ) og en tung kjede konstant region. Tung kjede konstant regionen omfatter tre domener, C H 1, C H 2 og C H 3. Hver lette kjede omfatter en lett kjede variabel region (forkortet her som LCVR eller V L ) og en lett kjede konstant region. Lett kjede konstant regionen omfatter ett domene, CL. De konstante regionene av antistoffene kan mediere bindingen av immunoglobulinet til vertsvevet eller faktorer, som inkluderer forskjellige celler i immunsystemet (f.eks. effektorceller) og den første komponenten (C1q) av det klassiske komplementsystemet. V H - og V L -regionene kan ytterligere sub-deles i regioner med hypervariabilitet, betegnet komplementaritetsbestemmende regioner (CDR), innfelt med regioner som er mer konserverte, betegnet rammeregioner (FR). Hver V H og V L er sammensatt av tre CDR er og fire FR er, oppstilt fra aminoterminus til karboksyterminus i den etterfølgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. De variable regionene av henholdsvis hvert tunge/lette kjedepar (V H og V L ) danner antistoffbindingssetet. Tildelingen av aminosyrer til hver region eller domene er i overenstemmelse med definisjonene i Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 og 1991)), eller Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: , Chothia et al. (1989) Nature 342: Betegnelsen antistoff omfatter et antistoff som er del av en

7 antistoffmultimer (en multimer form av antistoffer), slik som dimerer, trimerer eller høyere-ordens multimerer av monomere antistoffer. Den omfatter også et antistoff som er koblet eller festet til, eller på annen måte fysisk eller funksjonelt assosiert med, en ikke-antistoffenhet. Videre er betegnelsen antistoff ikke begrenset til noen spesiell metode for å fremstille antistoffet. Den inkluderer f.eks. blant annet rekombinante antistoffer, monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer. 1 Betegnelsen antistoffderivat eller derivat av et antistoff refererer til et molekyl som er i stand til å binde til det samme antigen (f.eks. OX40R) som antistoffet binder til, og omfatter en aminosyresekvens av antistoffet koblet til en ytterligere molekylær entitet. Aminosyresekvensen til antistoffet som er inneholdt i antistoffderivatet kan være fullengde antistoffet, eller kan være en hvilken som helst del eller deler av et fullengde antistoff. Den ytterligere molekylære entitet kan være et kjemisk eller biologisk molekyl. Eksempler på ytterligere molekylære entiteter inkluderer kjemiske grupper, aminosyrer, peptider, proteiner (slik som enzymer, antistoffer), og kjemiske forbindelser. Den ytterligere molekylære entitet kan ha hvilken som helst anvendbarhet slik som for anvendelse som et deteksjonsmiddel, sporstoff, markør, farmasøytisk eller terapeutisk middel. Aminosyresekvensen til et antistoff kan være festet eller koblet til en ytterligere entitet ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikkekovalent assosiasjon, eller på annen måte. Betegnelsen antistoffderivat omfatter også kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, og molekyler som er avledet fra modifikasjoner av aminosyresekvensene til et OX40R-antistoff, slik som konservering av aminosyresubstitusjoner, addisjoner og insersjoner. 2 3 Betegnelsen antigenbindingsfragment av et antistoff refererer til én eller flere deler av et fullengde antistoff som bibeholder evnen til å binde til det samme antigenet (f.eks.. OX40R) som antistoffet binder til. Betegnelsen antigenbindingsfragment omfatter også den delen av et antistoff som er del av et større molekyl dannet ved kovalent eller ikke-kovalent assosiasjon av antistoffdelen med én eller flere ytterligere molekylære entiteter. Eksempler på ytterligere molekylære entiteter inkluderer aminosyrer, peptider eller proteiner, slik som streptavidinkjerneregionen, som kan anvendes for å danne et tetramerisk scfv-molekyl (Kipriyanov et al., (199) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-1), en cysteinrest, et markørpeptid, eller en C- terminal polyhistidin-tag, som kan anvendes for å fremstille bivalente og biotinylerte scfv-molekyler (Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:47-8).

8 6 Betegnelsen bindingsmolekyl omfatter (1) antistoff, (2) antigenbindingsfragment av et antistoff, og (3) derivater av et antistoff, hver som definert her. Betegnelsen binder til OX40R eller binding til OX40R refererer til binding av et bindingsmolekyl, som definert her, til OX40R i en in vitro analyse, slik som en BIAcore-analyse. Binding betyr en bindingsaffinitet (K D ) på 1 x -6 M eller lavere. Betegnelsen kimært antistoff refererer til et antistoff som omfatter aminosyresekvenser avledet fra to eller flere forskjellige antistoffer. De to eller flere forskjellige antistoffer kan være fra de samme arter, eller fra to eller flere forskjellige arter. 1 Betegnelsen konservativ aminosubstitusjon refererer til substitusjon av en aminosyrerest med en annen aminosyrerest, hvor sidekjede R-gruppene i de to aminosyrerestene har tilsvarende kjemiske egenskaper (f.eks. ladning eller hydrofobisitet). Eksempler på grupper av aminosyrer som har sidekjeder med tilsvarende kjemiske egenskaper inkluderer 1) alifatiske sidekjeder: glysin, alanin, valin, leucin og isoleucin; 2) alifatisk-hydroksyl sidekjeder: serin og treonin; 3) amidinneholdende sidekjeder: asparagin og glutamin; 4) aromatiske sidekjeder: fenylalanin, tyrosin og tryptofan; ) basiske sidekjeder: lysin, arginin og histidin; 6) sure sidekjeder: asparaginsyre og glutaminsyre; og 7) svovelinneholdende sidekjeder: cystein og metionin. Konservative aminosyresubstitusjonsgrupper kan f.eks. være valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamataspartat og asparagin-glutamin. 2 3 Betegnelsen epitop refererer til den delen av et antigen som er i stand til spesifikk binding til et antistoff eller T-cellereseptor, eller som på annen måte interagerer med molekylet. Epitop er også kjent innen teknikken som antigenisk determinant. En epitop består generelt av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler, slik som aminosyrer eller karbohydrat- eller sukkersidekjeder, og har generelt spesifikke tredimensjonale strukturegenskaper så vel som spesifikke ladningsegenskaper. En epitop kan være lineær eller konformasjonell. Når en ønsket epitop på et antigen er bestemt, kan antistoffer mot denne epitop dannes, f.eks. ved å anvende teknikker beskrevet her. Dannelsen og egenskapene til antistoffer kan også belyse informasjon om ønskelige epitoper. Fra denne informasjon er det deretter mulig å kompetitivt screene antistoffer for binding til den samme epitopen. En tilnærming for å oppnå dette, er å gjennomføre krysskonkurrerende studier for å finne antistoffer som

9 7 kompetitivt binder med hverandre, dvs. antistoffene konkurrerer for binding til antigenet. En prosess med høyt gjennomløp for binding av antistoffer basert på deres krysskonkurranse er beskrevet i PCT publikasjon nr. WO 03/ Betegnelsen kimlinje refererer til nukleotidsekvensene av antistoffgenene og gensegmentene slik de overføres fra foreldre til avkom via kjønnscellene. Kimlinjesekvensen skjelnes fra nukleotidsekvensene som koder for antistoffer i modne B-celler som er blitt forandret ved rekombinering og hypermutasjonshendelser under forløpet med B-cellematurasjon. 1 Betegnelsen verscelle refererer til en celle inn i hvilken en ekspresjonsvektor er blitt innført. Betegnelsen omfatter ikke bare den spesielle tilsiktede cellen, men også etterkommeren av en slik celle. Fordi bestemte modifikasjoner kan forekomme i påfølgende generasjoner som enten skyldes innvirkninger av mutasjon eller omgivelser, kan slik etterkommer eventuelt ikke være identisk med modercellen, men er fremdeles inkludert innenfor rammen av betegnelsen vertscelle. Betegnelsen humant antistoff refererer til et antistoff som består av aminosyresekvenser av kun humane immunoglobulinsekvenser. Et humant antistoff kan inneholde murine karbohydratkjeder dersom fremstilt i en mus, i en musecelle eller i et hybridom avledet fra en musecelle. Humane antistoffer kan fremstilles på en rekke måter som er kjent innen teknikken. 2 Betegnelsen humanisert antistoff refererer til et kimært antistoff som inneholder aminosyrerester avledet fra humane antistoffsekvenser. Et humanisert antistoff kan inneholde noen eller alle av CDR ene fra et ikke-humant animalsk antistoff, mens rammeverk og konstante regioner for antistoffet inneholder aminosyrerester avledet fra humane antistoffsekvenser. Betegnelsen pattedyr refererer til en hvilken som helst dyreart innen pattedyrklassen. Eksempler på pattedyr inkluderer: mennesker, laboratoriedyr slik som rotter, mus, aper og marsvin, husdyr slik som katter, hunder, kaniner, kveg, sauer, geiter, hester og griser, og fangede ville dyr slik som løver, tigre, elefanter og liknende. 3 Betegnelsen isolert nukleinsyre refererer til et nukleinsyremolekyl av genomisk, cdna eller syntetisk opprinnelse, eller en kombinasjon derav, som er separert fra andre nukleinsyremolekyler tilstede i den naturlige kilden til nukleinsyren. Med hensyn

10 8 til genomisk DNA, inkluderer f.eks. betegnelsen isolert nukleinsyremolekyler som er separert fra kromosomet hvormed det genomiske DNA er naturlig assosiert. Foretrukket er en isolert nukleinsyre fri for sekvenser som naturlig flankerer nukleinsyren (dvs. sekvenser lokalisert i - og 3 -endene av nukleinsyren av interesse) i det genomiske DNA til organismen hvorfra nukleinsyren er avledet. Betegnelsen isolert antistoff eller isolert bindingsmolekyl refererer til et antistoff eller et bindingsmolekyl som: (1) ikke er assosiert med naturlige assosierte komponenter som følger det i dets native tilstand; (2) er fri for andre proteiner fra den samme arten; (3) er uttrykt ved en celle fra en annen art; eller (4) forekommer ikke i naturen. Eksempler på isolerte antistoffer inkluderer et OX40R-antistoff som er blitt affinitetsrenset ved å anvende OX40R, og OX40R-antistoff som er blitt dannet ved hybridomer eller annen cellelinje in vitro, og et humant OX40R-antistoff avledet fra et transgent dyr. 1 Betegnelsen K D refererer til likevektsdissosiasjonskonstanten for en spesiell antistoffantigen interaksjon, og anvendes for å beskrive bindingsaffiniteten mellom en ligand (slik som et antistoff) og et protein (slik som OX40R). Desto mindre likevektsdissosiasjonskonstant, desto tettere er liganden bundet, eller desto høyere er affiniteten mellom ligand og protein. En K D kan måles ved overflate-plasmonresonans, f.eks. ved å anvende BIACORE TM -systemet. En analyseprosedyre ved å anvende BIACORE TM -systemet (BIAcore assay) er beskrevet i eksempeldelen i denne beskrivelsen. 2 Betegnelsen off rate eller kd refererer til dissosiasjonsratekonstanten for en spesiell antistoff-antigen interaksjon. En dissosiasjonsrate konstant kan konstant måles ved overflate-plasmon-resonans, f.eks. ved å anvende BIACORE TM. Betegnelsen OX40R-antistoff refererer til et antistoff, som definert her, i stand til binding til den humane OX40R. 3 Betegnelsen OX40-reseptor og OX40R anvendes om hverandre i den foreliggende søknad, og inkluderer den humane OX40R, så vel som varianter, isoformer og artshomologer derav. Følgelig kan humane bindingsmolekyler som omtalt her i visse tilfeller også binde til OX40R fra arter andre enn human art. I andre tilfeller kan bindingsmolekyler være fullstendig spesifikke for human OX40R, og vil ikke utvise arts- eller andre typer av kryssreaktivitet.

11 9 Betegnelsen spesifikt binder til human OX40R med henvisning til interaksjonen av et bindingsmolekyl, f.eks. et antistoff, med dets bindingspartner, f.eks. et antigen, betyr at K D til et bindingsmolekyl for binding til CD40, CD137 eller CD271 er mer enn 0 ganger K D for dets binding til human OX40R, som bestemt i en in vitro analyse. 1 Betegnelsen vektor refererer til et nukleinsyremolekyl i stand til å transportere et annet nukleinsyremolekyl i en vertscelle. Eksempler på vektorer inkluderer plasmider, virale vektorer, nakne DNA- eller RNA-ekspresjonsvektorer, kosmid- eller fagvektorer. Noen vektorer er i stand til autonom replikasjon i en vertscelle, inn i hvilken de introduseres (f.eks. bakterielle vektorer som har en bakteriell replikasjonsorigo og episomale pattedyrvektorer). Noen vektorer kan integreres i genomet til en vertscelle ved introduksjon inn i vertscellen, og replikeres derved sammen med vertsgenomet (f.eks. ikke-episomale pattedyrvektorer). Visse vektorer kan dirigere ekspresjonen av gener hvortil de er operativt koblet, og kan derfor omtales som ekspresjonsvektorer. Som anvendt her følger de konvensjonelle aminosyrer og deres forkortelser konvensjonell anvendelse. Se Immunology A Synthesis (2. utgave, E.S. Golub og D.R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)). Bindingsmolekyler som binder til human OX40R 2 3 Den foreliggende beskrivelse tilveiebringer isolerte bindingsmolekyler som binder til human OX40R, som inkluderer OX40R-antistoffer, antigenbindingsfragmenter av OX40R-antistoffene, og derivater av OX40R-antistoffene. Bindingsmolekylene er kjennetegnet ved minst én av de etterfølgende funksjonelle egenskaper: (a) binde til human OX40R med en K D på 1 x -6 M eller mindre; (b) ha agonistaktivitet på human OX40R; (c) ikke binde til CD40-reseptor ved konsentrasjon opp til 00 nm; (d) ikke binde til CD137-reseptor ved konsentrasjoner opp til 00 nm; (e) ikke binde til CD271-reseptor ved konsentrasjoner opp til 00 nm; (f) er i stand til å øke IL-2- produksjon ved isolerte humane T-celler; (g) er i stand til å øke immunrespons; (h) er i stand til å inhibere tumorcellevekst; og (i) ha terapeutisk effekt på en cancer. I noen utførelsesformer binder bindingsmolekylene til human OX40R med en K D på 1 x -7 M eller mindre, eller 1 x -8 M eller mindre, eller x 1 x -9 M eller mindre. Humane OX40R-antistoffer

12 1 I noen første aspekter tilveiebringer den foreliggende beskrivelse et humant antistoff som binder til human OX40R. I noen utførelsesformer er det monoklonale antistoffet et monoklonalt antistoff som spesifikt binder til den humane OX40R med en K D på 0 nm eller mindre, foretrukket nm eller mindre, og som har agonistaktivitet på den humane OX40R. Et eksempel på slike humane antistoffer er det humane monoklonale antistoffet 11D4. Aminosyresekvensen for den tunge kjeden, og aminosyresekvensen for den variable region av den tunge kjeden (V H ) av antistoff 11D4 vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 9 og 7. Aminosyresekvensen av den lette kjeden, og aminosyresekvensen av den variable region i den lette kjeden (V L ) til antistoff 11D4 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. og 8. Isotypen til antistoff 11D4 er IgG2 for den tunge kjeden og Kappa for den lette kjeden. Allotypene for antistoff 11D4 er G2(n-) for den tunge kjeden og Km3 for den lette kjeden. Aminosyresekvensene for den modne tunge og lette kjeden er avledet fra begrepsmessig translasjon av DNAsekvenser i ekspresjonskonstruktene. Antistoff 11D4 inneholder ingen rammeverkmutasjoner i den tunge eller lette kjeden, men inneholder én mutasjon i tungkjede CDR2. Et annet illustrerende antistoff for beskrivelsen er det humane monoklonale antistoffet 18D8. Aminosyresekvensen for V H -regionen og V L -regionen til antistoff 18D8 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 19 og. Aminosyresekvensen til den tunge kjeden og lette kjeden er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 21 og Følgelig, i noen utførelsesformer, tilveiebringer beskrivelsen et isolert OX40R-antistoff som omfatter: (1) en tungkjede variabel region av antistoff 11D4 eller 18D8, (2) en tung kjede variabel region som omfatter en aminosyresekvens med SEKV. ID nr. 7 eller 19, eller (3) en tungkjede variabel region som omfatter en aminosyresekvens kodet for av en nukleinsyresekvens med SEKV. ID nr. 11 eller 23; og (1) en lettkjede variabel region av antistoff 11D4 eller 18D8, (2) en lettkjede variabel region omfattende en aminosyresekvens med SEKV. ID nr. 8 eller, eller (3) lettkjede variabel region som omfatter en aminosyresekvens kodet for av en nukleinsyresekvens med SEKV. ID nr. 12 eller I et annet aspekt tilveiebringer beskrivelsen antistoffer som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3 av tungkjede variabel regionen (V H ) og CDR1, CDR2 og CDR3 av den lette kjeden av 11D4 eller 11D8. Aminosyresekvensen for V H CDR1, V H CDR2 og V H CDR3 i 11D4 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 1, 2 og 3. Aminosyresekvensen for V L CDR1, V L CDR2 og V L CDR3 for antistoff 11D4 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 4, og 6.

13 11 Aminosyresekvensen for V H CDR1, V H CDR2 og V H CDR3 for antistoff 18D8 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 13, 14 og 1. Aminosyresekvensen for V L CDR1, V L CDR2 og V L CDR3 for antistoff 18D8 er vist i henholdsvis SEKV. ID nr. 16, 17 og 18. CDRregionene er angitt ved å anvende Kabat-systemet (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikasjon nr ). 1 2 Følgelig, i noen utførelsesformer, tilveiebringer beskrivelsen (1) et isolert monoklonalt antistoff som omfatter V H CDR1, V H CDR2 og V H CDR3 av antistoff 11D4 eller 18D8; og V L CDR1, V L CDR2 og V L CDR3 av antistoff 11D4 eller 18D8. I noen ytterligere utførelsesformer tilveiebringer beskrivelsen et isolert monoklonalt antistoff som omfatter en V H CDR1 omfattende aminosyresekvensen SEKV. ID nr. 1 eller 13, eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 1 eller 3 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosyresubstitusjoner; en V H CDR2 som omfatter aminosyresekvensen SEKV. ID nr. 2 eller 14 eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 2 eller 14 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosubstitusjoner; og en V L CDR3 som omfatter aminosyresekvensen SEKV. ID nr. 3 eller 1, eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 3 eller 1 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosubstitusjoner; og det isolerte monoklonale antistoffet omfatter også en V L CDR1 som omfatter aminosyresekvensen SEKV. ID nr. 4 eller 16, eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 4 eller 16 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosubstitusjoner; en V L CDR2 som omfatter aminosyresekvensen SEKV. ID nr. eller 17, eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. eller 17 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosubstitusjoner; og en V L CDR3 som omfatter aminosyresekvensen SEKV. ID nr. 6 eller 18, eller en sekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 6 eller 18 med 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosubstitusjoner. I noen tilfeller spaltes det C-terminale lysinet av den tunge kjeden av et OX40Rantistoff (Harris R. J., J. of Chromatography, 70: (199)). Den eller de tunge og/eller lette kjeder til OX40R-antistoffene kan eventuelt inkludere en signalsekvens. 3 Klassen (f.eks. IgG, IgM, IgE, IgA og IgD) og subklassen (f.eks. IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4) for OX40R-antistoffene kan bestemmes ved en hvilken som helst passende metode. Generelt kan klassen og subklassen av et antistoff bestemmes ved å anvende antistoffer som er spesifikke for en spesiell klasse eller subklasse av antistoff. Slike antistoffer er kommersielt tilgjengelige. Klassen og subklassen kan bestemmes ved ELISA eller Western blot, så vel som andre teknikker. Alternativt kan klassen og

14 12 1 subklassen bestemmes ved å sekvensere alle eller en del av de konstante domenene til de tunge og/eller lette kjedene til antistoffene, sammenligne deres aminosyresekvenser med kjente aminosyresekvenser av forskjellige klasser og subklasser av immunoglobuliner, og bestemme klassen og subklassen til antistoffene. OX40R-antistoffene kan være et IgG-, et IgM-, et IgE-, et IgA- eller et IgD-molekyl. OX40R-antistoffene kan f.eks. være et IgG som er en IgG1-, IgG2-, IgG3- eller en IgG4-subklasse. Således tilveiebringer et annet aspekt av beskrivelsen en metode for å omdanne klassen eller subklassen av et OX40R-antistoff til en annen klasse eller subklasse. I noen tilfeller blir et nukleinsyremolekyl som koder for en V L eller V H som ikke inkluderer sekvenser som koder for C L eller C H isolert ved å anvende metoder som er vel kjent innen teknikken. Nukleinsyremolekylet kobles deretter operativt til en nukleinsyresekvens som koder for en C L eller C H fra en ønsket immunoglobulinklasse eller subklasse. Dette kan oppnås ved å anvende en vektor eller nukleinsyremolekyl som omfatter en C L - eller C H -kjede, som beskrevet ovenfor. Et OX40R-antistoff som opprinnelig var IgM kan f.eks. klasseendres til en IgG. Videre kan klasseendring anvendes for å omdanne en IgG-subklasse til en annen, f.eks. fra IgG1 til IgG2. En annen metode for å fremstille et antistoff som omfatter en ønsket isotype omfatter trinnet med å isolere en nukleinsyre som koder for en tung kjede av et OX40Rantistoff, og en nukleinsyre som koder for en lett kjede av et OX40R-antistoff, isolere sekvensen som koder for V H -regionen, ligere V H -sekvensen til en sekvens som koder for et tungkjedekonstant domene av den ønskede isotypen, uttrykke lettkjedegenet og tungkjedekonstruktet i en celle, og samle OX40R-antistoffet med den ønskede isotypen. 2 3 Antigenbindingsfragmenter I et annet aspekt tilveiebringer den foreliggende beskrivelse antigenbindingsfragmenter av hvilket som helst av de humane OX40R-antistoffene som beskrevet her ovenfor. I noen utførelsesformer er antigenbindingsfragmenter valgt fra: (1) en lett kjede til et OX40R-antistoff, og (2) en tung kjede til et OX40R-antistoff; (3) en variabel region fra den lette kjeden til et OX40R-antistoff; og (4) en variabel region fra den lette kjeden til et OX40R-antistoff; () seks CDR er til et OX40R-antistoff, som omfatter tre CDR er fra den lette kjeden, og tre CDR er fra den tunge kjeden til et OX40R-antistoff. I noen utførelsesformer tilveiebringer beskrivelsen et antigenbindingsfragment av antistoff 11D4 eller 18D8. I noen andre særlige utførelsesformer inkluderer antigenbindingsfragmenten til et OX40R-antistoff: (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment som består av V L -, V H -, CL- og C H I-domener; (ii) Et F(ab ) 2 -fragment, et bivalent fragment som omfatter to Fab-fragmenter koblet

15 13 ved en disulfidbro i hengselregionen; (iii) et Fd-fragment som består av V H - og CHIdomenene; (iv) et Fv-fragment som består av V L - og V H -domenene til en enkelt arm av et antistoff; (v) et dab-fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 44-46), som består av et V H -domene; (vi) en isolert CDR, og (vii) enkeltkjedeantistoff (scfv), som er et polypeptid som omfatter en VL-region av et antistoff koblet til en VH-region av et antistoff. Bird et al., (1988) Science 242: og Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: Et antigenbindingsfragment kan også omfatte to eller flere korte fragmenter, enten fra den samme tunge kjeden eller den samme lette kjeden, eller fra forskjellige kjeder. Antigenbindingsfragmenter, slik som Fab- og F(ab ) 2 -fragmenter, kan fremstilles fra hele antistoffer ved å anvende konvensjonelle teknikker, slik som henholdsvis papain- eller pepsin-kutting av hele antistoffer. De kan også oppnås ved å anvende rekombinante DNA-teknikker, som beskrevet her. 1 Antistoffderivater I noen ytterligere aspekter tilveiebringer den foreliggende beskrivelse derivater av hvilket som helst av OX40R-antistoffene som beskrevet her ovenfor. I ett særlig aspekt er antistoffderivatet avledet fra modifikasjoner av aminosyresekvensene til 11D4 eller 18D8. Aminosyresekvensene til hvilke som helst regioner av antistoffkjedene kan modifiseres, slik som rammeverkregioner, CDRregioner eller konstante regioner. Modifikasjonene kan innføres ved standard teknikker som er kjent innen teknikkens stand, slik som seterettet mutagenese og random PCRmediert mutagenese, og kan omfatte naturlige, så vel som ikke-naturlige aminosyrer. 2 3 Typer av modifikasjoner inkluderer substitusjoner, insersjoner, delesjoner eller kombinasjoner derav, av én eller flere aminosyrer av et OX40R-antistoff. I noen utførelsesformer omfatter antistoffderivatet 1, 2, 3 eller 4 aminosyresubstitusjoner i tungkjede CDR ene, og/eller én aminosyresubstitusjon i lettkjede CDR ene. I noen utførelsesformer omfatter et derivat av et OX40R-antistoff én eller flere aminosyresubstitusjoner i forhold til kimlinjeaminosyresekvensen til det humane genet. I en særlig utførelsesform er én eller flere av disse substitusjoner fra kimlinjen i CDR2-regionen av den tunge kjeden. I en annen særlig utførelsesform er aminosyresubstitusjonene i forhold til kimlinjen i én eller flere av de samme posisjonene som substitusjonene i forhold til kimlinje i antistoffer 11D4 eller 18D8. I en annen utførelsesform er aminosyresubstitusjonen forandring av én eller flere cysteiner i et antistoff med en annen rest, slik som uten begrensning, alanin eller serin. Cysteinet kan være et kanonisk eller ikke-kanonisk cystein. Substitusjonen kan

16 14 gjøres i en CDR eller rammeverkregion av et variabelt domene, eller i det konstante domenet av et antistoff. En annen type av aminosyresubstitusjon er å eliminere asparagin-glysinpar, som danner potensielle deamideringsseter, ved å endre én eller begge av restene. I ytterligere andre utførelsesformer er aminosyresubstitusjonen en konservativ aminosyresubstitusjon. I én utførelsesform har antistoffderivatet 1, 2, 3 eller 4 konservative aminosyresubstitusjoner i tungkjede CDR-regionene i forhold til aminosyresekvensene av 11D4 eller 18D8. 1 En annen type av modifikasjoner i et OX40R-antistoff er forandringen av det opprinnelige glykosyleringsmønster for antistoffet. Betegnelsen forandring refererer til delesjon av én eller flere karbohydratenheter funnet i antistoffet, og/eller addering av ett eller flere glykosyleringsseter som ikke er tilstede i antistoffet. Glykosylering av antistoffer er typisk N-koblet. N-koblet refererer til festing av karbohydratenheten til sidekjeden av en asparaginrest. Addisjon av glykosyleringssetet til antistoffet gjennomføres vanligvis ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder én eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvenser (for N-koblede glykosyleringsseter). 2 En ytterligere type av modifikasjon involverer fjerning av hvilke som helst karbohydratenheter tilstede på antistoffet som kan gjennomføres kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever eksponering av antistoffet for en forbindelse, slik som trifluormetansulfonsyre eller en ekvivalent forbindelse. Denne behandling resulterer i spalting av de fleste eller alle sukkere unntatt koblingssukkeret (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens antistoffet etterlates intakt. Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Sojahr, H. T., og Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 29 (1987) 2-7 og av Edge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) Enzymatisk spalting av karbohydratenheter på antistoffer kan oppnås ved anvendelsen av en rekke endo- og ekso-glykosydaser som beskrevet av Thotakura, N. R., og Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) Eksempler på andre modifikasjoner inkluderer acetylering, acylering, amidering, tverrbinding, syklisering, dannelse av disulfidbinding, demetylering, dannelse av kovalente tverrbindinger, dannelse av cystein, formylering, hydroksylering, jodering, metylering, myristoylering, oksidasjon, pegylering, proteolytisk prosessering, fosforylering, prenylering og sulfation.

17 I et ytterligere aspekt er det tilveiebrakt et antistoffderivat som omfatter et OX40Rantistoff, eller antigenbindingsfragment derav, som beskrevet her, koblet til en ytterligere molekylær entitet. Eksempler på ytterligere molekylære entiteter inkluderer farmasøytiske midler, peptider eller proteiner, og deteksjonsmiddel eller merker. Spesifikke eksempler på farmasøytiske midler som kan være koblet til et OX40Rantistoff inkluderer cytotoksiske midler eller andre cancerterapeutiske midler, og radioaktive isotoper. Spesifikke eksempler på peptider eller proteiner som kan være koblet til et OX40R-antistoff inkluderer antistoffer, som kan være det samme OX40Rantistoffet, eller et forskjellig antistoff. Spesifikke eksempler på deteksjonsmidler eller merker som kan være koblet til et OX40R-antistoff inkluderer (1) fluorescerende forbindelser slik som fluorescein, fluorescein-isocyanat, rodamin, -dimetylamin-1- naftalensulfonylklorid, fykoerytrin og lantanidfosforer; (2) enzymer slik som pepperrotperoksidase, β-galaktosidase, lusiferase, alkalisk fosfatase og glukoseosidase; (3) biotin; (4) en forhåndsbestemt polypeptidepitop gjenkjent av en sekundær reporter, slik som leucin-glidelås parsekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindingsdomener og epitop tagger. I en særlig utførelsesform er antistoffderivatet en OX40R-antistoffmultimer, som er en multimer form av et OX40R-antistoff, slik som antistoffdimerer, trimerer eller høyere ordens multimerer av monomere antistoffer. Individuelle monomerer i en antistoffmultimer kan være identiske eller forskjellige, dvs. de kan være heteromere eller homomere antistoffmultimerer. Individuelle antistoffer innen en multimer kan ha de samme eller forskjellige bindingsspesifisiteter. Multimerisering av antistoffer kan gjennomføres gjennom naturlig aggregering av antistoffer. Noe prosentandel av rensede antistoffpreparater (f.eks. rensede IgG1-molekyler) danner f.eks. spontant proteinaggregater som inneholder antistoffhomodimerer, og andre høyere-ordens antistoffmultimerer. Alternativt kan antistoffhomodimerer formes gjennom kjemiske koblingsteknikker som er kjent innen teknikkens stand, slik som gjennom bruk av heterobifunksjonelle tverrbindingsmidler. Passende tverrbindingsmidler inkluderer dem som er heterobifunksjonelle, med to distinkte reaktive grupper separert ved en passende spacer (slik som N-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuksinimidester, suksinimidyl 4-(maleimidometyl)sykloheksan-1-karboksylat, og N-suksinimidyl S- acetyltioacetat) eller homobifunksjonell (slik som disuksinimidylsuberat). Slike linkere er kommersielt tilgjengelig fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Antistoffer kan også dannes for å multimerisere gjennom rekombinante DNA-teknikker som er kjent innen teknikkens stand.

18 16 I et ytterligere aspekt er antistoffderivatet et kimært antistoff, som omfatter en aminosyresekvens av et humant OX40R-antistoff beskrevet her ovenfor. I ett eksempel er én eller flere CDR er fra et humant OX40R-antistoff kombinert med CDR er fra et antistoff fra et ikke-humant dyr, slik som mus eller rotte. I et annet eksempel er alle CDR ene i det kimære antistoffet avledet fra humane OX40Rantistoffer. I et annet eksempel er CDR ene fra mer enn ett humant OX40R-antistoff kombinert med et kimært antistoff. Videre kan et kimært antistoff omfatte rammeverkregioner avledet fra et humant OX40R-antistoff, og ett eller flere CDR er fra én eller flere forskjellige humane antistoffer. Kimære antistoffer kan dannes ved å anvende konvensjonelle metoder som er kjent innen teknikken. I noen særlige utførelsesformer omfatter det kimære antistoffet én, to eller tre CDR er fra en tungkjede variabel region, eller fra lettkjede variabel regionen av et antistoff valgt fra antistoff 11D4 eller 18D Eksempler på andre antistoffderivater tilveiebrakt ved den foreliggende beskrivelse inkluderer enkeltkjedeantistoffer, diabodies, domeneantistoffer, nanobodies, og unibodies. Et enkeltkjede antistoff (scfv) består av en enkelt polypeptidkjede som omfatter et V L -domene koblet til et V H -domene, hvor V L -domenet og V H -domenet er paret for å danne et monovalent molekyl. Enkeltkjedeantistoff kan fremstilles i henhold til metoden kjent innen teknikken (se f.eks. Bird et al., (1988) Science 242: og Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: ). En diabody består av to kjeder, hvor hver kjede omfatter en tungkjede variabel region forbundet med en lettkjede variabel region på den samme polypeptidkjeden forbundet med en kort peptidlinker, hvor de to regionene på den samme kjeden ikke parer med hverandre, men med komplementære domener på den andre kjeden for å danne et bispesifikt molekyl. Metoder for å fremstille diabodies er kjent innen teknikken (se f.eks. Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: , og Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2: ). Domeneantistoffer (dab er) er små funksjonelle bindingsenheter av antistoffer, som tilsvarer de variable regioner av enten de tunge eller lette kjeder av antistoffer. Domeneantistoffer er godt uttrykt i bakterier, gjær og pattedyrcellesystemer. Ytterligere detaljer om domeneantistoffer og metoder for fremstilling derav er kjent innen teknikken (se f.eks. US patenter nr , , , , , europeiske patenter & , WO 0/0372, WO 04/1790, WO 04/0826, WO 04/08821, WO 04/0019 og WO 03/002609). Nanobodies er avledet fra de tunge kjedene til et antistoff. En nanobody omfatter typisk et enkelt variabelt domene og to konstante domener (CH2 og CH3) og bibeholder antigenbindingskapasitet til det

19 17 opprinnelige antistoffet. Nanobodies kan fremstilles ved metoder som er kjent innen teknikken (se f.eks. US patent nr , US patent nr , WO 06/079372). Unibodies består av én lett kjede og én tung kjede av et IgG4-antistoff. Unibodies kan fremstilles ved å fjerne hengselregionen i IgG4-antistoffer. Ytterligere detaljer om unibodies og metoder for å fremstille dem finner man i WO 07/ Fremgangsmåter for fremstilling av bindingsmolekyler Bindingsmolekyler som omtalt her kan fremstilles ved teknikker som er kjent innen teknikkens stand, som inkluderer konvensjonell monoklonalt antistoff metodologi, f.eks. ved standard somatisk cellehybridiseringsteknikk i Kohler og Milstein (Nature 26: 49, (197)), så vel som andre teknikker slik som viral eller onkogen transformasjon av B-lymfocytter. 1 Immunisering av ikke-humane dyr Beskrivelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille OX40R-antistoffer eller antigenbindingsfragmenter derav, som omfatter immunisering av et ikke-humant dyr som omfatter humane immunoglobulin-loci med et OX40R-antigen, og isolering av antistoffet fra dimeriserte dyr, eller fra celler avledet fra de immuniserte dyr. 2 3 Eksempler på passende ikke-humane dyr inkluderer et transgent eller transkromosomisk dyr, slik som HuMAb Mouse, KM Mouse, TC mice, og Xenomouse TM. HuMAb Mouse (Medarex, Inc.) inneholder humant immunoglobulingen miniloki, som koder for ikke-rearrangert human tung- (μ og γ) og κ lett-kjede immunoglobulinsekvenser, sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer endogen μ og κ kjede loci (se f.eks. Lonberg, et al., (1994) Nature 368: 86-89). Følgelig utviser musene redusert ekspresjon av mus IgM eller κ, og som respons på immunisering, vil introdusert human tung og lett kjede transgenene gjennomgå klasseendring og somatisk mutasjon for å generere høyaffinitets humane IgGκ monoklonale antistoffer (se f.eks. Harding, F. og Lonberg, N. (199) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:36-46). Fremstilling og anvendelse av HuMAb Mouse, og de genomiske modifikasjoner gjennomført med slike mus, er vel kjent innen teknikken (se f.eks. Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 84-81). KM mice TM bærer et humant tungkjede transgen og et humant lettkjede transkromosom, og er beskrevet detaljert i WO 02/ Xenomouse TM (Abgenix, Inc.) inneholder store fragmenter av humane immunoglobulinloci, og har mangelfull museantistoffproduksjon. Denne dyremodellen er vel kjent innen teknikken (se f.eks. US patenter nr , , , 6 84 og ). TC mice er også modifiserte mus

20 18 som bærer både et humant tungkjede transkromosom og et humant lettkjede transkromosom. Slike mus er beskrevet i Tomizuka et al. (00) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: OX40R-antigenet for anvendelse for å immunisere dyret kan være isolert og/eller renset OX40R, og er foretrukket et humant OX40R. I én utførelsesform er OX40Rantigenet et fragment av humant OX40R, foretrukket det ekstracellulære domenet av OX40R. I en annen utførelsesform er OX40R-antigenet et fragment som omfatter minst én epitop av humant OX40R. I en annen utførelsesform er OX40R-antigenet en celle som uttrykker OX40R på sin celleoverflate, mer spesielt en celle som overuttrykker OX40R på sin celleoverflate. Immunisering av dyrene kan gjennomføres ved en hvilken som helst passende metode som er kjent innen teknikken (se f.eks. Harlow og lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Særlige metoder for å immunisere ikke-humane dyr slik som mus, rotter, sauer, geiter, griser, kveg og hester er vel kjent innen teknikken (se f.eks. Harlow og Lane (1990), US patent nr ). Eksempel 1 tilveiebringer en metode for å immunisere HuMab mus. Etter immunisering av dyret med et OX40R-antigen, kan antistoffer og/eller antistoffproduserende celler oppnås fra dyret. I én utførelsesform oppnås serum fra dyret, og en immunoglobulinfraksjon kan oppnås fra serumet, eller OX40Rantistoffene kan renses fra serumet. 2 3 OX40R-antistoffene kan også fremstilles ved å anvende antistoffproduserende immortaliserte celler fremstilt fra celler isolert fra det immuniserte dyret. Etter immunisering, samles lymfeknuter og/eller milt B-celler fra dyret, og immortaliseres ved anvendelse av passende midler. Metoder for å immortalisere celler inkluderer, men er ikke begrenset til, transfeksjon derav med onkogener, infeksjon derav med et onkogent virus, og kultivering av dem under betingelser som utvelger immortaliserte celler, underkasting av disse for karsinogene eller muterende forbindelser, fusjonering av dem med en immortalisert celle, f.eks. en myelomcelle, inaktivering av et tumorsupressorgen (se f.eks. Harlow og Lane, supra). I en særlig utførelsesform blir milt B-cellen samlet fra det immuniserte dyret og fusjonert til immortaliserte myelomceller for å danne antistoffproduserende immortaliserte hybridomer. Myelomcellene utskiller foretrukket ikke immunoglobulinpolypeptider (en ikkeutskillende cellelinje). Immortaliserte hybridomer screenes ved anvendelse av OX40- antigenet (f.eks. OX40R, en del derav, eller en celle som uttrykker OX40R). Den

21 19 initiale screening kan f.eks. gjennomføres ved anvendelse av en enzymbundet immunoassay (ELISA) eller en radioimmunoassay. Et eksempel på ELISA-screening er beskrevet i WO 00/3704. De OX40R-antistoffproduserende cellene, f.eks. hybridomer, velges, klones og screenes ytterligere for ønskelige egenskaper som inkluderer robust vekst, høy antistoffproduksjon og ønskelige antistoffegenskaper, som omtalt ytterligere nedenfor. Hybridomer kan ekspanderes in vivo i syngeneiske dyr, i dyr som mangler et immunsystem, f.eks. nakne mus, eller i cellekultur in vitro. 1 Således tilveiebringes fremgangsmåter for fremstilling av en celle som produserer et humant monoklonalt OX40R-antistoff eller et antigenbindingsfragment derav, som omfatter: (a) immunisering av et ikke-humant transgent dyr med et OX40R-antigen; (b) la dyret iverksette en immunrespons på OX40R-antigenet; (c) isolere de antistoffproduserende celler fra dyret; og (d) immortalisere de antistoffproduserende celler. I én utførelsesform omfatter fremgangsmåten videre (e) dannelse av individuelle monoklonale polulasjoner av de immortaliserte antistoffproduserende celler; og (f) screening av de immortaliserte antistoffproduserende celler som produserer et ønsket OX40R-antistoff. 2 Nukleinsyrer, vektorer, vertsceller og rekombinante fremgangsmåter for fremstilling av OX40R-antistoffer Et annet aspekt av beskrivelsen tilveiebringer et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en aminosyresekvens av et bindingsmolekyl ifølge oppfinnelsen. I en utførelsesform er nukleinsyremolekylet valgt fra gruppen som omfatter SEKV. ID nr. 11, 12, 23 og Nukleinsyremolekylene tilveiebrakt ved beskrivelsen kan oppnås fra en hvilken som helst kilde som produserer et OX40R-antistoff. mrna fra OX40Rantistoffproduserende celler kan isoleres ved hjelp av standard teknikker, klones og/eller amplifiseres ved å anvende PCR og bibliotekkonstruksjonsteknikker, screenes ved å anvende standard protokoller for å oppnå nukleinsyremolekyler som koder for en aminosyresekvens til et OX40R-antistoff. mrna kan anvendes for å fremstille cdna for anvendelse i polymerasekjedereaksjonen (PCR) eller cdna-kloning av antistoffgenene. I én utførelsesform er nukleinsyremolekylet oppnådd fra et hybridom som uttrykker et OX40R-antistoff, som beskrevet ovenfor, foretrukket et hybridom som har, som én av dets fusjonspartnere, en ikke-human transgen dyrecelle som