FYS3710 Molekylærbiologi

Transkript

1 1

2 2 I en eukaryot celle er kromosomene festet i en indre membran som omgir en kjerne. Proteinene produseres i cellens cytoplasma.

3 3 I en prokaryot celle (for eksempel en bakteriecelle) er det ett kromosom. Dette svever omkring i cellen uten noen ender (det er sirkulært). Det kan finnes fremmed DNA også. Dette finnes gjerne i plasmider. (aggregates of stainable substances)

4 4 I et virus (for eksempel en bakteriofag) er arvestoffet (DNA eller RNA) pakket inn i en proteinkappe som gir mulighet for festing til cellemembranen og injeksjon av arvestoffet inn i cellen.

5 5

6 6 Først her skilles dyr, planter og gjær fra hverandre Hvete Gjær Organismer med eukaryote celler Éncellede organismer Prokaryoter Ribosomer er de små fabrikkene I cellene som sitter I endoplasmatisk reticulum og produserer proteiner

7 7 Den genetiske koden Det er verdt å merke seg det store antallet av overlappende koder. Det betyr at en punktmutasjon ikke nødvendigvis resulterer i en endring av aminosyresekvensen.

8 8

9 9

10 10

11 11 Det er 5 viktige steg i utviklingen av rekombinant DNA teknologi: Bestemmelsen av DNAs struktur og oppbygging (1953) Kutting og sammenskjøting av DNA ved hjelp av restriksjonsenzymer (1962) Utvikling av metoder for gel-elektroforese (1975) Transfeksjon av celler Kartlegging av DNA-sekvens slik at man kan få full oversikt over den genetiske koden i organismene.

12 12

13 13 Eksempler på 4 restriksjonsenzymer (endonucleaser) som alle er meget verdifulle i molekylærbiologien. Navnet Eco R1 kommer av navnet på bakterien som produserer denne endonucleasen: Escherichia Coli. Den kommer fra en sublinje som heter RY13, og dette er den første endonucleasen som er rendyrket fra denne linjen: Altså Eco R1 Haemofilus influenzae, linje Rd, tredje oppdagede endonuclease: Altså Hind III Felles for de 3 nederste endonucleasene er at de singeltrådede endene av DNA er som speilbilder av hverandre. De er perfekte templater for hverandre og vil følgelig ha stor affinitet for å binde seg sammen igjen (kalles inverterte palindrom-repetere).

14 14 Restriksjonsendonukleasene brukes av bakteriene som beskyttelse mot infeksjoner av fremmed genetisk materiale. Man trodde opprinnelig at restriksjonsendonukleasene ikke ville angripe det egne kromosomet til organismen fordi kromosomet ikke ville inneholde den basesekvensen som enzymet gjenkjente og angrep. I den senere tid har man imidlertid innsett at bakteriene kan beskytte sitt eget DNA ved såkalte epigenetiske mekanismer. Disse innebærer at en metylgruppe (R-CH 3 ) bindes til spesifikke baser i DNA, noe som resulterer i en velkjent funksjon av endringer i gen-ekspresjonen for det affiserte genet. Det viser seg at dette også kan hemme evnen til restriksjonsendonukleasene til å kutte den metylerte posisjonen i DNA.

15 15 En tidlig og viktig bruk av restriksjonsenzymene var å bestemme evolusjonsmessige sammenhenger for livet på jorda. Man tar da utgangspunkt i at enkelte gener er så universelle at det skal mye til for at en mutasjon i genet skal gi organismen med det muterte genet mulighet for å overleve og forplante seg. Man kan med enkle midler avgjøre hvor et restriksjonsenzym kutter DNAtråden. Forutsetningen for å perfeksjonere dette er teknikken med Southern blot som ble utviklet i 1975.

16 16 Hemoglobin er det proteinet som binder oksygen og frakter dette igjennom kroppen. Det er meget vel konservert i pattedyr. Vi kan dermed bruke det til å finne ut hvilke dyr som er våre nærmeste slektninger i evolusjonen.

17 17

18 18 Tenk dere at vi har en enkel sirkulær DNA-tråd. Slike representerer en infeksjonsfare for bakterier, men de representerer også en mulighet for bakterier å tilpasse seg til ugjestmilde mikromiljøer, for eksempel til antibiotika. Ved å kutte både det sirkulære DNAet og et fremmed DNA med samme restriksjonsenzym kan vi skjøte inn en bit av det fremmede DNAet i den sirkulære DNA-biten.

19 19 Neste trinn i rekombinant-dna-teknologien er transfeksjon. Transfeksjon innebærer at vi lurer den sirkulære DNA-tråden vår inn i celler (helst bakterier siden de deler seg ofte og dermed lager mange DNA-kopier). Plasmider er selvreplikerende sirkulære DNA-tråder med stor evne til å transfektere bakterier. Plasmider er den enkleste formen for en vektor

20 20 Mens et plasmid kun tar ca basepar av fremmed DNA kan bakteriofag to opp til basepar. Bakteriofag har DNA som arvestoff. (De virusene som angriper oss mennesker og gjør oss syke har oftest RNA og kalles retrovirus.) «Cos-site» er nødvendig for at virus-dna skal pakkes inn i proteinkappen I et cosmid har vi fjernet nesten hele virusets DNA, kun beholdt «origin of replication» «cos-site» og et resistensgen. Da kan vi putte inn ca basepar.

21 21 Et eksempel på at man har brukt bakteriofag som vektor og laget et genomisk DNA-bibliotek av en mammalsk celle. Med det menes at man har dyrket opp et stort antall bakterier som til sammen inneholder vektorer med alle delene av DNA fra den mammalske cellen

22 22 For å selektere ut kun de bakteriene som har tatt opp en vektor bruker vi et triks som innebærer bruk av antibiotika. Vi setter inn et gen i vektoren som gir beskyttelse (resistens) mot ett bestem antibiotisk stoff. Når vi så behandler hele bakteriesuppen med det antibiotiske stoffet vil alle bakterier som ikke har tatt opp en vektor dø ut.

23 23

24 Gen A Avleses sjelden Gen B Avleses hyppig FYS3710 Molekylærbiologi 24 Forskjellen på et genomisk DNAbibliotek og et cdna-bibliotek (komplementært DNA-bibliotek). Et ekspresjonsbibliotek består av proteiner som er translatert fra mrna som i sin tur er kodet fra cdna-biblioteket. Proteinene kan testes mot antistoffer.

25 25 For å undersøke hvilken klon som inneholder et bestemt gen bruker vi en såkalt «probe», dvs en kjent DNA-tråd som inneholder en del av genet. Man må da dyrke bakterier fra biblioteket på skåler. Koloniene overføres så til et filter, bakteriene lyses (sprekkes) og man utføre hybridisering. Fremgangsmåte steg for steg: a) Bakterier fra en eller flere kloner dyrkes opp b) Blotter bakteriene over på filter c) Lyser bakteriene og denaturerer DNA (høy temp og ph) d) Denaturerer proben som er [ 32 P]- radioaktiv e) Proben tilføres filteret ved normal ph og med Na + f) Det skjer renaturering (dvs hybridisering). Dette innebærer at den singeltrådede proben vil parres med en templat som stemmer med dens basesekvens

26 FYS4720 and FYS9720 PCR-teknikken: Polymerase Chain Reaction Denne teknikken brukes for å mangfoldiggjøre DNA-sekvenser (også prober). Den ble muliggjort ved at forskere i 1960-årene fant ut at noen spesielle bakterier (Thermus aquaticus) kan leve i såkalte hot springs (55-80 C). De har en DNA-polymerase som fungerer ved slike høye temperaturer C 50 C 72 C Alberts: 5 th ed figure 8-45

27 FYS4720 and FYS Etter bare 3 runder har antallet av kopier økt med en faktor C 50 C 72 C 94 C 50 C 72 C Alberts: 5 th ed figur 8-45

28 28 Agarose gel elektroforese og Southern blotting. Husk at DNA er negativt ladet med én negativ ladning per fosfatgruppe langs sukker-fosfatkjeden. For småmolekylært DNA (<500 basepar) brukes polyacrylamid-gel istedenfor agarose.

29 FYS4720 and FYS Illustrasjon som viser fleksibiliteten til agarose gel elektroforeseteknikken Hall: 6 th ed figure 16-12

30 30 DNA-sekvensiering slik det ble gjort med den klassiske metoden.

31 31 DNA-sekvensiering slik det ble gjort med den klassiske metoden. Man har 4 sentrifugerør som alle inneholder proben med en kort oligonukleotid primer pluss DNA polymerase og alle de 4 byggeklossene for DNA. Så tilsetter en liten mengde (1/100) av dideoksytrifosfat nukleosidet med én bestemt base til hvert av rørene.

32 32 Hver gang DNApolymerase kommer til en posisjon hvor den kan sette inn et nukleosid med den basen som foreligger som dideoksynukleosid er det 1% sjanse for at nettopp dideoksynukleosidet blir satt inn. Dermed stopper DNA-syntesen for akkurat den proben, mens den fortsetter for de 99 % som fikk vanlig deoksynukleosid innsatt. Så kjører man gel elektroforese og Southern blot for alle de 4 prøvene.

33 33

34 34 (Til diskusjonstimene torsdag): Spørsmål i forbindelse med Immunologi: Hva menes med komplement i immunologien? Hvilke to klasser av immunoglobuliner (dvs antistoffer) har evnen til å aktivere komplement? Molekylærbiologi: Hva er fordelen i forbindelse med vektorer ved at en endonuklease kutter DNA i palindromisk repetere? Hvorfor kan nettopp et protein som hemoglobin brukes for å sjekke ut slektskapet mellom forskjellige dyr? Hva menes med transfeksjon? Hva skiller et dideoksynukleotid fra et deoksynukleotid? Hva er forskjellen mellom et genomisk bibliotek og et cdnabibliotek?