KUTTING AV DNA MED RESTRIKSJONSENZYMER

Transkript

1 KUTTING AV DNA MED RESTRIKSJONSENZYMER Kutting av DNA med restriksjonsenzymer Hensikt Hensikten med forsøket er å utvikle en grunnleggende forståelse av hvordan DNA kan kuttes med restriksjonsenzymer og hvordan størrelsen til ulike DNA-fragmenter kan bestemmes ved agarosegelelektroforese. Bakgrunn Restriksjonsenzymer er enzymer som kløyver dobbelttrådet DNA ved å hydrolysere to fosfodiesterbindinger (en i hver DNA-tråd) innen en spesifikk nukleotidesekvens. Flere tusen restriksjonsenzymer er kjent, og disse har vært helt sentrale i forhold til utvikling av molekylær kloning og kartlegging av genetiske strukturer. Restriksjonsenzymer er et helt grunnleggende verktøy som brukes mye innen genteknologi og bioteknologi, bl. a. til å lage genmodifiserte organismer, samt innen biologisk og medisinsk forskning. Et restriksjonsenzym gjenkjenner en spesifikk, dobbelttrådet nukleotidesekvens, og kutter DNA i eller nær dette restriksjonssetet. Restriksjonsseter er vanligvis mellom fire og åtte nukleotider lange, og de er som regel symmetriske (basesekvensen er identisk i begge DNA-trådene når man leser fra 5 til 3 ende), slike sekvenser kalles palindromer. De fleste enzymene kutter DNA slik at det dannes et kort, enkelttrådet overheng i 3 -endene. Disse endene kalles «klebrige» (eng. cohesive/sticky ends) fordi de er komplementære. Enkelte restriksjonsenzymer kutter DNA-trådene i posisjoner som er rett overfor hverandre, noe som gir rette/butte ender uten enkelttråd-overheng. Figur 1 viser restriksjonssetene som gjenkjennes av enzymene Eco RI og Hae III. I cellene er restriksjonsenzymer involvert i forsvaret mot fremmed DNA, f. eks. virus-dna. Enzymene beskytter cellene ved å klippe det fremmede DNAet i småbiter. Restriksjonsenzymer er også involvert i enkelte typer reparasjon av skader på DNA. Navnet på et restriksjonsenzym er satt sammen av første bokstav i slektsnavnet og de to første bokstavene i artsnavnet til bakterien enzymet er isolert fra, disse skrives i kursiv. Dette er i enkelte tilfeller etterfulgt av bakteriestammebetegnelse. Dersom flere restriksjons-enzymer er isolert fra en enkelt bakteriestamme, skilles disse ved bruk av romertall. Eksempel: Eco RI = Escherichia coli, stamme RY13, restriksjonsenzym nummer I.

2 Plasmider er sirkulære DNA-molekyler. Hvis et plasmid har ett sete for et restriksjonsenzym vil det åpnes opp og danne et lineært molekyl når det behandles med enzymet. Lineære DNA-molekyler vil derimot gi to DNA-fragmenter dersom de kuttes med et restriksjonsenzym med ett sete i sekvensen. Størrelsen på fragmentene som dannes avhenger av plasseringen til restriksjonssetet. I dette forsøket skal dere sette opp fem selvbestemte restriksjonsenzymreaksjoner der tre ulike DNAmolekyler (to forskjellige sirkulære plasmider og et lineært DNA (bakteriofag Lambda DNA)) kuttes med EcoRI, BamHI eller en kombinasjon av de to restriksjonsenzymene. Størrelsen på de resulterende fragmentene bestemmes deretter ved hjelp av elektroforese. Aktuelle læringsmål Biologi 2, bioteknologi. Forklar hvordan genmodifiserte organismer kan framstilles, drøft hvordan dette kan brukes innenfor medisin, produksjon av mat og biologisk forskning, og hvilke følger dette kan ha for miljøet. Teknologi og forskningslære 1, teknologi, naturvitenskap og samfunn. Beskriv prinsipper og virkemåte for noen moderne instrumenter i industri, helsevesen eller forskning, og gjør rede for nytten og eventuelle skadevirkninger.

3 LÆRERNOTATER Kutting av DNA med restriksjonsenzymer Utstyr Medfølgende innhold: DNA, restriksjonsenzymer (EcoRI og BamHI), restriksjonsenzymfortynningsbuffer, reaksjonsbuffer, DNA-standard, vann, agarose, konsentrert elektroforesebuffer (50 x TAE), gel loading solution (10 x), konsentrert (25 x) FlashBlue DNA-farge, engangspipetter (plast), mikrorør i plast, semi-logaritmisk papir. Forsøkssettet inneholder materialer til 6 elevgrupper. Oppbevaring: Se Tabell 1 for oppbevaring av de ulike reagensene. Øvrige komponenter oppbevares ved romtemperatur. Tabell 1. Oversikt over oppbevaringstemperatur for de ulike reagensene. Rør Innhold Oppbevaring A EcoRI Dryzyme restriksjonsenzym 4 C B BamHI Dryzyme restriksjonsenzym 4 C C Restriksjonsenzym-fortynningsbuffer - 20 C D Restriksjonsenzym-reaksjonsbuffer 4 C E Vann, renhetsgrad for enzymer - 20 C F Plasmid-DNA 1-20 C G Plasmid-DNA 2-20 C H Lambda-DNA - 20 C I Molekylvektstandard (DNA-markør/DNA-standard) - 20 C Nødvendig tilleggsutstyr (foreslåtte varenumre i parentes): Is og isboks/kjølespann ( / ), vannbad ( ) eller termostatblokk ( ), elektroforesekar ( / / ), spenningskilde ( / ), vekt ( ), erlenmeyerkolbe 250 ml ( ), målesylindre ( , , )/pipettefyller og pipetter ( , ), mikropipetter ( / ) og pipettespisser ( ), mikrobølgeovn/gassbrenner ( )/kokeplate ( ), destillert vann ( ), plastkar ( ), linjal. Anbefalt tilleggsutstyr (foreslåtte varenumre i parentes): Hansker ( ), mikrosentrifuge ( ), reagensrør-rister ( ), vippebrett ( ), visualiseringsutstyr ( ). Forberedelser I dette forsøket er det lagt opp til at hver elevgruppe selv designer sitt eget eksperiment der de velger fem kombinasjoner av DNA (to sirkulære DNA-plasmider og lineært Lambda-DNA) og restriksjonsenzymer (EcoRI og BamHI). Vi foreslår at de ulike elevgruppene velger fem reaksjoner som sammen gir en grunnforståelse av hvordan restriksjonsenzymer fungerer og hvordan de resulterende DNAfragmentene vandrer i agarosegelen. Det er i alt tolv mulige kombinasjoner av DNA og enzym (inkludert tre reaksjoner med DNA som ikke behandles med noen av enzymene), se tabellen på neste side. Alle tolv reaksjonene kan gjerne være representert i klassen (også de uten restriksjonsenzym), slik at dere tilsammen får en «fullstendig» oversikt over hvordan restriksjonsenzymer virker på ulike typer DNA og hvordan disse vandrer i en agarosegel. Forberedelsesdelen under legger opp til at hver

4 elevgruppe får utdelt like menger av de ulike reagensene, og må ta hensyn til dette når de velger DNA/enzym-kombinasjoner. Tabell 2. Oversikt over mulige kombinasjoner av DNA/restriksjonsenzym. DNA 1 (µl) DNA 2 (µl) DNA 3 (Lambda, µl) EcoRI (µl) BamHI (µl) Vann (V, µl) Totalt reaksjonsvolum (µl) Alikvotering av DNA, DNA-markør, reaksjonsbuffer og vann 1. Tin alle DNA-prøvene (rør F, G og H), DNA-markøren (rør I) og reaksjonsbufferen (rør D) og plasser dem på is. 2. Sørg for at innholdet er i bunnen av rørene. Tapp rørene mot bordet eller sentrifuger kort i en mikrosentrifuge om nødvendig. 3. Merk seks mikrosentrifugerør «DNA 1» (til plasmid-dna 1, rør F), seks mikrosentrifugerør «DNA 2» (til plasmid-dna 2, rør G) og seks mikrosentrifugerør «DNA 3» (til Lambda-DNA, rør H). Alikvoter 30 µl plasmid-dna 1 fra rør F i hvert av de seks rørene merket DNA 1, 30 µl plasmid-dna 2 fra rør G i rørene merket DNA 2 og 30 µl Lambda-DNA fra rør H i rørene merket DNA Merk seks mikrosentrifugerør «M» og alikvoter 35 µl DNA-markør (rør I) i hvert rør. 5. Merk seks mikrosentrifugerør «Rxn buffer» og alikvoter 30 µl enzymreaksjonsbuffer (rør D) i hvert av rørene. 6. Merk seks mikrosentrifugerør «Vann» og alikvoter 40 µl vann (enzyme grade, rør E) i hvert rør. Alikvotering av gel loading solution Merk seks mikrosentrifugerør «10x GLS» og alikvoter 40 µl 10x gel loading solution i hvert rør. Rekonstituering og alikvotering av restriksjonsenzymer Restriksjonsenzymene rekonstitueres maksimalt 30 minutter før enzymreaksjonene settes opp. Husk! Når enzymene er løst i buffer må de alltid stå på is! 1. Tin restriksjonsenzym-fortynningsbufferen (rør C) og vannet (rør E) og sett dem på is. 2. Sørg for at enzymtørrstoffet er i bunnen av rørene (rør A og B). Tapp rørene mot bordet eller sentrifuger kort i en mikrosentrifuge om nødvendig. 3. Tilsett 100 µl restriksjonsenzym-fortynningsbuffer (rør C) til hvert av rørene A og B. La stå ved romtemperatur i 1 minutt. 4. Bland godt ved å flikke på rørene med fingeren eller plassere dem på en reagensrørrister til alt tørrstoffet er fullstendig løst.

5 5. Tilsett 100 µl vann (rør E) til hvert av rørene med restriksjonsenzym. Bland godt og samle alt innholdet i bunnen av rørene. 6. Merk seks mikrosentrifugerør «EcoRI» og seks rør «BamHI». Sett rørene på is. 7. Tilsett 30 µl fortynnet EcoRI (rør A) i hvert av rørene merket «EcoRI» og 30 µl fortynnet BamHI (rør B) i hvert av rørene merket «BamHI». Sett enzymene på is med en gang. I tabellen (Tabell 3) under er det listet hvilke reagenser hver elevgruppe trenger. Hver elevgruppe trenger også fem mikrosentrifugerør til å sette opp enzymreaksjonene, mikropipetter, spisser til mikropipettene og kjølespann eller isoporboks med is. Tabell 3. Oversikt over reagenser til hver elevgruppe. Rør Innhold Volum Rxn buffer Restriksjonsenzym-reaksjonsbuffer 30 µl DNA 1 Plasmid-DNA 1 30 µl DNA 2 Plasmid-DNA 2 30 µl DNA 3 Lambda-DNA 30 µl V Vann 40 µl M DNA-markør 35 µl EcoRI Fortynnet restriksjonsenzym EcoRI 30 µl på is! BamHI Fortynnet restriksjonsenzym BamHI 30 µl på is! 10x GLS 10x gel loading solution 35 µl Klargjøring av vannbad/termostatblokk I god tid før forsøket settes et vannbad (eller termostatblokk) på 37 C og et på 65 C. Dersom du kun har ett vannbad settes det 37 C. Øk deretter temperaturen til 65 C rett etter restriksjonsenzymreaksjonene har inkubert ferdig. Støping av agarosegeler Dersom elevene støper agarosegelene selv, gjøres dette mens restriksjonsenzymreaksjonene inkuberes. Agarosegelene kan eventuelt støpes på forhånd for å korte ned forsøkstiden. Ferdigstøpte geler kan forsegles med plastfolie og oppbevares i kjøleskap i inntil 1-2 uker. Elektroforese-bufferen (TAE) og FlashBlue-fargeløsningen kan også fortynnes på forhånd. Forsøkstid Restriksjonskutting: minutter Elektroforese og farging av gelen: ca. 90 minutter Resultatanalyse fasit Migrasjonsraten til DNA-fragmenter er omvendt proporsjonal med logaritmen til størrelsen i basepar. Feilmarginen vil være omtrent ± 10 %. Merk at DNA-fragmentet på bp ikke benyttes til å lage standardkurve da store DNA-fragmenter vandrer raskere i gelen enn man skulle forutsi. Mønsteret av DNA-fragmenter i gelen vil variere avhengig av hvilket DNA og hvilke enzymer som er brukt i de ulike reaksjonene. Figur 2 på neste side viser et eksempel med en DNA-standard (brønn 1)

6 og fire spesifikke enzymreaksjoner (brønn 2-5) og de relative posisjonene til de resulterende DNAfragmentene etter elektroforese. Størrelsen på plasmidet i eksempelet er 4340 bp. Figur 2. Eksempel på resultat. Brønn 1: DNA-standardprøve bestående av DNA-fragmenter med kjent størrelse (angitt i basepar (bp) til venstre). Brønn 2: ukuttet plasmid-dna (tre ulike grader av «supercoiling»), supercoilet DNA kan ikke størrelsebestemmes ved bruk av lineære standardfragmenter. Brønn 3: plasmid behandlet med restriksjonsenzym 1 (to bånd: 3710 bp og 630 bp). Brønn 4: plasmid behandlet med restriksjonsenzym 2 (ett bånd: 4340 bp). Brønn 5: plasmid behandlet med restriksjonsenzym 1 og 2 (tre bånd: 2080 bp, 1630 bp og 630 bp).

7 ELEVVEILEDNING Kutting av DNA med restriksjonsenzymer Utførelse Laboratoriesikkerhet Bruk hansker og vask hendene godt med såpe og vann etter å ha jobbet i laboratoriet. Restriksjonskutting Du har fått utdelt tre ulike DNA (to forskjellige sirkulære plasmid-dna (DNA1 og DNA2) og ett lineært DNA (Lambda DNA, DNA3), og to ulike restriksjonsenzymer (EcoRI og BamHI). Bestem deg for hvilke fem enzymreaksjoner du vil sette opp ved å fylle ut Tabell 4 under (evt. i samråd med lærer). Bruk kun én type DNA pr. reaksjon, og behandle dette med enten EcoRI, BamHI eller begge enzymene i kombinasjon. Husk at det også kan være interessant å sette opp en reaksjon uten restriksjonsenzymer for å se hvordan de ulike typene DNA (sirkulært vs. lineært) vandrer i gelen. 1. Merk fem mikrosentrifugerør med nummer 1-5 for de fem ulike restriksjonsenzymreaksjonene. Rørene merkes også med navn/initialer/gruppenummer. 2. Tilsett 5 µl reaksjonsbuffer (Rxn buffer) til hvert av rørene Tilsett vann, DNA og enzym til rørene ifølge Tabell 4. Tilsett alltid enzym til slutt! OBS! Bruk en ren pipettespiss for hver overføring av DNA/enzym for å hindre kontaminering mellom de ulike prøvene. Tabell 4. Skjema for oppsetning av restriksjonsenzymreaksjoner DNA 1 (5 µl) DNA 2 (5 µl) DNA 3 (Lambda, 5 µl) EcoRI (5 µl) BamHI (5 µl) Vann (V, til 30 µl) Totalt reaksjonsvolum (µl) Sett på lokkene og bland godt ved å flikke på rørene med fingeren. Sentrifuger prøvene kort eller dunk dem lett mot bordplaten for å samle hele volumet nederst i røret. 5. Inkuber reaksjonene ved 37 C i minutter. 6. Tilsett 5 µl 10x gel loading solution til rørene 1-4 for å stoppe reaksjonen. Bland godt. Prøvene er nå klare til elektroforese. VALGFRITT STOPP-PUNKT: Etter tilsetting av 10x gel loading solution kan prøvene lagres i kjøleskap og elektroforese kan utføres på et senere tidspunkt.

8 Støping av 0.8 % agarosegeler 1. Sett et gelkar i støpekammeret eller forsegl karet med endestykker/tape og sett i en kam med 8 tenner. Lag evt. to rader med brønner ved å sette i to kammer med 6 tenner hver. Vei inn 0.39 g agarose og overfør til en 250 ml erlendmeyerkolbe. Tilsett 1.0 ml 50x konsentrert TAEbuffer og 49.0 ml destillert (deionisert/demineralisert) vann (eller 50 ml 1x TAE-buffer). Dette er nok til 1 stk 0.8 % agarosegel. 2. Kok opp i mikrobølgeovn (høy effekt i ca 1 min). Kok opp gjentatte ganger (høy effekt i ca 25 s) til agarosen er fullstendig oppløst og løsningen er klar som vann. Roter kolben innimellom for å få en jevn agaroseløsning. Følg nøye med for å unngå at det koker over. Sjekk at det ikke er uløst agarose eller klumper i løsningen. 3. Avkjøl agaroseløsningen under rennende vann mens du roterer kolben til temperaturen er ca 60 C (når du kan holde kolben i hånden uten å brenne deg). Sett gelkaret på et horisontalt underlag og hell i agaroseløsningen. La stå til gelen har stivnet (20-30 min). Applisering av prøvene på gelen 1. Varm DNA-prøvene og DNA-standarden ved 65 C i 2 minutter. Avkjøl deretter prøvene i romtemperatur et par minutter. Oppvarmingen hindrer uspesifikk binding av de klebrige endene («sticky ends») DNA-fragmentene får etter restriksjonsenzym-behandlingen, og gir skarpe, klare bånd. 2. Fjern endestykkene/tapen på gelkaret og legg gelen i elektroforesekaret slik at brønnene er nærmest den negative (svarte) elektroden. Hell 1x TAE-buffer i karet til buffernivået er omtrent 5 mm over gelen. Ta kammen forsiktig ut av gelen. Se til at det er buffer i alle brønnene. 3. Sentrifuger prøvene kort eller dunk dem lett mot bordplaten for å samle hele volumet nederst i røret. Appliser 35 µl av hver prøve i brønnene på gelen i følgende rekkefølge: Brønn Rør 1 M Standard DNA-fragmenter (DNA-markør) 2 1 Enzymreaksjon Enzymreaksjon Enzymreaksjon Enzymreaksjon Enzymreaksjon 5 Pass på at du ikke stikker pipettespissen for langt ned slik at det blir hull i brønnen. Tips! dersom brønnene er vanskelige å se kan det hjelpe å legge et svart/mørkt papirark e. l. under elektroforesekaret. Elektroforese 1. Sett lokket på elektroforesekaret og koble til spenningskilden. Kjør gelen på V i min. Tiden det tar å separere DNA-molekylene avhenger av spenningen og størrelsen på elektroforeseapparatet. Se tabell 5 under for anbefalte innstillinger av elektroforeseapparatene

9 fra Edvotek. Ikke sett spenningen høyere enn anbefalt da for høy spenning kan resultere i at gelen smelter. Når elektroforesen er i gang dannes små, synlige bobler på elektrodene, og de negativt ladete DNA-molekylene vandrer mot den positive elektroden. 2. Når elektroforesen er ferdig, skrus strømmen av før lokket fjernes. Tabell 5. Anbefalte innstillinger for Edvoteks elektroforeseapparater. Tids- og spenningsangivelsene kan også brukes som retningslinjer for elektroforeseapparater av de fleste andre merker. Tid og spenning Volt M6Plus M12 og M36 Minimum/maksimum Minimum/maksimum /20 min 25/35 min /30 min 35/45 min 70 35/45 min 60/90 min 50 50/80 min 95/130 min Farging av gelen og visualisering av DNA 1. Fortynn 10 ml av 10x FlashBlue fargeløsning med 90 ml destillert vann og bland godt. Hell 75 ml av fargeløsningen (1x) over i et stort veieskip (eller annet egnet plastkar). 2. Overfør gelen forsiktig til fargekaret. Tilsett mer fargeløsning dersom gelen ikke er fullstendig dekket. La gelen ligge i fargeløsningen i 5 min. 3. Hell av fargeløsningen og tilsett ml destillert vann. Sett avfargingskaret på et vippebrett eller vipp på karet med noen minutters mellomrom. La gelen ligge til avfarging (destillert vann) i 20 min. Skift vannet hyppig for raskere avfarging. De mørkeblå DNAbåndene vil etter hvert bli synlige mot den lyseblå bakgrunnen. Tips: Avfargingen går fortere dersom avfargingsløsningen er 37 C. 4. Fjern gelen forsiktig fra avfargingsløsningen og legg den i en gjennomsiktig plastpose (f. eks. en ziplock-pose eller brødpose). Legg gelen på en lyskilde med hvitt lys for tydelig visualisering av DNA-båndene. Resultatet kan dokumenteres ved å ta bilde av gelen med et digitalkamera. Gelen kan oppbevares i kjøleskap i flere uker hvis den ligger i en forseglet plastpose med litt elektroforesebuffer. Avfallshåndtering Fargete geler og plastavfall kan kastes i restavfallet. Elektroforesebuffer (1x TAE-buffer), FlashBlue fargeløsning og avfargingsløsning kan helles ut i vasken. Skyll godt med vann etterpå. Resultatanalyse Bestemmelse av DNA-fragmentenes størrelser Størrelsen på DNA-fragmentene som resulterer fra kuttingsreaksjonene (brønn 2-6) kan finnes ved å bestemme migrasjonsavstandene til de ulike fragmentene etter elektroforese og deretter sammenligne med DNA-fragmentene i DNA-standardprøven (brønn 1).

10 1. Lag en standardkurve: Mål avstanden de ulike DNA-fragmentene i standardprøven (brønn 1) har vandret i agarosegelen (se bort fra det lengste fragmentet på bp). I hvert tilfelle måles avstanden fra nedre kant av brønnen til nedre kant på båndet i gelen. Bruk logaritmepapiret på neste side og plott inn alle avstandene (i centimeter, til nærmeste millimeter) på x-aksen versus fragmentenes størrelse i basepar (bp) på y-aksen. Figuren til høyre viser størrelsene til fragmentene i DNA-standarden. Bruk en linjal og tegn en best mulig tilpasset rett linje gjennom alle åtte punktene på papiret. Det bør være omtrent like mange punkter over og under linjen, og noen punkter ligger kanskje rett på linjen. 2. Mål migrasjonsavstanden Kutting av DNA med restriksjonsenzymer (vandringslengden) til alle DNA-fragmentene i de forskjellige restriksjonsenzym-reaksjonene. 3. Bestem størrelsen på hvert enkelt DNA-fragment i kuttingsreaksjonene: Finn migrasjonsavstanden langs x-aksen på logaritmepapiret med standardkurven. Tegn en vertikal linje fra dette punktet til skjæringspunktet med standardkurven. Fra skjæringspunktet tegnes en ny, horisontal linje til y-aksen. Omtrentlig størrelse på DNA-fragmentet i basepar kan leses av på y-aksen. Se figuren til høyre for eksempel. Resultatanalyse og diskusjonsspørsmål 1. Se på agarosegelen og forklar båndene i de forskjellige prøvene. Figuren nederst til høyre viser størrelsen til de ulike båndene i DNA-standarden, bruk denne i din resultatforklaring. Er resultatene som forventet? Hvis ikke, hva kan være årsaken til dette? 2. Plasmid-DNA er sirkulære DNA-molekyler. Disse er gjerne «supercoiled» (tvunnet rundt seg selv som en gummistrikk som er tvunnet flere ganger eller en telefonledning som har slått krøll på seg). Kan størrelsen til et supercoiled plasmid bestemmes ved agarosegelelektroforese der plasmidet kjøres parallelt med en standardprøve? Hvorfor/hvorfor ikke?

11 Kutting av DNA med restriksjonsenzymer