Hfr-stammer Kartlegging ved avbrutt konjugasjon (time of entry)

Transkript

1 BAKTERIE OG FAG GENETIKK Man studerer ofte E. coli fordi den inneholder få gener (4700 kb)sammenlihgnet med menneskets ca 6 mill kb, har kort generasjonstid (20 min) og er hele livssyklusen i haploid tilstand. Fag λ er også mye studert fordi den er en E. coli fag (48,5 kb) Hovedpunkter: Bakteriell konjugasjon Transduksjon Faggenetikk Plasmider Hfr-stammer Kartlegging ved avbrutt konjugasjon (time of entry) Spesiell, λ Generell, P1 Å dyrke å telle fag Restriksjon/modifikasjon Bakteriell konjugasjon Først noen begreper: Minimalmedium (MM)= medium som bare inneholder glukose og salter slik at bakteriene selv må lage det den trenger av aminosyrer og vitaminer. Prototrofe bakterier- bakterier som kan lage alle de nødvendige næringsstoffer. Auxotrofe bakterier- bakterier som mangler evnen til å lage ett eller flere nætingsstoffer. Symbolbruk- + er villtype er mutant genotype leu - er mutasjon i leu genet (genotype) Leu - kan ikke lage Leu (fenotype) Konjugasjon- Ved hjelp av F-pilus overføres genetisk materiale fra en bakterie til en annen. Plasmider- Er små sirkulære supervridde DNA molekyler som finnes i de fleste bakterier. Et plasmid er i stand til å bli replikert i en celle, og nedarves fra celle til celle. Det finnes flere typer plasmider. Kopitallet er typisk for hver type. Se utlevert ark! Col plasmider er ca 5 kb store, og lager coliciner som er en type proteiner som hemmer andre bakteriers vekst. F-plasmider (fertilitets) kalles kjønnsfaktorer. Ca 100kb store og istand til å overføre seg selv til en annen celle. R-plasmider (resistens) inneholder gener som gir resistens mot antibiotika kb og istand til å overeføre seg selv til en annen celle. Konstruerte plasmider- bærer med seg gener og er ofte laget av deler fra ulike plasmider. Gjelder pbr322 og puc18/19 1

2 Plasmid konjugasjon skjer ved at et plasmid overføres naturlig fra celle til celle. En bakterie som inneholder et F plasmid kalles F +, mens en som ikke inneholder F kalles F -. Hvis disse to blandes slik at F overføres, vil F + cellen være donor (giver) og overføre F- plasmidet til F - cellen som er resipient (mottager). Donoren lager en kopi av F som overføres slik at etterpå er begge cellene F +. Hvis F bærer andre gener av betydning for cellen, f.eks lacoperon, kalles cellen F'. (f.eks. F'lac) Se fig 13.6a Hfr-stammer er bakteriestammer som har fått integrert et F-plasmid. Disse cellene viser en ekstra høy tendens til å rekombinere og dette forklarer navnet Hfr som betyr High Frequency of Recombination. Se fig.13.6b. Kromosomet har ca 20 plasser hvor F kan integreres og i tillegg kan retningen for integrasjon variere. Dette gir oss svært mange ulike måter F kan integreres på. Vi får mange ullike Hfrstammer av E. coli Se fig og utlevert ark F'-plasmider-oppstår ved at et integrert F-plasmid feilutklippes slik at noen bakterielle gener følger med. Det er en sjelden foreteelse, men det hender at et plasmid kan klippes ut av kromosomet og bli fritt igjen. Et plasmid som har plukket opp et E. coli gen på denne måten kalles F'. feks F'lac. Siden F kan sitte mange steder i kromosomet, kan man få mange ulike F'plasmider. Det er isolert F'plasmider som i alt dekker hele E. coli kromosomet. Se fig Frigjøring av F' fra Hfr er på mange måter likt med frigjøring av λ-dna fra en lysogen celle ved induksjon. Hfr-overføring- konjugasjon F inneholder som sagt alle gener for å kunne overføres til en F - celle. Derved vil kromosomet i en Hfr-celle også inneholde disse. F-faktoren i Hfr kan derved starte konjugasjon.hfr cellen er donor og F - cellen er resipient. Se fig 13.6.c 1. Etter at en konjugasjonsbro er laget starter konjugasjonen med et nick i F. Deretter starter rullende sirkel replikasjon. OriT er startpunkt for rullende sirkel replikasjon. 2. Nå henger F sammen med kromosomet slik at denne prosessen kan fortsett rundt hele kromosomet, og avslutte med noe av F frem til ori T igjen. Overføringen av hele kromosomet tar ca 100 min. i E. coli. Overføring av bare F tar ca 2 min. 3. Vanligvis avbrytes denne prosessen etter en viss tid fordi konjugsjonsbroen kan brytes. Vi får da overført en bit av F og en del av kromosomet. 4. Det overførte DNA kan ikke eksistere som eget DNA slik F-plasmidet gjorde ved plasmid konjugasjon. Vi har jo bare overført en bit av F. Resipient cellen forblir F Den overførte delen av kromosomet kan "finne" sin homologe del av resipienetens kromosom. Så kan det skje en overkrysning (homolog rekombinasjon), slik at en del av donor DNA erstatter de tilsavarende delen av resipientens DNA. 2

3 Genkart "time of entry" På et genkart av E. coli kromosomet finnes posisjonen av genene oppgitt i minutter fra 0 til 100. Denne angivelsen bygger på konjugeringsforsøk mellom en Hfr-stamme og en F stamme. Eks Donor: Hfr leu + trp + str s (denne stammen har F integrert i posisjon 92 min) Recipient: F - leu - trp - str r 1. Donor og recipient stammer blandes i et flytende medium slik at konjugasjon kan starte. Kromosomet fra Hfr-stammen starter å bli overført til recipient-stammen. De ulike genene blir overført i tur og orden. (leu + etter ca 10 min og trp + etter ca 35 min) 2. Små porsjoner tas ut av kulturen ved visse tidsintervaller og ristes kraftig for å avbryte konjugasjonen. 3. Uttakene undersøkes for å se om recipient-cellene har mottatt leu + eller trp + genet fra donor ved å plate ut på minimalmedium tilsatt streptomycin og enten aminosyren leu eller trp. Fra ca 10 min ventes leu + genet overført. For at recipient-cellenskal bli Leu +, må genet fra donor også bli rekombinert inn i kromosomet. Antall Leu + celler vil øke gradvis fra 10 min og utover. 4. Str r genet er en markør som gjør at donorcellene kan utelukkes. Disse er jo Leu + og Trp +, men også Str s. Dette genet sitter slik at det ikke vil bli overført i forsøket (evt etter 80 min). Ved å dyrke på medium tilsatt streptomycin vil bare recipient-celler vokse. Dette kalles mot-seleksjon og str-genet er en mot-selektiv markør. 5. For å registrere recipienter som er blitt Leu +, kontrollerer vi platen med MM, trp og str. Bare recipienter som har mottatt leu + -genet vil vokse her. Dette er positiv seleksjon. Samtidig undersøker vi platene med MM, leu og str og her vil ingen recipienter vokse før etter at trp + -genet er overført (ca 35 min). 6. Genkartet man får ved å bruke en bestemt Hfr-stamme vil bare dekke en del av kromosomet. Ved å bruke flere ulike stammer, kan man kartlegge hele kromosomet. Avstanden mellom to bestemte gener målt i minutter er den samme uansett hvilke Hfrstammer som brukes. Transduksjon Transduksjon er overføring av gener fra en bakteriecelle til en annen ved hjelp av bakteriofag. Spesiell transduksjon kjennetegens ved at λ eller liknende bakteriofager bærer visse bakterielle gener, bio eller gal. Generell transduksjon kjenetegnes ved at P1 eller andre faghoder bærer tilfeldige bakterielle gener. Spesiell transduksjon 3

4 Dannelsen av en transduserende λ fag starter med en E. coli som er lysogen for λ. Ved induksjon av denne vil λ-genomet bli klippet ut. Integreringen av λ skjer alltid ved att setet hos begge. Att setet til bakterien kalles att B, mens fagens kalles att P. Derfor kalles dette steds spesifikk rekombinasjon. Att B ligger mellom genene gal og bio. Gal koder for et enzym som er nødvendig for å utnytte galaktose. Bio koder for et enzym som trengs for å syntetisere biotin. Unøyaktig utklipping: Det kan hende at λ blir feilutklippet ved induksjon og dette gir to muligheter: 1. λbio: fagen har fått med bio fra E. coli, men mistet gener for lysogeni (int, xis). Lytisk livsløp er fortsatt mulig. (plakk). Fagen kalles λpbio p=plakk 2. λgal: Fagen har fått med gal fra E. coli, men mistet gener for lytisk livsløp (halegener...). Lysogent livsløp fortsatt mulig. Fagen kalles λdgal d=defekt Hvorfor mistes noe av fagens gener? Selv om den feil utklippede λ vil replikeres på vanlig måte og pakkes i hoder, er det begrenset plass i faghodet. Dvs at det utklippede DNA bør ha en størrelse som er mellom 79% og 106% av det normale som er mellom 38 og 51kb (normalt er 48,5 kb) En fag som har fått med seg noe DNA fra verten kalles transduserende. Se fig En transduserende fag kan brukes til å lage delvis diploide E. coli og brukes i komplementasjonstester. Generell transduksjon P1 er en temperat fag for E. coli. Ved lytisk livsløp, eller ved induksjon av en lysogen, vil P1 degradere vertens DNA. Når DNA skal pakkes i hodene til P1, kan det forekomme fragmenter av E. coli som har riktig størrelse til å bli pakket. Disse vil da bli pakket i P1 hoder. P1 har et genom på 91,5 kb DNA og det betyr at tilsvarende store biter av vertens DNA kan pakkes. 91,5 kb er ca 2,4 % av hele E. coli genomet (4800 kb) og kan romme omkring 75 gjennomsnitts store gener. Ca 3 av 1000 P1-fag vil være tranduserende fag. Hvordan skjer transduksjonen? En transduserende P1-fag inneholder E.coli DNA fra en donor celle. Dette vil kunne injiseres inn i en annen E. coli celle, recipienten. Her kan det injiserte DNA integreres i kromosomet ved homolog rekombinasjon. Det må skje to overkrysninger for at recipienten skal motta en bit fra donoren, og miste sin tilsvarende bit. Hvis recipienten var leu - og donorcellen leu +, kan noen recipientceller bli leu +.. Disse cellene er transduserte. Se fig Kotransduksjon. En E. coli celle som er transdusert med P1, vil ha mottatt ca 75 E.coli gener fra donoren. Disse genene er kotransdusert. Sjansen for kotransduksjon av to gener a og b er større jo nærmere genene a og b ligger hverandre. Hvis 30% av de recipientene som har mottatt a 4

5 samtidig har mottatt b, så er kotransduksjonsfrekvensen (kf), X = 30%. Jo høyere kf, jo nærmere er genene. (i motsetning til rekombinasjon) 5

6 Faggenetikk Bakteriofag betyr bakteriespiser (fortærer) T- ulike, (T1-T7) T står for type. T-like, (T2-T6) Å dyrke og telle fag. En suspensjon av f.eks λ fortynnes først til passe konsentrasjon, ca 1000 pr ml, deretter tilsettes en indikatorbakterie. Dvs en bakteriestamme som fagen kan bruke som vertscelle. Bland f.eks 0,1ml fagsuspensjon og litt indikatorcellekultur med 3ml softagar ved ca 47 o C. Dette helles på en agarplate. Softagaren med bakterier + fag vil stivne og utgjøre en toppagar. Mengden bakterier må være slik at de danner et jevnt lag etter inkubering (f.eks 10 8 celler). Der hvor det var en fagpartikkel vil det bli et klart område i den grålige bakterieplenen, en plakk. Hver opprinnelige fag har nemlig infisert en celle på platen, etter lysis vil ca 100 nye fag infisere ca 100 nye bakterier ved siden av osv. Når bakteriene slutter å vokse fordi næringen er brukt opp, vil plakken også slutte å vokse. 100 fag gir 100 plakk Hvis vi har en infisert bakterie i en kultur, og plater ut på denne måten, vil den også gi en plakk, i og med at den blir fiksert på platen når vi sår ut. En fri bakteriofag eller en celle som er infisert kalles pfu, (plaque forming unit) MOI Hvis vi blander 3 x 10 8 λ fag med 10 8 E. coli i 1 ml flytende medium sier vi at MOI = 3. (Multiplicity of infection). I dette tilfelle vil ikke alle bakteriene få 3 fagpartikler. Adsorpsjonen skjer helt tilfeldig, og noen celler kan derved bli infisert av flere enn 3 fag, mens andre celler ikke blir infisert i det hele tatt. Vekstkurve Hvis vi dyrker bakterier, vil disse etter en stund vokse eksponentielt (log-fase) Vi tenker oss at vi har 1 x10 6 celler pr ml i log fase. Vi tilsetter 1 fag. Vi antar generasjonstid 30 min for bakteriene og 30 min for fagen, og at det slippes fri 100 fag pr generasjon (burst size) som igjen infiserer 100 nye celler. Vi får da: Tabell. Beregning av fag og bakteriekonsentrasjon etter ulike antall bakteriegenerasjoner Tid, min Antall fag/ml Bakterier /ml generasjoner tilnærmet nøyaktig x x (10 6-1) x x x x x x x ,4 x ,6 x x x x ,4 x 10 9 (100 x 1,4 x 10 7 ) 0 0 6

7 Inntil 120 min er antall bakterier lite påvirket av fagen. Men ved 120 min frigjøres 10 8 fag, og de fleste bakteriene blir da infisert, og etter 150 min lysert. Antall fag i alt vil da bli ca 1,4 x 10 9 pr ml. Spesifisitet ved infeksjon. Det er bare visse typer fag som er istand til å infisere de enkelte bakteriestammer. Dette skyldes både reseptortilpasning og beskyttelse mot vertens restriksjonsenzymer hos fagen. Reseptor: T 4 kan infisere de fleste E. coli stammer, de fleste stammer av Shigella, men ingen Pseudomonas-arter. Denne spesifisiteten kan endres ved mutasjoner både hos fagen og hos verten. En enkel forklaring på dette er at fagens haleplate eller halefibre må binde seg til et eget reseptor-sete på bakteriens overflate. Begge disse er av protein natur eller av avhengig av proteiner. Restriksjon-modifikasjon: Bakterier beskytter seg mot inntrenging av fremmed DNA også med restriksjonsenzymer. Dette er endonukleaser som kutter inn i DNA molekyler på bestemte steder. Bakteriens eget DNA er beskyttet mot dette. Hver type restriksjonsenzymer kutter DNA ved sitt bestemte restriksjonssete, ofte 6 bestemte basepar i rekkefølge. Hver bakteriestamme kan ha ett eller flere slike enzymer. Bakteriens eget DNA er beskyttet mot restriksjonsenzymene ved at DNA er blitt modifisert. Det skjer ved at en av basene i restriksjonssetet blir metylert. Dette beskytter mot kutting. Modifikasjonen (metyleringen) skjer normalt i forbindelse med DNA-syntesen. I noen få tilfeller kan fremmed DNA (f.eks fag-dna) bli metylert før restriksjonsenzymene får kuttet det, og derved bli beskyttet. Hvis først fag-dna er modifisert i en bakteriestamme, vil denne fagen være tilpasset denne stammen. Ett av restriksjonsenzymene hos E. coli, EcoRI, gjenkjenner sekvensen 5'-GAATTC-3'. Det tilsvarende modifikasjonsensymet metylerer A i denne sekvensen slik: 5'-GAA M TTC-3', EcoRI vil nå ikke kutte DNA ved denne sekvensen En λ -fag som er modifisert i E.coli B kalles λb, en som er modifisert i E.coli K kalles λk osv. Hvis λk infiserer E.coli B vil fagens DNA bli ødelagt når det kommer inn i cellen. Imidlertid vil vi i ca 1 av 10 4 tilfeller få en modifikasjon med E.coli B's modifikasjnsenzym. Den fag som kommer ut vil da være λb. Bakteriestamme\fag λk λb λc K B C