1. INNLEDENDE GENETIKK 2 2. DNA - RNA 4 5. TRANSLASJON 6 6. REGULERING AV GENER 6 7. EUKARYOTE GENER 8 8. DNA REPLIKASJON, 8

Transkript

1 OPPGAVER I GENETIKK Innholdsfortegnelse 1. INNLEDENDE GENETIKK 2 2. DNA - RNA 4 3.TRANSKRIPSJON 5 5. TRANSLASJON 6 6. REGULERING AV GENER 6 7. EUKARYOTE GENER 8 8. DNA REPLIKASJON, 8 9. MUTASJONER, REPARASJON BAKTERIER, VIRUS PLASMIDER BAKTERIOFAG λ FLYTTING AV GENER NOEN DNA-TEKNIKKER KLONING: DNA-FRAGMENT DNA SPLEISING VEKTORER DNA-BIBLIOTEK DET HUMANE DNA 25

2 31. ANALYSE AV HUMANT DNA INNLEDENDE GENETIKK Diploide og haploide celler, kromosomer og kromatider, genom, mitose, meiose, kjønnet formering, overkrysning - rekombinasjon, Mendels lover. Gener, alleler, genloci, dominant - recessiv, fenotype, genotype, terminologi. Genkart, map unit (cm), kobling - koblingsgrupper. Genfrekvens i populasjoner. 1-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempler. 1-2 Forklar forskjellen på mitose og meiose, spesielt hvordan kromosomene er plassert i metafasen, og hva som blir resultatet. 1-3 Forklar betydningen av følgende skrivemåter: a) leu -, b) leu +, c) Leu+, d) Leu-, e) lac a +, f) pen-s, g) Pen-r, h) lac a + / lac z Hvilke av eksemplene i oppg. 1-3 er genotyper? Skriv fenotypen til disse. 1-5 Hva menes med overkrysning og rekombinasjon? Når kan det foregå? 1-6 Genene a, b, c ligger i rekkefølge abc. Vis med figur hvordan krysningen (a + b + c + ) x (a - b - c - ) kan gi følgende resultater: A) a + b + c + B) a + b - c - C) a + b - c Hvilke av resultatene A, B eller C i oppg. 1-6 blir det færrest av? (c) 1-8 Vi måler følgende rekombinasjonsfrekvenser mellom genmarkører: a x c, 2% ; b x c, 13% ; b x d, 4% ; a x b, 15% ; c x d, 17% ; a x d, 19% a) Hva er genenes riktige rekkefølge? (acbd) b) I krysningen abd x AbD, hva blir frekvensen av ABD? (0,6%) 1-9 I krysningen abcd x ABCD fant man følgende frekvenser: ABCd: 3%, abcd: 3%, AbcD: 0.03%, AbCd: %, Abcd: 0.06%. Hva er genenes rekkefølge? (abcd) 1-10 I en krysning mellom to bakteriofager med genotype ABC og abc, ble 1000 avkom analysert. Man fant følgende antall: abc:396, ABC: 406, abc:23, abc:1, AbC:25, Abc:75, abc:73, ABc:1. 2

3 Lag et genkart som viser posisjon og avstand mellom genene. (a-15-c-5-b) 1-11 Genene a b c d ligger på samme bakteriekromosom med en avstand i cm slik: b-2-d-5-c-10-a. I krysningen abcd x ABCD, hva blir frekvensen av: abcd, AbCD, ABcD, ABCd, abcd, abcd, abcd, Abcd, abcd, abcd, abcd, AbcD, abcd og ABCD? (abcd er 0,05, AbCD er 0,01, ABcD er 0,0025, ABCd er 0,0005 osv) 1-12 Genparene i erteplanter for farge på blomst og form på frø har betegnelsene: P= purpurfarget, p= rødfarget L= lang, l= rund Stor bokstav betyr dominans. a) I en krysning mellom to F 1 erteplanter som begge hadde genotype PpLl, var avkommet (F 2 generasjonen) slik fordelt: 142 purpur, lang 8 purpur, rund 11 rød, lang 47 rød, rund Stemmer dette med vanlig dihybrid krysning med 9:3:3:1 fordeling? I tilfelle ikke, hva kan forklaringen være? b) Ved å utføre en tilbakekrysning, (PpLl x ppll) fant man en rekombinasjonsfrekvens på 0,114 for genene purpur og lang. Hvilken fordeling av de fire kjønnscellene i oppgave a) ville du forvente med denne rekombinasjonsfrekvensen? (2 x 0,443 og 2 x 0,057) c) Regn ut forventede andeler av de fire fenotyper av F 2 generasjonen Ved fortsatt å bruke rekombinasjonsfrekvensen fra oppgave b)! (0,196, 0,054, 0,054, 0,6965) 1-13 a) Mor er heterozygot, blodtype A, far heterozygot, blodtype B. Hva er sjansene for hver av de fire blodtypene hos deres barn? (25%) b) Et barn har blodtype O, moren har A. Kan faren ha blodtype: -A? - AB? (Ja, nei) 1-14 En sjelden egenskap som skyldes er recessivt gen, a, forekommer hos 1 av mennesker. Hvor mange mennesker (hvor stor andel) er bærere av a? (1 av 156) 1-15 Det humane genet p er recessivt, og forekommer med en hyppighet på (0.2%) i en befolkning. I en homozygot form gir det sykdommen P. Hva er sjansen for at to 3

4 foreldre begge er bærere av genet? Hvor stor del av befolkningen vil ha sykdommen P hvis genet p hadde vært dominant? Angi antall personer av en befolkning på 1 mill Vi har genparene A/a, B/b og C/c (humane). Frekvensen av a er 1%, av b 1% og av c 1%. Man finner at frekvensen av personer som har både a og b er 0.01%, mens frekvensen av personer som har a og c er nesten 1%. Hva kan forklaringen være? (A;C;B) 1-17 Innen en befolkningsgruppe finner vi 4 alleler (varianter) i et bestemt locus, med følgende frekvens: A1: 10%, A2: 20%, A3: 30% og A4: 40%. Hvor mange ulike genotyper finner vi? Hva er frekvensen av hver (%)? 2. DNA - RNA Oppbyggingen av DNA: alle byggesteiner og sammensetningen av disse, puriner, pyrimidiner, nukloesid, nukleotid, polynukleotid. DNA-struktur og dimensjoner. Komplementære baser og tråder. Denaturering, renaturering, smeltepunkt, hybridisering, stringens. Sirkulært og lineært DNA, supervridd og relaxed sirkel, topoisomeraser. Sekundærstrukturer av RNA og ssdna, palindrom, hårnål. Interaksjon, DNA-protein. 2-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempler. 2-2 Tegn skjematisk et trinukleotid, begge komplementære tråder. Angi retning på trådene. Merk av alle typer kjemiske bindinger vi finner i et DNA-molekyl, og hvor vi finner dem. 2-3 Hvor mange omdreininger gjør en DNA-tråd på 100 basepar? 2-4 Hvor mange basepar er det i et DNA-molekyl på 1 µm? 2-5 Kan følgende sekvens av enkelttrådet DNA danne hårnål : G C A T G T T C G A C G A A C A G G C A? 2-6 Hva er definisjonen på smeltepunktet til DNA? Hvordan påvirkes smeltepunktet av DNA-DNA hybrid av: a) høyere G-C innhold, b) flere mismatch, c) høyere saltkonsentrasjon, d) kortere DNA? 4

5 2-7 For oligonukleotider som hybridiserer til DNA kan smeltepunktet, t m, anslås til med formelen 2x(A+T) + 4x(G+C). Hva er t m for følgende oligo: 5 - A T G G C T T A G A T A T G A T G C G T T G A G G C G A - 3? 2-8 Hvor langt DNA-område binder a) RNA-polymerase, b) lac-operator seg til? Fig viser operatorsekvensene OR1, OR2 og OR3. Disse består av to halvdeler som er palindromer. Finn disse. 2-9 Tabell 3-1 viser noen promotorsekvenser, spesielt -35 og -10 områdene. Hvor mye avviker de ulike promoterene fra consensus -sekvensen? 2-10 Tegn et sirkulært DNA-molekyl som er supervridd (supercoil) og et som er relaxed circle. Hva er ccc? 2-11 Hva er forskjellen på DNA og RNA? 2-12 Vi betrakter DNA-tråden 5 - A T G G C T T A G A T A T G. Avgjør om følgende korte DNA-sekvenser er homologe med noe av denne: a) 5 -C T T A G A b) 5 -A A T C T A c) T A A G C C 2-13 Tegn en bit av en RNA-sekvens som kan danne en hårnål-struktur Forklar forskjellen på 5 -A G G C og 3 -A G G C Et DNA-molekyl inneholder 23% A. Hvor mange % er det av de andre basene? 2-16 a) Hva er sannsynligheten for at vi på et gitt sted finner en vilkårlig sekvens på 4 baser langs en DNA-tråd (f.eks. A T G G)? Hvor stor er avstanden mellom slike sekvenser i gjennomsnitt? b) Samme for 10 baser c) Samme for 20 baser 3.TRANSKRIPSJON Det sentrale dogme, kodende og templat (antisense)-tråd, leseretning. Initiering av transkripsjon, promotere. Elomgering, RNA polymerisering. Terminering, rho. Generell oppbygning av et prokaryot gen. Leder-, spacer-områder. Ribosombindingssted (Shine- Dalgarno). trna. Den genetiske kode, degenerert kode, wobble-teori. 5

6 3-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempel? 3-2 a) Hvordan er den ytterste enden på e nylaget mrna? b) Hva slags sekvens er det vanlig å finne i 3 -enden 3-3 Vi har et fragment av en DNA-tråd (templattråden): 5 -A T G A C C T A G C T G G A A A T C A G-3. Tegn dette DNA-stykket som en dobbelttråd. Tegn det tilsvarende mrna og tre mulige polypeptidfragmenter. 3-4 Hva er en promoter? Hva menes med en promoter-konsensus-sekvens? Hvorfor er promoteren i fig en dårlig (svak) promoter? 3-5 Vi har aminosyresekvensen ala-gly-asp. Hvilke mrna-stykker koder for dette? 3-6 Hva er en terminatorsekvens? Hva karakteriserer denne? 3-7 Hvilke deler av et prokaryot gen inneholder DNA som ikke koder for det ferdige protein? 4. PROTEINER Spørsmål kommer senere! 5. TRANSLASJON Translasjon, initiering, fmet, A- og P-sete, translokasjon, stopp. 5-1 Forklar hva som skjer når en aminosyre kobles sammen med den neste under proteinsyntesen. 5-2 Sett opp en sammenligning mellom transkripsjon og translasjon (startpunkt, startmekanisme og enzymer, elongering, byggesteiner, terminering 6. REGULERING AV GENER Husholdningsgener. Lactose-operon; oppbygging, operator, repressor, induksjon, IPTG, camp-cap, lac-mutanter, regulering på translasjonsnivå. tryptofan-operon; Apo- og korepressor, attenuator, ledersekvens. Regulering av tidlig T7 og λ mrna, antiterminator. 6

7 6-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempler. 6-2 Hvorfor kalles reguleringen av lac-operon koordinert selvregulering? 6-3 Hvorfor kalles laktose en induser? Hvordan virker den? Hvorfor er IPTG en bedre induser enn laktose ved lab.arbeid? 6-4 Hva menes med en konstitutiv mutant? 6-5 Lages lac-repressoren konstitutuvt? Er det viktig at genet for lac-repressoren sitter nær lac-operatoren? Er det viktig at operatoren sitter nær promoteren? 6-6 Hvilket resultat kan mutasjoner i følgende områder av lac-operon tenkes å ha: i, o, p, z, a, y? 6-7 For følgende genotyper: Avgjør om β-galaktosidase kan lages (+) eller ikke (-), om det i så fall er induserbart (I) eller konstitutivt (K), og om cellen kan vokse med laktose som eneste karbonkilde: a) i + z - y + / i - z + y + b) i + z + y + / i - z + y + c) i + z - y + / o c z + y + d ) i + z + y - / i - z - y + e) i - z + y - / i - z + y + f) i - z + y + / i + o c z - y + g) i + p - y + / i - z - h) i + o c z - y + / i + z + y - i ) i + p - o c z - y + / i + z + y - j) i - p - o c z + y + / i - z + y Forklar virkningen som camp har på transkripsjonen. 6-9 Hva er sammenhengen mellom glukose og camp? 6-10 Mutantene cya - og cap - er ikke istand til å lage henholdsvis camp og CAP. Hva blir resultatet av disse mutasjonene? 6-11 Hvordan blir lac-operon regulert på translasjonsnivå? 6-12 Hvordan reguleres trp-operon fra sin promoter? 6-13 Forklar hvordan tryptofanmengden kan regulere ved hjelp av attenuator. 7

8 6-14 Vil glukose i cellen påvirke a) lac-operon b) trp-operon? Forklar. 7. EUKARYOTE GENER Nukleosomer, histoner, introner/exoner, cap, polya, RNA spleising, promotere (TATAboks), enhancere, transkripsjonsfaktorer, translasjon. 7-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempler. 7-2 Forklar forskjellen mellom prokaryote og eukaryote celler når det gjelder: Promotere og transkripsjonsstart, terminering av transkripsjon, translasjonsstart, translasjonsstopp, og generell oppbygging av et typisk gen. 7-3 Hvilke deler av et eukaryot gen inneholder DNA som ikke koder for det ferdige protein? 7-4 a) Hvordan er endene og strukturen av nylaget mrna? Hvilke forandringer skjer med mrna før det brukes ved transkripsjon? b) Hvilke deler (sekvenser) av nylaget mrna blir ikke brukt ved translasjon? 8. DNA REPLIKASJON, Gener og proteiner i DNA replikasjon, og deres betydning. DNA polymerase III og I, Klenow fragment. Leading og lagging strand syntese, Okazaki-fragmenter, replisom. Replikasjon av sirkulært DNA: rullende sirkel (σ) og θ. 8-1 Forklar begrepene over, gi evt. eksempler. 8-2 Hva vil være virkningen av følgende mutasjoner: oric -, pola -, rep -, dnaa -, dnab -, dnag -, ssb Hvilke enzymatiske egenskaper har: DNA polymerase I, DNA polymerase III, Klenow fragmentet. Undersøk hvilke andre DNA polymeraser som er i handelen. 8-4 Sammenlign replikasjon og transkripsjon (start, byggesteiner, kjemi, stopp). 8-5 Hvilket formål har exonuklease-aktiviteten under replikasjonen? 8-6 Både DNA polymerase og ligase binder sammen -OH med fosfat i en fosfoesterbinding. Hva er forskjellen? 8

9 8-7 Initieringen ved σ- og ved θ-replikasjon er prinsipielt forskjellig. Forklar dette. 8-8 Hvilken betydning har enzymet gyrase under replikasjonen? 8-9 E.Coli DNA blir replikert på ca. 40 min. fra ett ori. Hvor mange baser blir replikert pr. sekund? Hvor lang tid vil det ta å replikere et humant kromosom fra ett ori? 9. MUTASJONER, REPARASJON Ulike typer mutanter: Punkt-, delesjon, reversjon, ts, amber (nonsense),missense, supressor. Mutagener og deres virkning, UV-lys, baseanaloger, basereaktive stoffer, interkalerende stoffer. Proofreading. Mismatch repair (dam metylase), direkte reparasjon og excision repair. Regulering av SOS-reparasjon (LexA, reca). 9-1 Ved mismatch repair: a)hvordan oppdages feil? b)hvordan vet enzymet hvilken av DNA enkelttrådene som er den rette og den gale? 9-2 Hvilken innvirkning på transkripsjonen av SOS-genene vil følgende mutanter ha: lexa -, reca -? 9-3 Hvordan kan en punktmutasjon føre til følgende endring: a) Gly Ala b) Trp stopp c) Cys - Arg 9-4 Gitt DNA-sekvensen 5 A T G C C G A G T T T A C G A G A A. a) Skriv aminosyresekvensen. b) Hva blir resultatet hvis vi får byttet ut en G med en T? Ta for deg en G av gangen. 9-5 Forklar de mulige effekter av en punktmutasjon i kodende DNA. 9-6 Forklar effekten av 5-brom-uracil, og av nitritt. 9-7 Her er sekvensen til et lite stykke mrna og proteinet det koder for. Ser Thr Ala AGU ACG GCU En punktmutasjon inne i den DNA kodende sekvensen forandrer 9

10 aminosyresekvensen i proteinet til: Arg Tyr Gly Hva slags mutasjon var det snakk om? Vi kan i denne oppgaven definere en punktmutasjon som utbytting, innskudd eller delesjon av en base. 9-8 Tallene fra barn på et sykehus viser at 15 var rammet av en sykdom som skyldtes en dominant mutasjon. Tre av de 15 kom fra familier med sykdomshistorier med denne sykdommen, slik at bare 12 representerer nye mutasjoner. Hvor stor er mutasjonsraten for genet som forårsaker denne sykdommen? 9-9 Vil tautomerisme av tymin forårsake transisjon eller transverson? 9-10 Hva slags DNA skade vil ultrafiolett lys forårsake? Hvorfor er denne ødeleggelsen skadelig for cellen? 9-11 Hvilke to enzymer katalyserer direkte reversering av DNA ødeleggelse? 10. BAKTERIER, VIRUS Generell oppbygning og livsløp hos bakteriofag. Lytisk/lysogent livsløp. Telle bakterier/fag. M.o.i. Dyrke fag; Vekstkurve, burst size, single burst. Spesifisitet. Restriksjon - modifikasjon. T4; sirkulært og lineært kart, pakking av DNA. T7; tidlige og sene gener, T7 promotere. Mu; integrasjon, excision og pakking Hva er en bakteriofag? 10-2 Bruk T4 til å forklare hvilke deler av en fag består av, og hvilken funksjon hver del har Gjør greie for livssyklus hos T Du har ca bakterier i en liter løsning. Hvordan kan du bestemme antallet nøyaktig? 10-5 Du har ca fag i en liter løsning. Samme spørsmål Du dyrker bakterier og fag i en blanding. Litt av dette blandes med indikatorbakterier, og sås ut på agarplate. Hvis du får plakk, hva kan disse skyldes? 10

11 10-7 Du har ca bakterier som er tilsatt fag. Hvordan kan du eksperimentelt bestemme antall bakterier som det ikke blir adsorbert fag til? Hvis dette tallet er 2x 10 4, hva var m.o.i.? 10-8 Beregn antall uinfiserte fag hvis vi infiserer 10 6 bakterier med 10 7 fag. Hvor mange bakterier blir infisert av 1 fag? Hvor mange av 2 eller flere? 10-9 Hvor mange fag kan produseres pr. bakterie i et lytisk livsløp? Hvordan kan man finne dette eksperimentelt? Vi har 10 6 bakterier, og tilsetter 1 fag. Generasjonstiden for bakterien er 30 min., for fagen 20 min., og antall fag er 100. Vis hvordan antall bakterier og antall fag utvikler seg med tiden T4 infiserer E.coli, men ikke Pseudomonas-arter. Hva kan forklaringen være? Enkelte E.coli bakterier kan plutselig bli resistente mot T4. Hvordan kan dette forklares? Hva menes med λk-fag? Forklar hvorfor λk ikke kan infisere E.coli B. Hvorfor kan den infisere E.coli K? Hvorfor kan den infisere E.coli C? Forklar livsløp hos λ-fag Hvilket(t) fag gen(er) vil ikke uttrykkes etter at λs lytiske syklus er i gang? Hvilke(t) fag gen(er) vil ikke uttrykkes i en λ lysogen? pn er et umiddelbart tidlig produkt som kreves for forsinket transkripsjon, selv om det er veldig ustabilt. Hvorfor vil ikke dette være noe problem for fortsatt tidlig uttrykning i den lytiske syklys? RNA polymerase som transkriberer Pre går igjennom cro. Kan dette resultere i iuttrykning av cro? Hvorfor, eller hvorfor ikke? Ville du klassifisere antiterminator aktiviteten til pn som positiv eller negativ kontroll? Under hvilke livsbetingelser får vi en lysogen livssyklus? Forklar hvordan rekombinasjonskart gir sirkulært genkart for T4. 11

12 10-22 Hva er terminal redundant DNA? Forklar hvordan det oppstår hos T PLASMIDER Plasmid konjugasjon, F +, F -, F. Plasmid overføring; mekanisme og kontroll. Plasmid replikasjon; mekanisme og kontroll. Plasmid typer, F, R, Col og andre Hva er et plasmid? 11-2 Hva vet du om størrelsen på plasmider? 11-3 Hvilke hovedtyper av plasmider har vi? 11-4 Hva er et F - plasmid? 11-5 Hva menes med skrivemåten F lac + / lac - str-s, og med str-r? Hvilken fenotype har disse? Ved å blande disse bakterier, er det da mulig å få følgende genotyper: a) lac + str-r b) F lac + / lac - str-r c) F lac + / lac + str-r d) lac - str-s 11-6 Gi en forklaring på disse begrepene: 11-7 a) pilus, b) konjugativ plasmid, c) nicking protein, d) orit, 11-8 Når, hvor og hvordan foregår replikasjon av DNA ved plasmidoverføring? 11-9 Hvilken virkning har kloramfenikol på plasmid-replikasjon? Forklar dette To plasmider, A og B, er inkompatible. Hva innebærer dette, og hva er forklaringen på fenomenet? Kan man tenke seg et plasmid uten noen gener i det hele tatt? 12. BAKTERIOFAG λ Lineært/sirkulært DNA, cos. Replikasjon, θ og σ. Ter-kutting. Regulering av tidlige λ-gener; repressorer, promotere, operatorer, terminatorer, antiterminatorer. Integrasjon av λdna, mekanisme og genetikk, int og xis. Induksjon, UV-unduksjon. Rekombinasjon i λ, red og gam. 12

13 12-1 Når i λ s livssyklus er dets DNA sirkulært og når er det lineært? 12-2 Forklar hvordan λ DNA sirkulariseres Hva er cos, dets funksjon og oppbygging? 12-4 Hva vet du om b2 -området i DNA? 12-5 Forklar fenomenet med immunitet hos λ Gjør greie for kontrollen av transkripsjon av tidlige gener hos λ, både ved lysogen og lytisk utvikling Gjør greie for betydningen av hvert av DNA-områdene: int, pi, ciii, tl1, N, pl, ol, ci, prm, or1, or2, or3, cro, tr1, pre, cii, O, P, Q. Prøv å forutsi hva en mutasjon i hver av disse områdene vil føre til Forklar hvordan λdna integreres i E. coli kromosomet. Hvilke DNA- områder som deltar, og hvilke ligger ved siden av Hvordan reguleres int-genet? Hvordan blir xis-genet aktivisert ved induksjon? Forklar likheten og forskjellen mellom integrasjon og excision-reaksjonene. Hvordan kan enzymet integrase alene katalysere bare den ene av dem, mens det deltar i begge? 13. FLYTTING AV GENER Transposoner. Eksempel på flytting av gener. Bygning av IS-elementer, IR, sammensatte transposoner. Transformasjon. Oppdagelse av transformasjon. DNA-opptak; kompetente celler. Kotransformasjon, genkart. CaCl 2 -transformasjon. Konjugasjon. Hrf. Mekanisme og genetikk for dannelse av Hrf og overføring av DNA fra Hrf. Time of Entry, genkart. Dannelse av F - -plasmider. Transduksjon: Generell transduksjon, kotransduksjon. Spesiell transduksjon, λ: gal/bio, d/p. Rekombinasjon: Stedsspesifikk rekombinasjon. Homolog rekombinasjon og rec A og rec BC. rii-mutanter hos T4, genkart; rekombinasjon, komplementasjon Transposoner: 13

14 13-1 Gi et eksempel på flytting av gener hos eukaryote organismer, og hos prokaryote Hvilke av de følgende par med DNA sekvenser kan være terminale repetisjoner (IR) i et bakterielt IS-element? a) 5 -GAATCCGCA-3 og 5 -ACGCCTAAG-3 b) 5 -GAATCCGCA-3 og 5 -CTTAGGCGT-3 c) 5 -GAATCCGCA-3 og 5 -GAATCCGCA-3 d) 5 -GAATCCGCA-3 og 5 -TGCGGATTC Er det DNA-homologi mellom a) transposon DNA (som skal bli overført) og b) det DNA-området som skal motta transposonet (target)? 13-4 Hva er typisk for oppbyggingen av et transposon? Transformasjon 13-5 Hva er en kompetent celle? 13-6 Er alle bakterieceller kompetente til enhver tid? Forklar Hvordan kan man i laboratoriet gjøre en bakteriecelle kompetent? 13-8 Ved transformasjon er det en donor ( A + B + C + ) og en recipient (A - B - C - ). Av recipienter som er blitt A +, er samtidig 64% B + og ingen C +. Av recipienter som er blitt B +, er samtidig 8 C +. Hva er rekkefølgen av genene? 13-9 Hvordan gjennomføres CaCl 2 -transformasjon, og når brukes det? En bakteriestamme er a - b - c - d - og blir transformert med DNA fra en celle som er a + b + c + d +. Noen av celler blir a +, og av disse er samtidig 10% også b +, 5% også c + mens 1% er d +. Av dem som er b + er samtidig 2% c + og 8% d +. I hvilken rekkefølge sitter genene abcd? DNA fra en prototrof stamme av E. coli blir isolert og brukt til å transformere en en auxotrof stamme som ikke kan syntetisere puriner (purb - ) pyrimidiner (pyrc - ) og aminosyren tryptofan (trp - ). Tryptofan ble brukt som markør for å bestemme om transformasjon hadde skjedd (selektiv markør).hva er genrekkefølgen og den relative kotransformasjonsfrekvensen mellom loci dersom følgende data foreligger? trp + pyrc + purb + 86 trp + pyrc + purb

15 trp + pyrc - purb + 67 trp + pyrc - purb I et transformasjonseksperiment, ble en a + b + c + brukt som donor og en a - b - c - stamme brukt som resipient. Ett hundre a + transformanter blir selektert og deretter replika platet for å bestemme om b + eller c + er tilstede. Genotypene til transformantene ble som vist under. Hva kan du konkludere med om den relative posisjonen av genene? a + b - c - 21 a + b - c + 69 a + b + c - 3 a + b + c + 7 (acb) kf ab = 0.1, kf ac = 0, I et transformasjonsforsøk ble en a + b + c - stamme brukt som donor og en a - b - c + stamme brukt som resipient. Hvis du selekterer for a + transformanter vil den sjeldneste klassen være a + b + c +. Hva er rekkefølgen av genene? (acb) DNA fra en bakteriestamme som er a + b + c + blir brukt til å transformere en stamme som er a - b - c -. Antall av hver transformerte genotype er listet opp nedenfor. Hva kan sies om den relative posisjonen av genene? Genotype a + b - c a - b + c a - b - c a + b + c - 11 a + b + c + 6 a + b - c + 93 a - b + c + 14 Antall (ac b) kf ab =0,022, kf ac =0,127, kf bc =0,026 15

16 1. En villtype stamme av B. subtilus blir transformert med DNA fra en stamme som ikke kan vokse på galaktose (gal - ) og også trenger biotin for vekst (bio - ). Transformanter blir isolert ved å utsette de transformerte cellene for minimal medium med penicillin for å drepe villtypecellene. Etter at penicillinet er fjernet, brukes replika-plating for å etablere genotyper til 30 transformanter: klasse 1 gal - bio - 17 klasse 2 gal - bio + 4 klasse 3 gal + bio - 9. Hva er den relative kotranstransformasjons-frekvensen til de to loci? Konjugasjon Hva menes med F +, F -, F og Hrf? Hva er mekanismen når F integreres i et bakteriekromosom? Kan F integreres på ulike plasser i kromosomet? Kan F åpnes på ulike steder når det skal integreres? Er det noe krav til likhet mellom områder av F og av bakterie-dna når integrasjon skjer? Forklar fig Hvilke gener overføres her, og mellom hva slags DNA? Hvordan starter overføringen ved Hfr-overføring? Hvilke bakteriegener er det minst sjanse for å overføre ved Hfr-overføring? Hvordan gjennomføres et time-of-entry forsøk? Hva menes med: Hfr a + b + c + X F - a - b - c -? Hvis vi avbryter krysningen over etter 5 minutter, og lar bakterien vokse, får vi registrert noen F - b +? Hva har skjedd? I samme krysning som over registrerer vi noen F - a + etter 8 minutter, mens det ikke er mulig å registerere noen F - c + selv etter 90 minutter. Hva sier dette om plasseringen av genene a, b og c? 16

17 13-28 Hvordan kan et F-plasmid bli F? Genene p, f og q har "time og of entry" (genkart) ved 7, 11 og 19 minutter. Hva er genrekkefølgen og hva er kart distansen i units mellom genene i forhold til overføringsstartpunktet? Suspensjoner av 2 stammer av E. coli, betegnet nr 1 (villtype, A +, B +, C +, D + og str s ) og nr 2 (mutant A -, B -, C -, D - og str r ), ble blandet, fikk stå stille i 30 min og ble deretter ristet kraftig for å avbryte eventuell konjugering. Prøver ble spredt på plater med minimal agar tilsatt streptomycin og stoffene svarende til genene A, B, C og D i følgende kombinasjoner: ABD, BCD, ACD, og ABD. Antall kolonier som vokste opp var: Medium Kolonier ABC 5 BCD 43 ACD 20 ABD 115 Forutsatt at genene A, B, C og D er blitt overført fra stamme nr. 1 til stamme nr. 2, a) I hvilken rekkefølge har dette skjedd? b) Hvor i donor stammens kromosom var F-faktoren integrert? c) Har bakterien mistet gener p.g.a. denne overføring? I tilfelle ikke, hvorfor ikke? En Hfr stamme med genotype met - his + leu + trp + og som overfører met genet veldig sent, ble konjugert med en leu - met + trp - his - (Ts) recipient. His(Ts) mutasjonen medfører et krav for histidine ved 42 o C. Etter flere timers konjugasjon ble blandingen fortynnet og platet ut på minimalmedium supplert med fire ulike tilsetningsstoffer. Platene ble inkubert ved 42 o C. Tilsetningsstoffene i platene og antall kolonier pr plate var følgende His + Trp 250 His + Leu 50 Leu + Trp 500 His 10 a) Hva er vitsen med met - mutasjonen i Hfr stammen i dette eksperimentet? Hvilke gener overføres som nr en, nr to og nr tre? b) Du kjenner nå rekkefølgen av disse tre mørkørene, men du vet ingenting om deres eksakte posisjon på kromosomet. Hva slags eksperiment ville fortelle deg hvor disse 17

18 mørkøren var lokalisert på kromosomet? Fem Hfr-stammer (A til E) som inneholder de samme vildtypemarkører, blir krysset med en F - - stamme med de alternative allelene. Ved bruk av avbrutt konjugering, ble det funnet at hver Hfr-stamme overførte sine gener i en helt spesiell rekkefølge, som var forskjellig fra alle de andre 4 stammene. Rekkefølgen for markørere i hver sin stamme er vist i tabellen: Hfr-stamme: A B C D E mal + ade + pro + pro + his + str s his + met + gal + gal + ser + gal + xyl + his + pro + ade + pro + mal + ade + met + his + met + str s ser + xyl + a) Hva er rekkefølgen av genene i den bakteriestammen som disse Hfr-stammene skriver seg fra? b) Hvilken donoregenskap ville du selektere for i recipienten i hvert tilfelle for å oppnå rekombinanter som også vil bli Hfr? Det er utlevert to stammer av E.coli. Den ene er en F + -stamme (Hfr) som er prototrof for arginin, alanin, glutamin, prolin og leucin (gi de respektive genene symbolene arg +, ala +, gln +, pro + og leu + ), mens den andre stammen er F - og auxotrof for de samme aminosyrene (arg -, ala -, gln -, pro - og leu - ). Rekkefølgen av disse genene på bakteriekromosomet er arg-ala-gln-pro-leu, hvor den enden med arg-genet er den som først går inn i mottagercellen ved konjugasjon. F - -stammen dør når den utsettes for pencillin, fordi den har et allel for pencillin sensitivitet. pen s, mens F + -stammen tåler pencillin fordi den inneholder allelet pen r, som gir resistens mot penicillin. Hvordan ville du gå frem for å lokalisere pen lokuset på bakteriekromosomet i forhold til arg, gln, pro og leu? Transduksjon Hvordan oppstår en generelt transduserende fag? 18

19 13-30 Hvor mange gener inneholder en slik fag? Hva må skje for at en transduserende fag skal overføre gener til en bakterie? P1 infiserer E.coli Leu +. Forklar hva som skjer, og hvordan man kan påvise at transduksjon foregår Hva er kotransduksjon, og hvordan kan dette fenomenet brukes til å konstruere et genkart? Du utfører en trefaktor krysning hvor du bruker fag P2 til å transdusere DNA med disse tre markørene: Awk + Kat + og Nrd + inn i en Awk - Kat - og Nrd - recipient. Du selekterer for Awk + transduktanter og observerer følgende. Awk + Kat - Nrd - : 638 Awk + Kat - Nrd + : 309 Awk + Kat + Nrd + : 115 Awk + Kat + Nrd - : 1 a) Hva er rekkefølgen av mørkørene? b) Hva er kotransduksjonsfrekvensene mellom awk og kat og awk og nrd? Du utfører en trefaktorkrysning hvor du bruker fag P22 til å transdusere markørene A + B + C - fra en donor til en A - B - C + recipient. Du selekterer A + transduktanter og får følgende resultat: A + B + C + : 2 A + B + C - : 120 A + B - C + : 517 A + B - C - : 314 a) Hva er rekkefølgen av disse tre markørene? b) Finn kotransduksjonsfrekvensen for AC og AB! Hvordan oppstår en spesielt transduserende fag? Hva er λ gal, λ p gal og λ p bio? 19

20 13-38 Hvorfor vil noen λ gal være p og noen d? En λ gal + infiserer en E.coli gal -. a) Hva har skjedd hvis resultatet blir E.coli gal +? b) Hva har skjedd hvis resultatet blir en delvis diploid E.coli (gal + / gal - )? 20. NOEN DNA-TEKNIKKER Elektroforese av DNA, PCR, DNA-sekvensering (dideoksy), Southern blotting Forklar alle begreper i oversikten over (kap. 20). For metoder: forklar prinsipp og fremgangsmåte Hvordan kan man finne størrelsen av et DNA-fragment ved elektroforese? 20-3 Du starter PCR med ett DNA-molekyl, dvs 2 tråder. Hvor mange tråder har du etter: a) 5, b) 10, c) 20, d) 30 runder? Hvor mange av disse er ikke korte tråder? 20-4 Ved PCR kan man f.eks. bruke temperaturene 94 o C og 60 o C. Hva skjer ved disse temperaturene? Noen ganger velger man kanskje 94, 50 og 72 o C. Hva kan begrunnelsen for dette være? 20-5 Forklar hva som skal gjøres, og hva som skjer ved de enkelte trinn i Southern blotting teknikk Tegn dideoksy-atp. Hvilken funksjon har denne ved DNA-sekvensering? 20-7 Du skal sekvensere: 5 ATTGCTTACGGTCGTAA---3. Primeren er på 15 baser, og binder seg til siden for den angitte sekvens. På hvilken side binder den seg? Hvor lange DNA-tråder dannes i rørene ddatp, dttp, ddctp og ddgtp? Prøv å tegne gelen som skal analyseres Ved Southern blotting, hva er hensikten med følgende: prehybridisering, denaturering og probe. 20

21 21. KLONING: DNA-FRAGMENT Restriksjonsenzymer, ulike typer. cdna; syntese av 1.tråd og 2.tråd, isolering av mrna,. DNA-sekvens fra aminosyresekvens Den hypotetiske bakterien Xenobacterium giganticus produserer en restriksjons endonuklease. I følge konvensjonen for navngivning av disse enzymene, hva ville du kalle dette enzymet? 21-2 XhoI har C/TCGAG. PstI har CTGCA/G. StuI har AGG/CCT. Tegn endene som oppstår ved kutting med disse tre enzymene. Tegn begge tråder. Angi 5 P- og 3 OHender Hvilke av disse kan være restriksjonsseter: a) AGGCCT b) AGGAGG c) AATTAA d) AATATT e) AGCT f) GCCG 21-4 Hvor mange DNA-sekvenser kan kode for aminosyresekvensen: ---Ser-Ala-Thr-? 21-5 Hvilke enzymer trengs for å lage cdna? 21-6 Her er aminosyresekvensen til en del av et hypotetisk protein og du ønsker å klone genet for dette. Phe-Leu-Pro-Trp-Ile-Gln-Met-Arg-His a) Hvilken sekvens på 5 kodons fra aminosyresekvensen over vil gi en 15 nukleotideres probe med minst mulig degenererthet? b) Hvor mange ulike 15 nukleotideres prober ville du måtte lage for å være sikker på at en av de 15 probene passer perfekt til den korresponderende sekvensen i ditt klonede gen? c) Hvis du startet proben ett kodon til venstre i forhold til den du valgte, hvor mange ulike 15 nukleotiders prober ville du da behøve å lage? d) Hvis du startet proben din ett kodon til høyre iforhold til den du valgte, hvor mange ulike 15 nukleotideres prober ville du da trenge å lage? 21

22 22. DNA SPLEISING Ulike metoder å koble sammen DNA fragmenter; DNA ligase, homopolymer tailing, linkere, ulike måter å hindre selvligering Vi har et DNA-molekyl på 100kb. Hvor mange fragmenter kan vi regne med å få ved fullstendig kutting med: a) EcoRI, b) Sau3A, c) NotI? 22-2 Vi ønsker å få en 5 AT ende (overheng) etter restriksjonskutting. Foreslå 4 mulige 6bp restriksjonsseter som gir dette Hvilken rolle spiller restriksjonsenzymer ved kloning? 22-4 Forklar hvorfor alkalisk fosfatase hindrer selvligering. (5 P gruppen spaltes av, slik at vi får 5 OH. Denne kan ikke bindes sammen med 3 OH med DNA ligase) 22-5 Restriksjonsenzymer kan skape 3 slags DNA-ender. Hvilke? 22-6 Hvilke tre metoder kan brukes til å ligere sammen to blunt ends? Forklar hva som gjøres, og hva som skjer ved hver av disse metodene Hvordan kan man sikre seg at et innskudd havner i en bestemt retning i en vektor? 22-8 Et DNA-molekyl kuttes med ett restriksjonsenzym, vi analyserer med gel elektroforese, og får bare ett bånd. Hva kan forklaringen være? 23. VEKTORER Plasmidvektorer; pbr322, puc. Insertional inactvation, α-komplementasjon, replikasjonskontroll, polykloningsseter. Ekspresjonsvektorer. λ-vektorer. Cosmider. Bakteriofag M13 og M13-vektorer. Phagemider; pbluescript og λzap. Produksjon av humant protein fra klonet DNA, prinsipp og problemer. Skyttelvektorer Anta at du transformerer bakterier med et rekombinant DNA og, ved et uhell, plater de transformerte cellene på et medium som ikke inneholder antibiotika. Hva slags resultat ville du få? Hvorfor? 23-2 Du ønsker å sette et gen inn i BamHI setet i pbr322. Hvilket antibiotikum ville du bruke for å skille celler som har tatt opp plasmid uten innskudd og de som har tatt 22

23 opp plasmid med innskudd? Sjekk med kartet over pbr322, figur Er det mulig å bruke antibiotika for å bestemme om pbr322 har mottatt et innskudd i sitt EcoRI sete? Hvorfor, eller hvorfor ikke? 23-4 Du har utført et kloningsforsøk med puc18 som vektor. Etter transformasjonen sår du de transformerte cellene ut på plater tilsatt IPTG, X-gal og ampicillin. Etter inkubering observerer du at det vokser både blå og hvite kolonier på skålene. Hvilke kolonier ville du tatt vare på dersom du ønsket å dyrke opp celler med innskuddet? Forklar Hva er fordelen med å bruke induserbarhet i en ekspresjonsvektor? 23-6 Et humant gen er klonet inn i E.coli, men vi får ikke uttrykt genet. Hva kan grunnen være? 24. DNA-BIBLIOTEK Konstruksjon av genomisk og cdna bibliotek. Screening av bibliotek med prober eller antistoff. Merking av slike. Mutagenese Ville et plasmid som puc18 være et godt valg som vektor dersom du ønsker å konstruere et genbibliotek over en kompleks organisme? Hvorfor, eller hvorfor ikke? 24-2 Ville et plasmid som puc18 være et godt valg som vektor dersom du skulle lage et genbibliotek over et forholdsvis enkelt viralt genom? 24-3 Du har laget et cdna bibliotek i λgt11 ved å bruke mrna fra en erteplante. Du ønsker å identifisere en rubisco klon (ribulose bifosfat karboksylase enzym som er viktig under fotosyntesen) blant kloner i biblioteket. Du har rubisco cdna fra tobakk som du ønsker å bruke som probe. Når du hybridiserer proben med plakkene i biblioteket, ville du bruke høyere, lavere eller den samme temperaturen som du ville ha brukt for å hybridisere tobakks DNA mot en tobakk rubisco klon? Hvorfor 24-4 Her er aminosyresekvensen til en del av et hypotetisk protein hvis gen du ønsker å klone. Pro-Arg-Tyr-Met-Cys-Trp-Ile-Leu-Met-Ser a) Hvilken fem-aminosyre sekvens ville gi en 15-mer probe med minst mulig 23

24 degenererthet? b) Hvor mange ulike 15-merer ville du behøve å lage for å være sikker på at proben passer den korresponderende sekvens i ditt klonede gen perfekt? c) Hvis du startet proben din en aminosyre til venstre for den du valgte i a), hvor mange ulike 15-merer ville du trenge å lage? Bruk den genetiske kode til å bestemme degenerertheten Når vi bruker λgtii som cdna klonende vektor, kan vi screene etter det uttrykte av det innskutte cdna (genproduktet) som et fusjonsprotein, ved å bruke antistoffer som vis i fig For å få dette til å fungere må cdna være i samme retning og samme leseramme som det λ genet som det er fusjonert til. Hva er den teoretiske fraksjon som ville tilfredstille disse to betingelsene fra en populasjon av λgtii cdna kloner som inneholder fragmenter av genet vårt? Hvorfor? 24-6 Et spesielt animalsk virus inneholder et sirkulært DNA som har fem gjennkjennelses seter for restriksjonsenzymet EcoRI. Infiserte celler lager en stor mengde virale overflate proteiner. Et cdna korresponderende til mrna for dette overflateporteinet har blitt klonet. Hvordan ville du bruke et Southern blot til å bestemme hvilke(t) EcoRI fragment(er) som inneholder genet for det virale overflateprotein? 24-7 Her er base og aminosyresekvensen til en del av et gen og dets proteinprodukt: Thr Asp Ala Val Gly ACC GAT GCA GTG GGC Du skal utføre en sete-dirigert mutagenese forsøk for å forandre genet slik at det koder for Ser i stedet for Ala i dette området. Hvilken 15-mer ville du konstruere som primer for å lage denne forandringen? Bruk den genetiske kode for å finne Ser kodonene Du har klonet et gen fra en petunia plante og ønsker å vite hvilket vev (blader, stilk, røtter, blomster eller frø) som transkriberer dette genet i størst grad. Hvordan ville du bruke et Northern blot for å besvare dette spørsmålet? 24-9 Hva vil Northern blottet i forrige spørsmål fortelle deg ved siden av graden av transkripsjon av petunia genet i hvert vev? 24

25 30. DET HUMANE DNA Oppbygging av humane kromosomer og gener. Polymorfisme Anta at vårt DNA har polypeptidkoder, og at disse gjennomsnittlig består av 200 aminosyrer, og at 10% av hvert gen er exoner. Hvor mange % av vårt genom er da gener? 30-2 Hvis en celle inneholder 1000 mitokondrier med 10 DNA-molekyler hver. Hvor mange % av cellens DNA er dette? 31. ANALYSE AV HUMANT DNA RFLP, ASO-prober, VNTR, PCR 31-1 Forklar prinsippet og de nødvendige eksperimentelle trinn som ved bruk av RFLP, VNTR og ASO-prober Hvordan kan RFLP, VNTR og ASO kombineres med PCR? Forklar forskjellen med og uten bruk av PCR. 25