FORBEDRET HUMANISERT ANTI-HUMANT

Transkript

1 FORBEDRET HUMANISERT ANTI-HUMANT alfa9-integrin-antistoff 1 10 Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et forbedret humanisert anti-humant a9- integrin-antistoff som definert ved de medfølgende kravene. Den vedrører nærmere bestemt et forbedret humanisert Y9A2-antistoff med en aktivitet for å binde til et humant α9-integrin-protein for å inhibere α9-integrin-avhengig celleadhesjon, og forbedret aktivitet og/eller egenskap sammenlignet med murint anti-humant α9-integrin-antistoff Y9A2. Det humaniserte antistoffet forventes å være et legemiddel for diagnostisering, forebygging eller behandling av autoimmune sykdommer slik som revmatoid artritt, immune sykdommer slik som allergier og transplantatavstøtninger og andre forskjellige sykdommer involvert ved α9-integrin i deres patogenese. Bakgrunnsteknikk Integrin, et celleoverflateglykoprotein, er et adhesjonsmolekyl som fungerer hovedsakelig som reseptor for celleadhesjon til ekstracellulære matriser (kollagen, laminin og lignende) og elementer i immunglobulinfamilien (ICAM-1, VCAM-1 og lignende) og medierer signaltransduksjon fra ekstracellulære matriser. Celler mottar derved signaler fra de ekstracellulære matrisene, og differensiering, proliferasjon, celledød og lignende induseres. Integrin er en heterodimer bestående av de to underenhetene α-kjede og β-kjede; det er forskjellige α-kjeder og β-kjeder som forekommer i en lang rekke kombinasjoner, og det er 24 elementer i integrinsuperfamilien. Integrinknockoutmus er dødelige eller syke uavhengig av hvilken underenhet som mangler, hvilket antyder at individuelle integriner er nødvendige for opprettholdelsen av liv. Integrin, som overfører informasjon om omgivelsesbetingelser til celler for å stimulere deres responser, antas derfor å fungere i alle situasjoner med biologiske fenomener, og mediere et bredt område av patologiske tilstander. 3 Som sådan er integrin uunnværlig for organismers overlevelse og antas å spille roller også ved syke tilstander; det er rapportert noen tilfeller i hvilke deres inhibering bidrar til å forbedre patologiske tilstander. En inhibitor av blodplatespesifikt integrin αiibβ3 er for eksempel godkjent som terapeutisk legemiddel for PCTA-restenose kjent som abciksimab (handelsnavn: ReoPro; Eli

2 2 Lilly). Natalizumab (handelsnavn: Antegren; ELAN Company), en α4β1(vla4)- inhibitor, er godkjent som terapeutisk legemiddel for multippel sklerose. αvβ3- inhibitoren Vitaxin (MEDIMMUNE Company) er under utvikling i kliniske studier for sin neovaskuleriseringsinhiberende virkning, osteoklastaktiveringsinhiberende virkning og lignende Integrin α9β1 er uttrykt i makrofager, NKT-celler, dendrittiske celler og nøytrofiler og spiller angivelig viktige roller i infiltreringen og adhesjonen av disse inflammatoriske cellene, benresorpsjon og lignende. Det er nylig rapportert at integrin α9β1 er involvert i osteoklastdannelse, og dens involvering i bendestruksjon er foreslått (ikke-patentdokument 1). Kjente ligander derav inkluderer trunkert osteopontin (N-terminal OPN), VCAM-1, Tenascin-C og lignende. Vesentlig forhøyede nivåer av integrin α9β1 er klinisk observert i synovialvevet hos pasienter med revmatoid artritt (ikke-patentdokument 2). Et monoklonalt antistoff som binder spesifikt til α9-integrin-protein for å inhibere eventuell α9-integrin-avhengig celleadhesjon, ville derfor være nyttig i diagnostiseringen, forebyggingen eller behandlingen av forskjellige sykdommer involvert av α9-integrin i deres patogenese. Antistoffer som er rapportert å vise funksjonsinhiberende virkning på humant α9-integrin, er det murine monoklonale antistoffet Y9A2 (ikke-patentdokument 3) og 1K11, 24I11, 21C og 2B6 (patentdokument 1) og 281 (patentdokument 2). In vitro-forsøksresultater har vist at disse antistoffene kan undertrykke humant α9-integrin-avhengig celleadhesjon. Idet Y9A2 inhiberer celleadhesjon til både osteopontin og Tenascin-C, er det blant disse betraktet som mest lovende som kandidat for et antistofflegemiddel mot α9-integrin Det skal imidlertid bemerkes at Y9A2 er et museavledet antistoff fremstilt ved å immunisere en mus med et antigen, og direkte administrering derav til et menneske er derfor praktisk talt umulig med hensyn til sikkerhet (induksjon av antigenisitet) og effekt (forkortet halveringstid). En modifisering for å konvertere antistoffet til et molekyl med en aminosyresekvens av humant antistoff under opprettholdelse av aktiviteten av Y9A2, dvs. humanisering, må derfor utføres. Som produksjonsfremgangsmåte for humanisert antistoff er en fremgangsmåte basert på fremgangsmåten inkludert poding av aminosyre av

3 3 komplementaritetsbestemmende region (heri nedenfor tidvis betegnet CDR) som utformet av Winter et al. (ikke-patentdokument 4) for øyeblikket mest generell. Det er også velkjent her at samtidig poding av ikke bare CDR, men også ikke- CDR-aminosyre involvert i den strukturelle opprettholdelsen av CDR eller binding med et antigen, dvs. en strukturregion (heri nedenfor tidvis betegnet FR), fra et fremmed antistoff overfor donoren av CDR-aminosyre til et humant antistoff som skal være akseptoren av CDR, er viktig for reproduksjon av den iboende aktiviteten av donorantistoffet (ikke-patentdokumentene 4 og ) Produksjon av et humanisert antistoff basert på CDR-poding inkluderer imidlertid flere problemer. Det mest generelle problemet er først at også en egnet seleksjon av FR-aminosyre nødvendig for reproduksjon av aktiviteten av et donorantistoff ikke kan eliminere vanskelighetene med å oppnå et humanisert antistoff med affinitet for et antigen og biologisk aktivitet som overstiger dem for donorantistoffet De siste årene er et stort antall av kimært antistoff, humanisert antistoff og humant antistoff markedsført som monoklonale farmasøytiske produkter. Den virkningsfulle dosen av noen som helst av dem er ekstremt høy og er flere mg per 1 kg kroppsvekt. Antistofflegemiddel er derfor uunngåelig dyre, hvilket i sin tur øker den økonomiske byrden på pasientene og de medisinske kostnadene. De viktigste faktorene som definerer den virkningsfulle dosen av et antistofflegemiddel, inkluderer antistoffets affinitet for et antigen og mengden av antigen som er til stede i kroppen. Fra slike trekk fører en forbedring i et antistoffs affinitet for et antigen særlig til en reduksjon i dosen, og er en ekstremt nyttig forbedring, hvilket også resulterer i reduksjon av den økonomiske byrden på pasienter og medisinske kostnader For å sikre et antistoffs forbedrede affinitet for et antigen benyttes ofte en fremgangsmåte inkludert introduksjon av aminosyresubstitusjon i en variabel region i antistoffet. Når antistoff og antigen er forskjellige, varierer også sekvensen og den steriske strukturen hos CDR-aminosyre samt posisjonen til aminosyre involvert i antigen-antistoff-interaksjoner. Det er derfor praktisk talt umulig å definere posisjonen til FR-aminosyre som skal podes sammen med CDR, slik det gjelder for hvilket som helst antistoff.

4 4 Et annet problem er at mens hele CDR-aminosyren i et antistoff fra donormus generelt er podet til et humant templatantistoff i fremstillingen av et humanisert antistoff basert på CDR-poding, viser en aminosyresekvens av CDR avledet fra et murint antistoff, som er viktig for binding med et antigen, tidvis antigenisitet mot mennesker, hvilket ofte genererer et anti-idiotype-antistoff. 10 For produksjon av et humanisert antistoff er seleksjon av et egnet akseptorantistoff og seleksjon av CDR-aminosyre og FR-aminosyre som skal substitueres, nærmere bestemt uunnværlig for å frembringe en høyere aktivitet enn hos et donorantistoff samtidig som generering av antigenisitet hos mennesker og redusert stabilitet hos antistoffet unngås. Dette krever betydelig sinnrikhet og prøving og feiling. patentdokument 1: WO 2006/07784 patentdokument 2: WO 2008/ ikke-patentdokument 1: Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: ikke-patentdokument 2: The Journal of Clinical Investigation, 200, 11: ikke-patentdokument 3: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 1: ikke-patentdokument 4: Science, 239, (1988) ikke-patentdokument : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, (1989) Beskrivelse av oppfinnelsen 2 Problemer til løsning ved oppfinnelsen 30 Et formål med den foreliggende oppfinnelsen er å løse de ovennevnte forskjellige problemene knyttet til humaniserte antistoffer og tilveiebringe et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff med forbedret aktivitet og/eller egenskap sammenlignet med et anti-humant α9-integrin-antistoff fra donormus (Y9A2). Middel til løsning av problemene

5 Den foreliggende oppfinnelsen omfatter følgelig oppfinnelsene ifølge (1) (1) som medisinsk eller industrielt nyttige stoffer og fremgangsmåter. (1) Et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff omfattende en variabel region i tungkjeden og en variabel region i lettkjeden valgt fra følgende: 10 (a) en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:11 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:17 (b) en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:13 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:17, og (c) en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:1 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:9. 1 (2) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori den konstante regionen i tungkjeden i antistoffet er humant Igγ1. (3) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori den konstante regionen i lettkjeden i antistoffet er humant Igκ. 20 (4) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori den konstante regionen i tungkjeden i antistoffet er humant Igγ1 og den konstante regionen i lettkjeden i antistoffet er humant Igκ. () Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori tungkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:19 og lettkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2. 2 (6) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori tungkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:21 og lettkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2. (7) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet beskrevet i (1) ovenfor, hvori tungkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:23 og lettkjeden består av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO: (8) Et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i tungkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1), og en sekvens som koder for den variable regionen i lettkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1).

6 6 (9) En ekspresjonsvektor omfattende et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i tungkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1), og et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i lettkjeden i det humaniserte anti-humane α9- integrin-antistoffet ifølge (1) (10) En vertscelle som er valgt fra gruppen bestående av følgende (a) og (b), (a) en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor omfattende et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i tungkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1), og et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i lettkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge krav 1; og (b) en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor omfattende et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i tungkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1), og med en ekspresjonsvektor omfattende et polynukleotid omfattende en sekvens som koder for den variable regionen i lettkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge (1). (11) En fremgangsmåte for å produsere et humanisert anti-humant α9-integrinantistoff, omfattende et trinn med å dyrke vertscellen ifølge (10) for å gi mulighet til ekspresjon av det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet. (12) Et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff produsert ved fremgangsmåten ifølge (11). 2 (13) Et farmasøytisk preparat for revmatoid artritt, omfattende det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge en hvilken som helst av (1) til (7) og (12). (14) Humanisert anti-humant α9 integrin-antistoff ifølge en hvilken som helst av (1) til (7) og (12) for anvendelse som medikament. 30 (1) Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge en hvilken som helst av (1) til (7) og (12) for anvendelse i en fremgangsmåte for å forebygge eller behandle revmatoid artritt. Effekt ifølge oppfinnelsen

7 7 10 Ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff med en forbedret aktivitet og/eller egenskap sammenlignet med et anti-humant α9-integrin-antistoff fra donormus. Det humaniserte antihumane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen har en sterk antiinflammatorisk virkning og en sterk bendestruksjonsundertrykkende virkning ved å blokkere interaksjoner mellom humant α9-integrin og flerfoldige ligander derav, og er nyttig for profylakse eller behandling av forskjellige sykdommer som involverer humant α9 integrin i patogenesen. Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre overlegne forbedringer i kliniske anvendelser slik som reduksjon av dose, forlengelse av administreringsintervall, forbedring av administreringsmåte (f.eks. subkutan injeksjon) og lignende, og bidrar i høy grad til terapeutisk effekt og forbedring av pasienters etterlevelse av behandlingen. 1 Kort beskrivelse av tegningene Fig. 1 viser aminosyresekvensen i VH-regionen i et murint Y9A2-antistoff. Fig. 2 viser aminosyresekvensen i VL-regionen i et murint Y9A2-antistoff. 20 Fig. 3 viser oppbygningen av oligo-dna for å produsere et gen som koder for RY9A2VHv, hvilket er ett eksempel på VH i et humanisert Y9A2-antistoff. Fig. 4 viser oppbygningen av oligo-dna for å produsere et gen som koder for RY9A2VLv01, hvilket er ett eksempel på VL i et humanisert Y9A2-antistoff. Fig. viser resultatene av Cell ELISA av et kimært Y9A2-antistoff og et RY9A2v01-antistoff. 2 Fig. 6 viser resultatene av Cell ELISA av et kimært Y9A2-antistoff og et RY9A2v801-antistoff. Beste utførelsesform av oppfinnelsen 30 Den foreliggende oppfinnelsen beskrives detaljert i det følgende. De foreliggende oppfinnerne har vist betydelig sinnrikhet og overveielse for produksjon av et humanisert antistoff av murint anti-humant α9-integrinantistoff Y9A2, og lyktes med å produsere tre typer av humaniserte anti-humane

8 8 α9-integrin-antistoffer (heri nedenfor også betegnet humanisert Y9A2-antistoff eller RY9A2) med vesentlig forbedret aktivitet og/eller egenskap sammenlignet med Y9A De foreliggende oppfinnerne podet nærmere bestemt først CDRaminosyresekvens og flere FR-aminosyrer i en variabel region i tungkjeden (heri nedenfor også betegnet VH) og en variabel region i lettkjeden (heri nedenfor også betegnet VL) i murint anti-humant α9-integrin-antistoff Y9A2 (heri nedenfor også betegnet murint Y9A2-antistoff) i et humant templatantistoff for å fremstille to typer av de humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffene RY9A2v01 og RY9A2v801, hver med en aktivitet tilsvarende den for et murint Y9A2-antistoff. CDR ble bestemt ifølge klassifiseringen foretatt av Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest 4. utg., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987). Aminosyresekvensene i VH-er i RY9A2v01 og RY9A2v801 er henholdsvis SEQ ID NO: og SEQ ID NO: 7. VH i RY9A2v801 er her VH i RY9A2v01 hvori 4 aminosyrerester fra FR-aminosyrerester avledet fra murint Y9A2-antistoff er substituert med de tilsvarende aminosyrene i det humane templatantistoffet. Aminosyresekvensen i VL-er i begge de humaniserte antistoffene vises ved SEQ ID NO: 9 og er felles for begge antistoffene. Med henblikk på å produsere et humanisert antistoff med høyere affinitet for humant α9-integrin enn det for det opprinnelige murine Y9A2-antistoffet, samtidig som risikoen for produksjon av antigenisitet hos et humanisert antistoff og redusert konserveringsstabilitet for antistoffet unngås, vurderte de foreliggende oppfinnerne substitusjon av aminosyresekvenser i CDR-ene i VH og VL i de ovennevnte to typene av humaniserte antistoffer. Følgende 3 typer av humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffer ble følgelig bekreftet å ha vesentlig forbedrede aktiviteter og/eller egenskaper sammenlignet med dem for det opprinnelige murine Y9A2-antistoffet. 1) Et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff omfattende en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:11 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:17. 2) Et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff omfattende en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:13 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:17.

9 9 3) Et humanisert anti-humant α9-integrin-antistoff omfattende en variabel region i tungkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:1 og en variabel region i lettkjeden bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO: Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan enkelt fremstilles av fagmannen på grunnlag av sekvensinformasjonen om den variable regionen i tungkjeden og den variable regionen i lettkjeden derav beskrevet heri ved anvendelse av en fremgangsmåte som er allment kjent i teknikken. Et gensegment i den variable regionen i tungkjeden med en basesekvens som koder for aminosyren i den variable regionen i tungkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og et gensegment i den variable regionen i lettkjeden med en basesekvens som koder for aminosyren i den variable regionen i lettkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, fremstilles spesifikt. Genene fra den variable regionen bindes deretter til et gen fra den konstante regionen i en egnet klasse av humant antistoff for å fremstille et humanisert antistoffgen. Dette humaniserte antistoffgenet bindes deretter til en egnet ekspresjonsvektor og introduseres i en dyrket celle. Denne dyrkede cellen dyrkes til slutt, hvorved et humanisert antistoff kan oppnås fra kultursupernatanten Hver av de ovenfor beskrevne gensegmentene i den variable regionen som koder for aminosyrene i den variable regionen i tungkjeden og lettkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan syntetiseres, f.eks basert på basesekvensene i de variable regionene i tungkjeden og lettkjeden eller basesekvenser utformet basert på aminosyresekvensener i de variable regionene i tungkjeden og lettkjeden og ved en gensyntesefremgangsmåte som er kjent i teknikken. Som slik fremgangsmåte for gensyntese kan det anvendes forskjellige fremgangsmåter som er kjent for fagmannen, slik som fremgangsmåten for antistoffgensyntese beskrevet i WO90/07861 og lignende. Straks et gensegment i den variable regionen i antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen erverves, kan andre antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen i tillegg også erverves ved å introdusere en mutasjon på et bestemt sted i gensegmentet. Som slik fremgangsmåte for mutasjonsintroduksjon kan forskjellige fremgangsmåter være åpenbare for fagmannen, slik som stedsrettet mutagenese (Current Protocols in Molecular

10 10 Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 8,1-8,) anvendes. 10 De ovenfor beskrevne gensegmentene i den variable regionen og genet i den konstante regionen i det humane antistoffet sammenføyes for å fremstille et gen fra humanisert antistoff. Mens hvilken som helst underklasse av konstant region (f.eks. γ1, γ2, γ og y4 som tungkjeder, λ- og κ-kjede-konstante regioner som lettkjeder) kan velges som konstant region av det anvendte humane antistoffet, kan humant Igγ1 som konstant region i tungkjeden, og humant Igκ som konstant region i lettkjeden, foretrukket anvendes. 1 Etter fremstillingen av dette genet fra det humaniserte antistoffet kan introduksjon av genet fra det humaniserte antistoffet til en ekspresjonsvektor, introduksjon av ekspresjonsvektoren til dyrkede celler, dyrking av de dyrkede cellene, rensing av antistoffet og lignende utføres ved anvendelse av forskjellige fremgangsmåter som er allment kjent i teknikken, eller under henvisning til fremgangsmåtene for å fremstille et humanisert anti-humant osteopontinantistoff, beskrevet i WO2007/ eller WO2003/ Som ekspresjonsvektor som skal bindes til det således oppnådde genet fra det humaniserte antistoffet, kan ekspresjonsvektorene beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO94/20632, slik som AG-γ1 og AG-κ, anvendes, men ekspresjonsvektoren er ikke begrenset, så lenge den kan uttrykke genet fra det humaniserte antistoffet. Det er foretrukket å benytte en ekspresjonsvektor som allerede har et gen i den konstante regionen i det humane Ig slik som AG-γ1 eller AG-κ, idet det ville bli en ekspresjonsvektor med genet fra det humaniserte antistoffet når genet i den variable regionen i det humaniserte antistoffet settes inn dertil. I en ekspresjonsvektor kan en ledersekvens anvendes for å fremme ekstracellulær sekresjon og ekspresjon av et antistoff. Som slik ledersekvens kan det anvendes en ledersekvens avledet fra Y9A2 eller en ledersekvens avledet fra annet antistoff (f.eks. humanisert anti-osteopontin-antistoff beskrevet i WO2007/139164). 3 Den ovenfor beskrevne ekspresjonsvektoren introduseres i dyrkede celler ved for eksempel anvendelse av et FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen), en kalsiumfosfatfremgangsmåte og lignende.

11 11 Som eksempel på dyrkede celler til hvilke ekspresjonsvektoren introduseres, kan det anvendes dyrkede celler slik som 293-celler, CHO-DG44-celler, og de kan dyrkes ved en konvensjonell fremgangsmåte. Etter den ovenfor beskrevne dyrkingen kan antistoffet akkumulert i kultursupernatanten renses ved forskjellige typer av kolonnekromatografier, f.eks. kromatografier som benytter en protein A-kolonne Som fremgangsmåte for å måle bindingsaktiviteten av det oppnådde humaniserte antistoffet mot humant α9-integrin kan ELISA, FACS og lignende anvendes. Når ELISA for eksempel anvendes, immobiliseres celler (f.eks. SW480-celle) som uttrykker α9-integrin på en ELISA-plate, et humanisert antistoff tilsettes dertil for å forårsake reaksjon, og et sekundært antistoff slik som et humant IgG-antistoff merket med et enzym slik som pepperrotperoksidase (HRP) tilsettes dertil for å forårsake reaksjon. Cellene vaskes, et fargeutviklingssubstrat (f.eks. TMB ved HRP-merking) tilsettes dertil, og absorbansen måles Som en fremgangsmåte for å evaluere hvorvidt det oppnådde humaniserte antistoffet har en funksjonsinhiberende aktivitet mot humant α9-integrin, kan det bekreftes ved en inhiberingstest (beskrevet i J. Biol. Chem., 274: , 1999) for humant α9-integrin-molekylavhengig celleadhesjon til humant osteopontinmolekyl. RAA-variant (RGD-sekvens endres til RAA for å undertrykke reaksjon med annet integrin; heri nedenfor tidvis betegnet nopn-raa) av N- terminalt OPN (N-terminalt fragment etter spalting av osteopontin ved trombin; heri nedenfor tidvis betegnet nopn), hvilket er én av α9-ligandene, immobiliseres nærmere bestemt på en plate og utsettes for blokkering. Etter tilsetning av forskjellige humaniserte antistoffer tilsettes og inkuberes α9- ekspresjonsceller ved 37 C i 1 h. Cellene fikseres og farges med krystallfiolett og metanol, og vaskes. Fargemiddelet i de adhererte cellene ekstraheres med Triton X-100, og absorbansen ved bølgelengde 9 nm måles. 3 Som en fremgangsmåte for detaljert å evaluere hvorvidt det oppnådde humaniserte antistoffet har en funksjonsinhiberende aktivitet mot humant α9- integrin, kan videre nevnes en fremgangsmåte basert på cellemigreringsinhiberingstesten beskrevet i Molecular Biology of the cell, 12: , nopn-raa immobiliseres nærmere bestemt på det øvre

12 12 sjiktet av en transbrønn og stilles på en plate, og F1-medium inneholdende 10 % FCS tilsettes deretter i det nedre sjiktet. α9-ekspresjonscelle og humanisert antistoff tilsettes samtidig i det øvre sjiktet og inkuberes ved 37 C i 16 h. Cellene migrert til det nedre sjiktet i transbrønnen kvantifiseres deretter for eksempel ved QCM Chemotaxis Cell Migration 24-well Assay-kit (Millipore) De 3 typene av humaniserte anti-humane α9 integrin-antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan enkelt erverves ved å syntetisere et DNA som koder for VH-aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:11, 13 eller 1, og et DNA som koder for VL-aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:17 eller 9 ved anvendelse av en fremgangsmåte som vanligvis er kjent i teknikken, og sammenføye dem til en egnet klasse av gen fra den konstante regionen i det humane antistoffet, foretrukket genet fra den konstante regionen i det humane Igγ1 for tungkjeden og genet fra den konstante regionen i det humane Igκ for lettkjeden, for å konstruere et gen fra det humaniserte antistoffet, introdusere genet fra det humaniserte antistoffet for en ekspresjonsvektor ved anvendelse av forskjellige fremgangsmåter som er allment kjent i teknikken, eller fremgangsmåten beskrevet i WO02/08122 eller WO03/02711 og lignende, introdusere ekspresjonsvektoren for dyrkede celler, dyrke de dyrkede cellene og rense antistoffet fra den oppnådde kulturen. DNA-er som koder for VHaminosyresekvensene vist ved SEQ ID NO: 11, 13 og 1, inneholder foretrukket basesekvenser vist ved henholdsvis SEQ ID NO: 12, 14 og 16. DNA-er som koder for VL-aminosyresekvensene vist ved SEQ ID NO: 17 og 9, inneholder foretrukket basesekvenser vist ved henholdsvis SEQ ID NO: 18 og 10. Den foretrukne tungkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i tungkjeden vist ved SEQ ID NO:11 og den konstante regionen i det humane Igγ1, er en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:19. Den foretrukne lettkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i lettkjeden vist ved SEQ ID NO:17 og den konstante regionen i det humane Igκ, er en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2. Et DNA som koder for tungkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:19, inneholder foretrukket basesekvensen vist ved SEQ ID NO:20. Et DNA som koder for lettkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist

13 13 ved SEQ ID NO:2, inneholder basesekvensen vist ved SEQ ID NO:26. Som humanisert anti-α9 integrin-antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen inneholdende en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:19 og en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2 kan et RY9A2v12(M34L)012-antistoff vist i eksemplene beskrevet nedenfor nevnes Den foretrukne tungkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i tungkjeden vist ved SEQ ID NO:13 og den konstante regionen i det humane Igγ1, er en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:21. Den foretrukne lettkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i lettkjeden vist ved SEQ ID NO:17 og den konstante regionen i det humane Igκ, er en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2. Et DNA som koder for tungkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:21, inneholder foretrukket basesekvensen vist ved SEQ ID NO:22. Et DNA som koder for lettkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2, inneholder basesekvensen vist ved SEQ ID NO:26. Som humanisert anti-α9 integrin-antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen inneholdende en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:21 og en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:2 kan et RY9A2v11(M34L)012-antistoff vist i eksemplene beskrevet nedenfor nevnes Den foretrukne tungkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i tungkjeden vist ved SEQ ID NO:1 og den konstante regionen i det humane Igγ1, er en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:23. Den foretrukne lettkjeden i det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, hvilken oppnås ved å sammenføye den variable regionen i lettkjeden vist ved SEQ ID NO:9 og den konstante regionen i det humane Igκ, er en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:27. Et DNA som koder for tungkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:23, inneholder foretrukket basesekvensen vist ved SEQ ID NO:24. Et DNA som koder for

14 14 lettkjeden i det humaniserte antistoffet bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:27, inneholder foretrukket basesekvensen vist ved SEQ ID NO:28. Som humanisert anti-α9 integrin-antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen inneholdende en tungkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:23 og en lettkjede bestående av aminosyresekvensen vist ved SEQ ID NO:27 kan et RY9A2v0(IAW)01-antistoff vist i eksemplene beskrevet nedenfor nevnes Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen således oppnådd etter å ha blitt ytterligere renset etter behov kan fremstilles som et farmasøytisk preparat ifølge en konvensjonell fremgangsmåte, og anvendes for behandling av autoimmune sykdommer slik som revmatoid artritt og lignende, immune sykdommer slik som allergi, transplantatavstøtning og lignende, og sykdommer hvori α9-integrin er involvert i patogenesen slik som osteoporose, kronisk obstruktiv lungesykdom, cancer og lignende Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes foretrukket som terapeutisk middel for revmatoid artritt. Som eksempel på doseringsformer for disse terapeutiske midlene kan et parenteralt preparat slik som en injeksjon eller dryppinfusjon fremstilles og administreres foretrukket ved intravenøs administrering, subkutan administrering og lignende. I fremstillingen av et farmasøytisk preparat kan bærere og additiver som tilsvarer disse doseringsformene, anvendes innenfor et farmasøytisk akseptabelt område. Mengden av humanisert anti-humant α9 integrin-antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilsatt i preparatet beskrevet ovenfor varierer avhengig av pasientens symptomalvorlighetsgrad og alder, doseringsformen hos den anvendte fremstillingen eller antistoffets bindingstiter og lignende; ca. 0,1 mg/kg til 100 mg/kg kan for eksempel anvendes. 3 Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også polynukleotid som koder for det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller variable regioner i tungkjeden og lettkjeden derav, og en ekspresjonsvektor inneholdende samme. Ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset, så lenge den kan uttrykke et gen som koder for det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen

15 eller en variabel region i tungkjeden og lettkjeden derav i forskjellige vertsceller av prokaryotiske celler og/eller eukaryotiske celler, og produsere disse polypeptidene. Plasmidvektorer, virale vektorer (f.eks. adenovirus, retrovirus) og lignende kan for eksempel nevnes. Ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte et gen som koder for det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller en variabel region i tungkjeden og lettkjeden derav, og en promoter funksjonelt bundet til genet. Som promoter for å uttrykke genet som koder for det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller en variabel region i tungkjeden og/eller lettkjeden derav i en bakterie, når verten er en bakterie av slekten Escherichia, kan Trp-promoteren, lac-promoteren, reca-promoteren, λpl-promoteren, lpp-promoteren, tacpromoteren og lignende for eksempel nevnes. Som promoter for å uttrykke genet som koder for det humaniserte antistoffet eller en variabel region i tungkjeden og/eller lettkjeden derav i gjær, kan PH0-promoteren, PGKpromoteren, GAP-promoteren og ADH-promoteren for eksempel nevnes; når verten er en bakterie av slekten Bacillus, kan SL01-promoteren, SP02- promoteren, penp-promoteren og lignende nevnes. Når verten er en eukaryotisk celle slik som en pattedyrcelle, kan β-aktinpromoter, CAG-promoter (Niwa H. et al., Gene, 108, , 1991), den SV40-avledede promoteren, retroviruspromoteren, varmesjokkpromoteren og lignende nevnes Når en bakterie, særlig Escherichia coli, anvendes som vertscelle, kan ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen videre omfatte et startkodon, et stoppkodon, en terminatorregion og en replikerbar enhet. Når en gjær, dyrecelle eller insektscelle anvendes som vert, kan ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatte et startkodon og et stoppkodon. I dette tilfelle kan det inngå en enhancersekvens, ikke-kodende regioner på '- siden og 3'-siden av et gen som koder for det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller en variabel region i tungkjeden og/eller lettkjeden derav, en spleisekobling, et polyadenyleringssted eller en replikerbar enhet og lignende. En seleksjonsmarkør (f.eks. tetrasyklinresistensgen, ampicillinresistensgen, kanamycinresistensgen, neomycinresistensgen, dihydrofolatreduktasegen) konvensjonelt anvendt ifølge formålet kan også inngå.

16 16 10 Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en transformant som inkorporerer et gen som koder for det humaniserte antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller en variabel region i tungkjeden og lettkjeden derav. En slik transformant kan fremstilles ved for eksempel transformasjon av en vertscelle med ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Vertscellen som anvendes for å fremstille en transformant, er ikke begrenset, så lenge den stemmer overens med den ovennevnte ekspresjonsvektoren og er transformerbar; forskjellige celler slik som naturlige celler eller kunstig etablerte cellelinjer i vanlig anvendelse på det tekniske området ifølge den foreliggende oppfinnelsen (f.eks. bakterier (bakterier av slekten Escherichia, bakterier av slekten Bacillus), gjær (slekten Saccharomyces, slekten Pichia og lignende), dyreceller eller insektsceller (f.eks. Sf9) og lignende) kan nevnes som eksempel. Transformasjonen kan utføres ved en fremgangsmåte kjent per se Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også en produksjonsfremgangsmåte for det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfattende å uttrykke et gen som koder for det humaniserte antistoffet eller de variable regionene i tungkjeden og lettkjeden ifølge den foreliggende oppfinnelsen i en vertscelle, nemlig ved anvendelse av en slik transformant. Vertscellen anvendt for fremgangsmåten inkorporerer foretrukket ekspresjonsvektoren ifølge den foreliggende oppfinnelsen, og ekspresjonsvektoren kan separat eller samtidig inneholde polynukleotider som koder for de variable regionene i tungkjeden og lettkjeden i det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet. I produksjonen av det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan transformanten dyrkes i næringsmedium. Næringsmediet inneholder foretrukket en karbonkilde og en uorganisk nitrogenkilde eller organisk nitrogenkilde som er nødvendig for transformantens vekst. Som eksempel på karbonkilde kan nevnes glukose, dekstran, løselig stivelse, sukrose og lignende; som eksempel på uorganisk nitrogenkilde eller organisk nitrogenkilde kan nevnes ammoniumsalter, nitrater, aminosyrer, "corn steep liquor", pepton, kasein, kjøttekstrakt, soyabønnekake, potetekstrakt og lignende. Andre næringsstoffer (f.eks. uorganiske salter (f.eks. kalsiumklorid, natriumdihydrogenfosfat, magnesiumklorid), vitaminer, antibiotika (f.eks. tetrasyklin, neomycin, ampicillin, kanamycin og lignende) og lignende) kan inngå om ønskelig.

17 Dyrking av transformanten kan utføres ved en fremgangsmåte kjent per se. Dyrkingsbetingelser, f.eks. temperatur, ph for mediet og dyrkingstid, velges etter behov. Når verten for eksempel er en dyrecelle, kan et MEM-medium (Science, bd. 122, s. 01, 192), DMEM-medium (Virology, bd. 8, s. 396, 199), RPMI1640-medium (J. Am. Med. Assoc., bd. 199, s. 19, 1967), 199-medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., bd. 73, s. 1, 190) inneholdende ca. til 20 % bovint fosterserum og lignende anvendes som medium. ph for mediet er foretrukket ca. 6 til 8, dyrking utføres normalt ved ca. 30 til 40 C i ca. 1 til 72 timer, og kulturen kan luftes eller omrøres etter behov. Når verten for eksempel er en insektscelle, kan Graces medium omfattende bovint fosterserum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd. 82, s. 8404, 198) og lignende nevnes, og ph derav er foretrukket ca. til 8. Dyrking utføres normalt ved ca. 20 til 40 C i 1 til 100 timer, og kulturen kan luftes eller omrøres etter behov. Når verten for eksempel er en bakterie, en aktinomyces, gjær, eller en filamentøs sopp, er et væskemedium omfattende næringskildene beskrevet ovenfor egnet. Et medium med en ph på til 8 er foretrukket. Når verten er E. coli, kan LB-medium, M9- medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 431, 1972) og lignende nevnes som foretrukket medium. I dette tilfellet kan dyrking utføres normalt ved 14 til 43 C i ca. 3 til 24 timer, mens kulturen luftes eller omrøres etter behov. Når verten er en bakterie av slekten Bacillus, kan dyrking normalt utføres ved 30 til 40 C i ca. 16 til 96 timer, kulturen luftes eller omrøres etter behov. Når verten er gjær, kan Burkholders minimale medium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd. 77, s. 40, 1980) nevnes som eksempel på medium, og ph er ønskelig til 8. Dyrking utføres normalt ved ca. 20 til 3 C i ca. 14 til 144 timer, og kulturen kan luftes eller omrøres etter behov Det humaniserte anti-humane α9-integrin-antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan gjenvinnes, foretrukket isoleres og renses, fra en dyrket transformant som beskrevet ovenfor. Som eksempel på fremgangsmåten for isolering og rensing kan nevnes fremgangsmåter basert på forskjeller i løselighet, slik som utsalting og løsemiddelutfelling; fremgangsmåter basert på forskjeller i molekylvekt, slik som dialyse, ultrafiltrering, gelfiltrering og natriumdodekylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese; fremgangsmåter basert på forskjeller i elektrisk ladning, slik som ionebyttekromatografi og hydroksylapatittkromatografi; fremgangsmåter basert på spesifikk affinitet, slik

18 18 som affinitetskromatografi; fremgangsmåter basert på forskjeller i hydrofobisitet, slik som reversfase-høyytelsesvæskekromatografi; fremgangsmåter basert på forskjeller i isoelektrisk punkt, slik som isoelektrisk fokuserende elektroforese; og lignende. Den foreliggende oppfinnelsen forklares detaljert i det følgende under henvisning til eksempel, hvilke ikke må tolkes som begrensende. Eksempel 10 Som for delen hvor kommersielt tilgjengelige kit eller reagenser ble anvendt, ble forsøkene utført ifølge den vedlagte protokoll, med mindre noe annet er angitt. 1 «Eksempel 1: Bestemmelse av sekvens i variabel region i murint Y9A2- antistoff og produksjon av kimært Y9A2-antistoff» 20 Genene fra den variable regionen i tungkjeden (VH) og de variable regionen i lettkjeden (VL) i murint Y9A2-antistoff ble bestemt, og VH-genet ble ligert til humant Igγ1-gen, og VL-genet ble ligert til humant Igκ-gen for å gi et murinthumant kimært antistoff (heri nedenfor også betegnet kimært Y9A2-antistoff). Prosedyrene er som følger RNA ble først ekstrahert fra murint Y9A2-antistoffproduserende hybridom, som ble levert av University of California at San Francisco (UCSF), med et TRIzolreagens (Invitrogen). Ved anvendelse av RNA-et som templat ble cdna syntetisert ved anvendelse av Random Primer og SuperScript III Reverse Transcriptase (begge Invitrogen). Ved anvendelse av dette cdna-et som templat, og en primer for en lederregion og en primer for J-regionen utformet under henvisning til klassifiseringen av sekvenser av V-region og J-region foretatt av Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest 4. utg., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987), ble et VH-gensegment deretter amplifisert med Ex Taq DNA-polymerase (TAKARA BIO INC.). Primeren for den ovennevnte lederregionen og primeren for J-regionen anvendt her tilsettes med henholdsvis en HindIII-gjenkjenningssekvens og en BamHIgjenkjenningssekvens. Som for VL ble et VL-gensegment oppnådd på samme

19 19 måte som med VH ved anvendelse av en primer tilpasset ledersekvensen og en primer tilpasset J-regionen De således oppnådde VH- og VL-gensegmentene ble fordøyd med HindIII og BamHI (begge TAKARA BIO INC.) og ligert til henholdsvis AG-γ1 og AG-κ (WO94/20632), hvilke er ekspresjonsvektorer. AG-γ1 har en β-aktinpromoter, et gen fra γ1-kjeden i den konstante regionen i humant immunglobulin, og et neomycinresistensgen (neo) som seleksjonsmarkør, og blir et plasmid som uttrykker en tungkjede i kimært Y9A2-antistoff ved å sette inn et murint Y9A2- antistoff-vh-gen mellom en HindIII-gjenkjenningssekvens og en BamHIgjenkjenningssekvens lokalisert oppstrøms av γ1-genet. AG-κ har en β-aktinpromoter, et gen fra κ-kjeden i den konstante regionen i humant immunglobulin, og et dihydrofolatreduktase (dhfr)-gen som seleksjonsmarkør, og blir likeledes et plasmid som uttrykker en lettkjede i kimært Y9A2-antistoff ved å sette inn et murint Y9A2-antistoff-VL-gen mellom en HindIII-gjenkjenningssekvens og en BamHI-gjenkjenningssekvens lokalisert oppstrøms av κ-genet Disse ekspresjonsplasmidene ble introdusert i Escherichia coli ifølge en konvensjonell fremgangsmåte for å gi en transformert klon, fra hvilken plasmid- DNA ble fremstilt ved anvendelse av et QIAprep Spin Miniprep-kit (QIAGEN). Ved anvendelse av det oppnådde plasmid-dna-et som templat, og GenomeLab DTCS-Quick Start Kit og en CEQ2000 automatisk sekvensator (begge BECKMAN COULTER), ble klonede VH- og VL-basesekvenser analysert. Basesekvensene av VH og VL er vist i henholdsvis SEQ ID NO: 2 og SEQ ID NO: 4. Aminosyresekvensene i VH og VL, som ble bestemt basert på de oppnådde sekvensene, er vist i henholdsvis fig. 1 og fig. 2. De er i tillegg vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: Den ovennevnte Escherichia coli-klonen ble dyrket i store mengder, og tungkjede-ekspresjonsplasmidet og lettkjede-ekspresjonsplasmidet i kimært Y9A2-antistoff ble renset ved anvendelse av et EndoFree Plasmid Maxi-kit (QIAGEN). De ble blandet og introdusert i cellen ved anvendelse av FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen), hvorved kimært Y9A2-antistoff ble kortvarig uttrykt. Konsentrasjonen av det kimære Y9A2-antistoffet inneholdt i den oppnådde kultursupernatanten ble målt ved sandwich-elisa ved anvendelse av et geitavledet anti-humant IgG Fc-antistoff (CAPPEL) og protein A-HRP (ZYMED). I dette tilfellet ble en fortynningsserie av kommersielt tilgjengelig

20 20 humant IgG1-antistoff (Biogenesis) fremstilt og anvendt som standardprøve. Det kimære Y9A2-antistoffet i det ovennevnte kultursupernatantet ble deretter affinitetsrenset ved anvendelse av en protein A-kolonne (GE Healthcare) for å gi et renset kimært Y9A2-antistoff. Konsentrasjonen av det rensede kimære Y9A2- antistoffet ble beregnet hvori konsentrasjonen var 1 mg/ml når absorbansen ved bølgelengde 280 nm var 1,4. «Eksempel 2: Celleadhesjonsinhiberingstest for kimært Y9A2-antistoff» For å sammenligne aktiviteten av det rensede kimære Y9A2-antistoffet, som ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i det ovennevnte avsnittet, med den for et murint Y9A2-antistoff (CHEMICON INTERNATIONAL), ble celleadhesjonsinhiberingstesten beskrevet i J. Biol. Chem., 274: , 1999 utført. En variant (nopn-raa) hvori RGD-sekvens inneholdt i det N- terminale fragmentet (nopn) fra spalting av osteopontin med trombin ble substituert med RAA, ble nærmere bestemt først immobilisert og blokkert, og et murint Y9A2-antistoff eller et renset kimært Y9A2-antistoff ble tilsatt. SW480- celle som uttrykker et humant α9-integrin-molekyl (heri nedenfor tidvis betegnet SW480/hα9-celle), ble suksessivt tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37 C i 1 h. Cellen ble deretter fiksert og farget med krystallfiolett og metanol og vasket. Fargemiddel i den adhererte cellen ble ekstrahert med Triton X-100, og absorbansen ved bølgelengde 9 nm ble målt Som vist i tabell 1 er det følgelig funnet at IC0 av det murine Y9A2-antistoffet og av det rensede kimære Y9A2-antistoffet nesten er de samme, og de har en aktivitet for å inhibere adhesjon av SW480/hα9-celle til nopn-raa. IC0 er definert til å være en konsentrasjon av anti-α9 integrin-antistoffet som er nødvendig for å undertrykke 0 % av celleadhesjonsnivået som forekommer uten tilsetning av anti-α9 integrin-antistoffet. Tabell 1 Resultat av celleadhesjonsinhiberingstest for murint Y9A2-antistoff og kimært Y9A2-antistoff murint Y9A2-antistoff kimært Y9A2-antistoff IC0 (µg/ml) 0,039 0,038

21 21 «Eksempel 3: Produksjon av humanisert Y9A2-antistoffgen» 10 Det humane templatantistoffet som skal podes med en komplementaritetsbestemmende region (CDR)-aminosyre i VH og VL i det murine Y9A2-antistoffet, ble valgt fra kjønnsceller av humant antistoff med en aminosyresekvens med høy homologi med strukturregion (FR)- aminosyresekvens i VH, VL i det murine Y9A2-antistoffet. Det valgte humane templat-vh var nærmere bestemt en kombinasjon av DP-88 og JH6, og valgt human templat-vl var en kombinasjon av DPK-1 og JK FR-ene i VH og VL i ovennevnte humane templatantistoff ble podet med de nødvendige aminosyresekvensene fra VH og VL i murint Y9A2-antistoff for å gi et humanisert antistoff. Som for VH ble CDR-aminosyresekvens og flere steder med FR-aminosyre av ovennevnte humane templatantistoff-vh nærmere bestemt først substituert med de tilsvarende aminosyresekvensene i VH i murint Y9A2- antistoff. Aminosyresekvensene i VH i to typer av humaniserte Y9A2-antistoffer, dvs. RY9A2VHv og RY9A2VHv8, ble utformet (henholdsvis SEQ ID NO: og SEQ ID NO: 7), og basesekvensene av DNA-er som koder for aminosyresekvensene, ble videre utformet (henholdsvis SEQ ID NO: 6 og SEQ ID NO: 8). I RY9A2VHv8 er 4 av FR-aminosyrerestene avledet fra det murine Y9A2-antistoffet i RY9A2VHv substituert med dem av det humane templatantistoffet Som for VL ble CDR-aminosyresekvens av ovennevnte humane templatantistoff- VL substituert med aminosyresekvensen av CDR i VL i murint Y9A2-antistoff, aminosyresekvensen i RY9A2VLv01, hvilken er VL i humanisert Y9A2-antistoff, utformet (SEQ ID NO: 9), og basesekvensen av DNA som koder for aminosyresekvensen, ble videre utformet (SEQ ID NO: 10). For å produsere DNA-fragmenter som koder for ovennevnte RY9A2VHv, RY9A2VHv8 og RY9A2VLv01, ble total syntese utført ved PCR ved anvendelse av oligo-dna som materiale. RY9A2VHv ble nærmere bestemt syntetisert ved å dele det i 6 typer av oligo-dna-er (beskrevet i SEQ ID NO: 29 34) for å dekke den fulle lengden av VH, som vist henholdsvis i fig. 3, og ved anvendelse av dem ble PCR utført ved følgende prosedyre. Det vil si at tilsvarende mengder av 6

22 22 typer av oligo-dna-er ble blandet. Ved anvendelse av blandingen som templat og Pyrobest DNA-polymerase (TAKARA BIO) ble et trinn med 96 C, 30 sekunder, 0 C, 30 sekunder og 72 C, 3 min gjentatt 1 sykluser. Ved anvendelse av dette PCR-produktet (1 µl) som templat, oligo-dna med sekvensen indikert i fet skrift i fig. 3 (vist ved SEQ ID NO: 3 og 36) som primer og Pyrobest DNA-polymerase ble et trinn med 96 C, 20 sekunder og 72 C, 2 min gjentatt 2 sykluser for å amplifisere den fulle lengden av VH. RY9A2VHv8 ble også produsert generelt på samme måte For produksjon av RY9A2VLv01 ble 1 sykluser av PCR utført på samme måte som ovenfor ved anvendelse av seks oligo-dna-er (vist ved SEQ ID NO: 37 42) vist i fig. 4, og 2 sykluser av PCR ble utført på samme måte som ovenfor ved anvendelse av amplifikasjonsproduktet som templat, og oligo-dna med sekvensen indikert i fet skrift i fig. 4 (vist ved SEQ ID NO: 43 og 44) som primer, hvorved den fulle lengden av VL ble amplifisert. 20 I begge ovennevnte VH og VL ble en sekvens lik det humaniserte monoklonale anti-osteopontin-antistoffet beskrevet i WO2007/ anvendt som antistoffets ledersekvens. Begge ender av det oppnådde DNA-fragmentet ble i tillegg tilsatt med en HindIII-gjenkjenningssekvens og en BamHIgjenkjenningssekvens for kloning De således oppnådde DNA-fragmentene i VH og VL ble fordøyd med restriksjonsenzymene HindIII og BamHI, ligert henholdsvis med ovennevnte ekspresjonsvektorer AG-γ1 og AG-κ, og introdusert i Escherichia coli ifølge en konvensjonell fremgangsmåte for kloning. Plasmid-DNA ble fremstilt fra den oppnådde Escherichia coli-klonen ved anvendelse av et QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Ved anvendelse av det oppnådde plasmid-dna-et som templat ble basesekvensene av det klonede VH og VL analysert ved anvendelse av et GenomeLab DTCS-Quick Start Kit og CEQ2000 automatisk sekvensator (begge fra BECKMAN COULTER), hvorved kloner med de utformede basesekvensene ble oppnådd. Disse klonene ble dyrket, og ekspresjonsplasmider fra tungkjede og lettkjede ble renset ved anvendelse av et EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). 3 Det rensede tungkjede-ekspresjonsplasmidet og lettkjede-ekspresjonsplasmidet ble blandet, og blandingen ble introdusert i cellen for kortvarig å uttrykke antistoffet ved anvendelse av FreeStyle 293 Expression System. I dette tilfellet