(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 1/04 (06.01) C12N 1/ (06.01) C12Q 1/68 (06.01) C40B /02 (06.01) C40B 40/ (06.01) G01N 33/68 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet EP US 9171 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Affibody AB, Box 137, Bromma, Sverige (72) Oppfinner ABRAHMSÉN, Lars, Lillängsgatan 28, S Bromma, Sverige HERNE, Nina, Nybodaringen 64, S Stockholm, Sverige LENDEL, Christofer, Glavagatan 3, S Farsta, Sverige FELDWISCH, Joachim, Korallvägen 16, S Tyresö, Sverige (74) Fullmektig Protector Intellectual Property Consultants AS, Oscarsgate, 032 OSLO, Norge (4) Benevnelse Polypeptidsamling med en forutbestemt struktur (6) Anførte publikasjoner WO-A-92/00091 B1, WO-A-9/19374 B1

2 - 1 - POLYPEPTIDSAMLING MED EN FORUTBESTEMT STRUKTUR Beskrivelse av oppfinnelsen Den foreliggende oppfinnelsen vedrører nye populasjoner av polypeptidevarianter basert på en felles struktur (scaffold). Disse populasjonene kan blant annet anvendes for å gi nye bindingsproteiner og polypeptider. Bakgrunn Forskjellige metoder for konstruksjon av nye bindingsproteiner har vært beskrevet (Nygren PA and Uhlén M (1997) Curr Opin Struct Biol 7: ). Én strategi har vært å kombinere biblikoteksgenerering og screening eller seleksjon for ønskede egenskaper. 1 Originale Affibody molekyler, populasjoner av slike molekyler og stillas av slike molekyler har vært beskrevet blant annet i WO 9/19374, dens lærdommer som er innlemmet heri ved referanse. For noen anvendelser proteiner, polypeptider eller Affibody molekyler, populasjoner av slike molekyler og stillas med forbedrede egenskaper, slik som alkalisk stabilitet, lav antigenisitet, strukturell stabilitet, medgjørlighet for kjemisk syntese og hydrofilisistet er ønskelig. 2 Alkalistabilitet Produksjon av protein farmasøytika og bioteknologi reagenser krever flere rensetrinn for å anrike et spesifikt produkt mens uønskede produkter fjernes. Affinitetsrensing mediert ved proteinske affinitetsmatriser, slik som monoklonale antistoff, stafylokokkprotein A (SpA) muliggjør effektiv rensing i ett trinn. Derimot, for å gjøre dette kostnadseffektivt er det ønskelig å være i stand til å ordentlig regenerere affinitetsmatrisene. Dette involverer vanligvis en prosedyre kjent som cleaning-inplace (rensing på stedet, CIP), hvori agenser ofte alkaliske løsninger anvendes for å eluere forurensninger. 3 Alkalisk stabilitet kreves også ved molekylære bilde-tracere for å merke med det mest vanlige SPECT nuklidet technetium-99m, og for å muliggjøre gjennomføring av noen andre former for kjemiske modifikasjoner. Lav antigenisitet

3 Proteinbaserte farmasøytika, slik som terapeutiske monoklonale antistoff og Affibody molekyler, har potensialet til å fremkalle uønskede immunresponser hos mennesker. Hovedfaktorene som bidrar til immunogenisitet er tilstedeværelsen av forurensninger, proteinaggregater, fremmede epitoper, for eksempel, nye idiotyper, forskjellige Ig allotyper og ikke-selv sekvenser. I tillegg, kryssreagerende immunoglobulin (Ig) interaksjoner vil mest sannsynlig øke sannsynligheten for å generere en spesifikk T- celle-mediert minne immunrespons mot proteinfarmasøytika. For å minimere risikoen for uønskede interaksjoner med immunsystemet er det ønskelig å eliminere eksisterende immunepitoper ved proteindesign av legemidlet. Affibody molekyler er avledet fra stafylokokkprotein A (SpA), som er en cellevegg assosiert reseptor på overflaten av den gram-positive bakterien Staphylococcal aureus. Mer presist, SpA består av fem svært homologe domener som alle binder til immunoglobuliner fra mange mammalske arter inkludert humant. Hvert SpA-domene interager med humane Ig-er på to forskjellige måter; enten ved direkte binding til Fcγ inkludert IgG1, IgG2 og IgG4 (Langone JJ (1982) Adv Immunol 32:17-22), eller ved binding til medlemmer av VH3 familien (Silverman GJ et al. (1992) Int Rev Immunol 9:7-78). Det vanlige stillaset fra originale Affibody molekyler er identisk til domenet B av SpA med unntak av G29A mutasjonen, som ble inkludert for å øke proteinstabiliteten og for å eliminere et hydroksylamin kløyvingssete, og A1V mutasjonen, introdusert i en mellomleggsregion (spacer region) mellom domenene (Nilsson B et al. (1987), Prot Eng 1:7-113). Aminosyrerestene i SpA som er involvert i interaksjonen med Fcγ og VH3 familien er velkjente og har vært beskrevet i litteraturen (Graille M et al. (00) Proc Natl Acad Sci USA. 97: ). Et molekylærbibliotek av forskjellige Affibody molekyler ble konstruert ved å randomisere overflaterester ved en side av molekylet, inkludert rester kjent for å være involvert i interaksjonen med Fcγ, som dermed eliminerer affiniteten til Fcγ. 3 Strukturell stabilitet En av nøkkelfaktorene til suksess for peptid- og proteinfarmasøytika er stabiliteten til proteinet. Proteiner som utviser høy strukturell stabilitet vil mest sannsynlig funksjonelt motstå kjemiske modifikasjoner og proteolyse under fremstilling så vel som i menneskekroppen. Videre, så vil stabiliteten påvirke den aktive holdbarheten til peptidet eller proteinfarmasøytika så vel som den aktive levetiden til peptidet eller proteinfarmasøytika i menneskekroppen. Medgjørlighet til kjemisk syntese

4 - 3 - Forskere har tradisjonelt anskaffet proteiner ved biologiske metoder, men kjemisk syntese av peptider og små proteiner er en sterk komplementær strategi og er vanlig brukt i strukturell biologi, proteindesign og biomedisinsk forskning. Kjemisk syntese av proteiner tilbyr en rask og effektiv måte å produsere homogene proteiner fri for biologiske forurensninger som DNA-forurensninger og vertscelle proteiner. Videre, økes fleksibiliteten da kjemisk syntese tillater inkorporering av unaturlige aminosyrer, kjemiske modifikasjoner og introduksjon av biokjemiske og biofysiske prober. En vellykket kjemisk syntese av peptider og proteiner er avhengig av aminosyresekvensen av det aktuelle molekylet. Enkelte aminosyrerester har en lav koplingseffektivitet, som betyr at flere trinn under syntesen trenger optimalisering som er en tidskrevende prosess med ingen suksessgaranti. I tillegg, aminosyrer som er vanskelig å effektivt introdusere ved kjemisk syntese vil ha en større negativ påvirkning på proteinutbyttet jo lengre proteinsekvensen er. 1 Økt hydrofilisitet For de fleste anvendelser er det ønskelig at peptider og proteiner er svært løselige som viser en lav tendens til å aggregere. Slike proteinegenskaper er særlig viktig når det kommer til proteinfarmasøytika. Det er en sterk positiv korrelasjon mellom proteinoverflate-hydrofobisitet og lav løselighet og økt tendens til aggregering. Beskrivelse av foreliggende oppfinnelse 2 3 Det er ett formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en populasjon av polypeptidvarianter basert på nye stillas. Disse nye stillasene har flere fordeler sammenlignet med kjente, lignende stillaser, såkalte originale stillaser. Disse fordelene gjelder også polypeptider anskaffet ved anvendelse av disse nye stillaser. Disse fordelene vil bli diskutert i nærmere detalj nedenfor, men noen eksempler er angitt her. For eksempel så har omfattende forskning blitt utført for å utvikle nye polypeptidstillas som utviser høy stabilitet i et alkalisk miljø. Et aspekt av alkalisk stabilitet er stabilitet mot deaminering av asparaginer. Å unngå denne reaksjonen ved økt strukturell rigiditet eller ved å erstatte denne resten gir også kjemisk stabilitet som bidrar til å oppnå et homogent produkt, for eksempel etterfulgt av en fermenteringsprosess eller lagring, der deaminering av asparaginer sterkt bidrar til en heterogen blanding som er vanskelig å separere.

5 - 4 - Videre, en forbedret profil med hensyn på lav antigenisitet (liten IgG binding) ble fremstilt ved eliminering, i de nye stillassekvensene, av den gjenværende affinitet for immunoglobuliner, hovedsakelig VH3-mediert. Videre, de nye stillasene har blitt utformet på en slik måte at de utviser høy strukturell stabilitet med hensyn på en lettfoldelig alfaheliks struktur, høyt smeltepunkt og avskaffing av seter kjent for målrettet proteolyse. De originale Affibody molekylstillasene inneholder flere aminosyrer som har vist å redusere hastigheten og suksessen til kjemisk syntese. For å få en effektiv, det vil si, høy gjennomstrømming (high-throughput) og høyt utbytte Affibody protein produksjonsprosess, ble flere aminosyrer byttet ut med rester med egenskaper som er mer kompatible med kjemisk syntese. 1 For å forbedre hydrofilisiteten og løseligheten, ble rester på overflaten av Affibody molekylstillas byttet med mer hydrofile aminosyrer. Et annet formål av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en populasjon av polynukleotider. Et annet formål av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en kombinasjon av en polypeptidpopulasjon og en polynukleotidpopulasjon. 2 Et ytterligere formål av foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for å velge et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål fra et populasjon av polypeptider Et annet formål er å tilveiebringe en metode for å isolere et polynukleotid som koder for et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsvalgt mål. Et annet formål er å tilveiebringe en metode for å identifisere et ønsket polypeptid som har en affinitet for et forhåndsbestemt mål. 3 Et annet formål er å tilveiebringe en metode for å velge og identifisere ønskede polypeptider som har en affinitet for et forhåndsbestemt mål.

6 - - Et relatert formål er å tilveiebringe en metode for produksjon av et ønsket polypeptid som har en affinitet for et forhåndsbestemt mål. Populasjonene og metodene i henhold til oppfinnelsen muliggjør tilveiebringelse (inkludert produksjon og evaluering) av midler med en affinitet til et forhåndsbestemt mål, ved tilveiebringelse av et polypeptid som er karakterisert ved spesifikk binding til et forhåndsbestemt mål. Det er også mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som utviser liten eller ingen uspesifikk binding. Det er også mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som enkelt kan anvendes som en fraksjon av et fusjonspolypeptid. 1 Videre er det mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som løser en eller flere av de kjente problemer som erfares ved eksisterende antistoffreagenser. Dessuten, er det mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som er medgjørlig for anvendelse i terapeutisk og/eller diagnostiske anvendelser. Det er også mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som enkelt kan lages ved kjemisk peptidsyntese. 2 Videre, muliggjør den foreliggende oppfinnelsen identifisering av polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som utviser en forbedret stabilitet sammenlignet med kjente bindingsmidler til det samme målet. Det er også mulig å tilveiebringe polypeptider som binder til et forhåndsbestemt mål som utviser lav antigenisitiet når anvendt in vivo i et pattedyr og/eller utviser en forbedret biodistribusjon ved administrering til et pattedyr. 3 Disse og andre formål er oppfylt ved de forskjellige aspekter av oppfinnelsen som hevdet i vedlagte patentkrav. I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes en populasjon av polypeptidvarianter basert på et felles stillas, hvert polypeptid i populasjonen

7 - 6 - innebefatter stillas aminosyresekvensen EXXXAXXEIXXLPNLTXXQXXAFIXKLXDDPSQSSELLSE AKKLNDSQ, (SEQ. ID. No. 1). Eller i noen tilfeller fortrinnsvis I sekvensene ovenfor korresponderer hver individuell X til en aminosyrerest som varierer i populasjonen. 1 Populasjonen består av et stort antall varianter av slike polypeptidmolekyler. I denne sammenhengen betyr et stort antall, en populasjon innebefattende av minst 1 x 4 unike polypeptidmolekyler, eller minst 1 x 6 eller minst 1 x 8 eller minst 1 x, eller minst 1 x 12, eller minst 1 x 14 unike polypeptider. Derimot, er det nødvendig å bruke en gruppe som er stor nok til å tilveiebringe den ønskede størrelsen av populasjonen. Populasjonen beskrevet heri kan også betegnes som bibliotek. 2 Det er angitt ovenfor at hver X individuelt korresponderer til en aminosyre som varierer. Dette betyr at hver X kan være enhver aminosyrerest uavhengig av identiteten til enhver annen rest betegnet X i sekvensen. I stillas aminosyresekvensen kan de forskjellige varierte aminosyrene X velges fra alle de naturlige forekommende aminosyrer på en slik måte at enhver av disse naturlige forekommende aminosyrene kan være tilstede ved de korresponderende X posisjonene i enhver gitt variant. Utvelgelsen av aminosyrerester ved hver posisjon er mer eller mindre randomisert. Det er også mulig å begrense gruppen som de forskjellige varierte aminosyrene velges fra til 19, 18, 17, 16 eller mindre enn de naturlig forekommende aminosyrerestene. Variabiliteten i forskjellige posisjoner kan justeres individuelt, fra mellom 1, som betyr ingen randomisering, opp til alle aminosyrer. Tilfeldig introduksjon av en mindre undergruppe av aminosyrer kan oppnås ved nøye seleksjon av introduserte deoksyribonukleotidbaser, for eksempel kan kodonene T(A/C)C introduseres for å oppnå en tilfeldig introduksjon av enten serin eller tyrosin ved en gitt posisjon i polypeptidkjeden. Likeledes, kan kodonene (T/C/A/G)CC introduseres for å oppnå en tilfeldig introduksjon av fenylalanin, leucin, alanin og valin ved en gitt posisjon i polypeptidkjeden. En fagkyndig person er kjent med mange alternativer av deoksyribonukleotid basekombinasjoner som kan anvendes for å oppnå forskjellige

8 - 7 - kombinasjoner av aminosyrer ved en gitt posisjon i polypeptidkjedet. Settet av aminosyrer som kan oppstå ved en gitt posisjon på polypeptidkjedet kan også bestemmes ved introduksjon av trinukleotider under oligonukleotidsyntese, istedenfor én deoksyribonukleotidbase av gangen. Polypeptidet innebefattende stillas aminosyresekvensene angitt ovenfor er nye Affibody molekyler. Som sådan, er de avledet fra stafylokokkprotein A (SpA). I denne sammenhengen menes ikke avledet at polypeptidet i seg selv på noen som helst måte nødvendigvis oppstår direkte fra SpA. Istedenfor menes det at stillaset har en sekvens og strukturell likhet til ett SpA domene, hvor aminosyrene i den hydrofobiske kjernen av de tre heliske bunt (three helical bundle) proteinene er konservert. 1 2 Forskjellige modifikasjoner av, og/eller tilføyelser til, polypeptidet bestående av populasjonen i henhold til foreliggende oppfinnesle kan utføres for å skreddersy polypeptidene til den konkrete tiltenkte anvendelsen, uten å avvike fra virkeområdet av foreliggende oppfinnelse. Slike modifikasjoner og tilføyelser er beskrevet i nøyere detalj nedenfor, og kan innebefatte ytterligere aminosyrer innebefattet i det samme polypeptidkjedet, eller markører og/eller terapeutiske midler som er kjemisk konjugert eller ellers bundet til polypeptidet bestående av populasjonen. I noen utførelsesformer kan noen ytterligere aminosyrerester på den C-terminale enden foretrekkes. Disse ytterlige aminosyrerestene kan spille en rolle i binding av polypeptidet, men kan likegodt tjene andre formål, relatert for eksempel til en eller flere innen produksjon, rensing, stabilisering, kopling eller deteksjon av polypeptidet. Slike ytterligere aminosyrerester kan innebefatte en eller flere aminosyrer tilføyd med hensikt på kjemisk kopling. Et eksempel på dette er tilsetting av cysteinrester til den helt første eller helt siste posisjonen i polypeptidkjeden, det vil si, ved N- eller C-terminal. En cysteinrest for anvendelse i kjemisk kopling kan også introduseres ved å erstatte et annen aminosyre på overflaten av proteindomenet, fortrinnsvis på en del av overflaten som ikke er involvert i målbinding. Slike ytterlige aminosyrerester kan også innebefatte en markør for rensing eller deteksjon av polypeptidet, slik som heksahistidyl (His 6 ) markør, eller en myc markør eller en FLAG markør for interaksjon med antistoff spesifikk mot markøren. En fagkyndig person er kjent med andre alternativ. 3 De ytterligere aminosyrerestene diskutert ovenfor kan også bestå av en eller flere polypeptiddomene(r) med enhver ønskelig funksjon, slik som andre bindingsfunksjoner, eller en enzymatisk funksjon, eller en metallion-chelaterende funksjon, eller en fluorescerende funksjon, eller kombinasjon derav.

9 - 8 - I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en populasjon av polynukleotider. Hvert polynukleotid i denne populasjonen koder for et medlem av populasjonen av polypeptider beskrevet ovenfor. I et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en kombinasjon av en polypeptidpopulasjon i henhold til foreliggende oppfinnelse og en polynukleotid populasjon i henhold til foreliggende oppfinnelse hvori hvert medlem av polypeptidpopulasjonen er fysisk eller spatialt assosiert med polynukleotidet som koder dette medlemmet via midler for genotyp-fenotyp kobling. Denne fysiske eller romlige assosiasjonen vil være mer eller mindre streng, avhengig av systemet anvendt. 1 Midlene for genotyp-fenotyp kopling, kan innebefatte en bakteriofag fremvisnings system (Phage display system). Bakteriofage fremvisningssystemer er kjent for en fagkyndig, og er, for eksempel, beskrevet i Smith GP (198) Science 228: og Barbas CF et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88: Videre, midlene for genotyp-fenotyp kopling kan innebefatte celleoverflate fremvisningssystemer. Celleoverflate fremvisningssystemet kan innebefatte prokaryote celler, slik som gram + celler, eller eukaryote celler, slik som gjærceller.. Celleoverflate fremvisningssystemer er kjent for en fagkyndig person. Prokaryote systemer er, for eksempel, beskrevet i Francisco JA et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: and Lee SY et al. (03) Trends Biotechnol 21: 4-2. Eukaryote systemer er, for eksempel, beskrevet i Boder ET et al. (1997) Nat Biotechnol 1:3-7 and Gai SA et al. (07) Curr Opin Struct Biol 17: Videre, midlene for genotyp-fenotyp kopling kan innebefatte et cellefritt fremvisningssystem. Det cellefrie systemet kan innebefatte et ribosomt fremvisningssystem, eller en in vitro avgrensende fremvisningssystem, eller et system for cis fremvisning, eller et microkulesystem. Ribosome fremvisningssystemer er kjent for fagkyndige og er, for eksempel, beskrevet i Mattheakis LC et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91: og Zahnd C et al. (07) Nat Methods 4: In vitro avgrensningssystemer er kjent for fagkyndige, og er, for eksempel, beskrevet i Sepp A et al (02) FEBS Lett 32:4-48. Cis fremvisningssystem er kjent for fagkyndige, og er, for eksempel beskrevet i Odegrip R et al (04) Proc Natl Acad Sci U S A 1: Microkule fremvisningssystem er kjent for fagkyndige, og er, for eksempel, beskrevet i Nord O et al (03) J Biotechnol 6:1-13.

10 - 9 - Videre, midlene for genotyp-fenotyp kopling kan innebefatte et ikke-fremvisnings system slik som proteinfragment komplementeringsanalyse (PCA). PCA systemer er kjent for fagkyndige, og er, for eksempel, beskrevet i Koch H et al (06) J Mol Biol 37: I et fjerde aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes en metode for å selektere et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål fra en populasjon av polypeptider, innebefattet av trinnene: (a) tilveiebringe en populasjon av polypeptider som beskrevet over; (b) bringe populasjonen av polypeptider i kontakt med det forhåndsbestemte målet under betingelser som muliggjør spesifikk interaksjon mellom målet og minst ett ønsket polypeptid som har affinitet til målet; og (c) seleksjon, på basis av nevnte spesifikke interaksjon, av minst ett ønsket polypeptid fra den gjenværende populasjonen av polypeptider. 2 Denne metoden nedenfor kalles seleksjonsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse. Trinn (a) kan innebefatte forberedende trinn for å tilveiebringe en populasjon av polynukleotider og uttrykke nevnte populasjon av polynukleotider for å gi nevnte populasjon av polypeptider. Dette midlet for å gi en populasjon av polypeptider varierer avhengig av fremvisningssystemet anvendt og eksempler på slike midler kan bli funnet i genotyp-fenotyp referansene ovenfor. Hvert medlem av nevnte populasjon anvendt i selekteringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fysisk bli assosiert til polynukleotidet som koder til dette medlemmet via midler for genotyp-fenotyp kopling. Dette midlet for genotyp-fenotyp kopling kan være én av de som er diskutert ovenfor. 3 Trinn (b) innebefatter trinnene for å bringe populasjonen av polypeptider i kontakt med det forhåndsbestemte målet under betingelser som muliggjør spesifikk interaksjon mellom målet og minst ett ønsket polypeptid som har en affinitet til målet. Variasjonsbredden av egnede betingelser er bestemt av robustheten av målet, robustheten av fremvisningssystemet, og av de ønskede egenskapene til interaksjonen med målet. For eksempel kan en spesifikk metode for å separere interaksjonen slik som forsuring til en forhåndsbestemt ph være ønskelig. En fagkyndig person vet hvilke eksperimenter som kreves for å bestemme ønskelige betingelser.

11 - - Trinn (c) innebefatter seleksjon av minst ett polypeptid. Dette midlet for seleksjon av ønskede polypeptid fra den gjenværende populasjonen, basert på den spesifikke interaksjonen mellom det forhåndsbestemte målet og minst ett ønsket polypeptid som har affinitet til målet varierer avhengig av fremvisningssystemet anvendt og kan bli funnet i genotyp-fenotyp referansene ovenfor. For eksempel, så er in vitro fremvisnings-seleksjonssystemet cellefritt i motsetning til systemer slik som bakteriofag fremvisning og proteinfragment avgrensninsanalysen. I et femte aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en metode for å isolere et polynukleotid som koder et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål, innebefattende trinnene: 1 - Selektere nevnte ønskede polypeptid og polynukleotidet som koder det fra en populasjon av polypeptider ved å anvende seleksjonsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse basert på anvendelsen av nevnte stillas, og - Isolere de således separerte polynukleotid som koder det ønskede polypeptidet. Denne metoden nedenfor betegnes isoleringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse. 2 Separasjon av polynukleotidet fra polypeptidet kan utføres på forskjellig vis avhengig av fremvisningssystemet anvendt for seleksjon. For eksempel, i det cellefrie fremvisningssystemet, slik som cis fremvisning og ribosom fremvisning gjenvinnes polynukleotidet eller det korresponderende mrna-et gjennom effektiv eluering fra polypeptidet ved å anvende midler beskrevet i genotyp-fenotyp referansene ovenfor. 3 Isolering av polynukleotidet kan utføres ved forskjellige metoder avhengig av fremvisningssystemet anvendt for seleksjon. For eksempel, i proteinfragment avgrensingsanalysen, kan polynukleotidet isoleres direkte ved spesifikk PCR amplifikasjon ved å anvende egnede oligonukleotider. Eksepsjonelt, slik som i ribosom fremvisning, kan polynukleotidet isoleres fra det korresponderende mrna ved å anvende revers transkripsjon. De forskjellige midlene for isolering av polynukleotidet kan finnes i genotyp-fenotyp referansene ovenfor.

12 I et sjette aspekt av den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringes en metode for å identifisere et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål, innebefattende av trinnene: - Isolering av polypeptidet som koder nevnte polypeptid ved å anvende isoleringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse; og - Sekvensering av polynukleotidet for å etablere ved deduksjon aminosyresekvensen av nevnte ønskede polypeptid. Sekvensering av polynukleotidet kan utføres i henhold til standardprosedyrer kjent for fagkyndige. 1 I et syvende aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en metode for seleksjon og identifisering av et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål fra en populasjon av polypeptider innebefatter trinnene: (a) syntetisering hvert medlem av populasjonen av polypeptider på en separat bærer eller kule; (b) selektering eller anriking av bæreren eller kulene basert på interaksjonen av polypeptidet med det forhåndsbestemte målet; og (c) identifisere polypeptidet ved proteinkarakteriseringsmetoder. I trinn (c), er det for eksempel mulig å anvende massespektrometri analyser. 2 Denne metoden betegnes kalles seleksjon og identifiseringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse. 3 I et åttende aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en metode for produksjon av et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål, innebefatter trinnene: - Selektering og identifisering et ønsket polypeptid ved å anvende seleksjonsmetodene i henhold til foreliggende oppfinnelse eller seleksjon og identifiseringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse ved å anvende nevnte stillas, og - Fremstilling av nevnte ønskede polypeptider.

13 Denne metoden beskrevet nedenfor kalles fremstillingsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse. I fremstillingsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstilling utføres ved å anvende rekombinant ekspresjon av et polynukleotid som koder det ønskede polypeptidet. Fremstillingen kan også utføres ved å anvende kjemisk syntese av det ønskede polypeptidet de novo. I et niende aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en metode for fremstilling av et ønsket polypeptid som har en affinitet til et forhåndsbestemt mål, innebefatter trinnene: 1 (a1) isolering av et polynukleotid som koder nevnte ønskede polypeptid ved å anvende isoleringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse; eller (a2) revers translatere et polypeptid identifisert ved å anvende seleksjon og identifikasjonsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse; og (b) uttrykke de således isolerte polynukleotider for å fremstille nevnte ønskede polypeptider. Hvori trinn (b) utføres enten etter trinn (a1) eller trinn (a2). 2 Uttrykket av polynukleotidet kan utføres i enhver egnet ekspresjonsvert kjent av fagkyndige slik som, men ikke begrenset til bakterielle celler, gjærceller, insektsceller eller mammalske celler. Betegnelser som bindingsaffinitet til et forhåndsbestemt mål, binding til et forhåndsbestemt mål og lignende peker på en egenskap av polypeptidet som kan måles direkte gjennom bestemmelse av affinitetskonstanter, det vil si, mengden av polypeptider som assosierer og dissosierer ved en gitt antigen konsentrasjon. Forskjellige metoder kan anvendes for å karakterisere molekylærinteraksjonen, slik som, men ikke begrenset til, kompetitivanalyser, ekvilibriumsanalyser og mikrokalorimetriske analyser, og sanntids interaksjonsanalyser basert på overflate plasmonresonans interaksjon (for eksempel ved å anvende et Biacore instrument). Disse metodene er godt kjent for fagkyndige og er beskrevet, for eksempel, i Neri D et al (1996) Tibtech 14: and Jansson M et al (1997) J Biol Chem 272: Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at et polypeptid som binder til et forhåndsbestemt mål, anskaffet ved enhver av de overnevnte metodene kan utvise en eller flere overraskende fordel(er), i forhold til kjente polypeptider som binder til de

14 samme målene, samtidig som evnen av de tidligere nevnte kjente polypeptider til å binde målet opprettholdes. Ikke-begrensede eksempler av slike fordeler er som følger: 1 2 Et polypeptid, som binder til et forhåndsbestemt mål og anskaffes ved enhver av de overnevnte metodene, innebefattende færre aminosyrerester enn det som kunne forårsake problemer, slik som lavt utbytte og suksess rate, ved kjemisk syntese av polypeptidsekvensen, slik som asparagin, asparaginsyre og metionin. Et polypeptid, som binder til et forhåndsbestemt mål og anskaffes ved enhver av de overnevnte metodene, innebefattende færre aminosyrerester enn det som fører til overflatehydrofobisitet. Dette impliserer færre problemer med lav løselighet og aggregering. Uten å ønske om å være bundet til teori, er det også for tiden antatt at de mer hydrofile egenskapene virker på å endre biodistribusjonen av polypeptidet ved administrasjon til verten, fra en hepatobiliær vei (ekskresjon gjennom leveren) til en mer ønsket renal vei (ekskresjon gjennom nyrene). Et polypeptid, som binder til et forhåndsbestemt mål og anskaffes ved enhver av de overnevnte metodene, innebefattende færre aminosyrerester som er assosiert med polypeptid-stabilitetsproblemer, slik som metionin, asparagin, og dipeptidet asparagin-prolin. Metionin er følsom for oksidering, asparagin er følsom for deaminering, og asparagin-prolin båndet er følsom for syre-kløyving, og de bidrar derfor til ikke-homogeniteten til sluttproduktet. Et polypeptid, som binder til et forhåndsbestemt mål og anskaffes ved enhver av de overnevnte metodene, som mangler aminosyrerester slik at, i en lignende sekvenskontekst, har blitt funnet å øke interaksjonen med immunoglobuliner som inneholder et tungt kjede variabel domene fra VH3 (Silverman GJ (1992) supra). Uten å ønske å være bundet til teori, tror man for tiden at utskifting av slike aminosyrerester i et polypeptid, som binder til et forhåndsbestemt mål og anskaffes ved enhver av de overnevnte metodene, reduserer antigenisiteten til polypeptidet ved administrasjon av det samme til en vert. 3 Blant fordelene av det innovative stillaset, er alkalisk stabilitet, lav antigenisitet, strukturell stabilitet, forbedrede egenskaper ved kjemisk syntese og/eller økt hydrofilisitet blant de viktigste. Polypeptider, som binder til et forhåndsbestemt mål anskaffet ved enhver av de overnevnte metodene, kan anvendes som deteksjonsreagens, agn reagens,

15 separasjonsreagens, diagnostisk agens for diagnose in vivo eller in vitro, som terapeutiske agens i seg selv eller som midler for å binde andre terapeutiske og/eller diagnostiske agenser til det forhåndsbestemte målet. Metoder som anvender polypeptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse in vitro kan utføres i forskjellige format, slik som i mikrotiterplater, i proteinmatriser, på biosensor overflater, vevsseksjoner, og så videre. Modifikasjonene diskutert ovenfor for polypeptidet som inngår i populasjonen i henhold til foreliggende oppfinnelse gjelder også polypeptidene anskaffet ved enhver av de overnevnte metodene. 1 Polypeptidet i henhold til foreliggende oppfinnelse kan produseres med ethvert kjent middel, inkludert kjemisk syntese, eller ved uttrykk i forskjellige prokaryote eller eukaryote verter, inkludert planter og transgene dyr. Den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli illustrert i detalj gjennom beskrivelser av eksperimenter utført i samsvar med disse. De påfølgende eksemplene skal ikke tolkes som begrensende. I eksemplene er det referert til vedlagte figurer. Den foreliggende oppfinnelsen er begrenset eksklusivt til det som er definert i vedlagte patentkrav. Kort beskrivelse av figurene 2 3 Figur 1 viser resultatene anskaffet fra CD-målingene ved å anvende et Jasco J-8 spektropolarimeter. De variable temperaturmålingene av His 6 -Z TNF-α:32 ble utført ved 0, mg/ml i PBS buffer. Absorbansen ble målt ved 221 nm fra til 80 C med en temperaturstigning på C/min. En celle med en optisk veilengde på 1 mm ble anvendt. Smeltetemperaturen (Tm) til His 6 -Z TNF-α:32 ble bestemt fra den variable temperaturmålingen. Figur 2 viser en oversikt over seleksjonen beskrevet i eksempel 4. Seleksjonen ble utført i forskjellige spor, en med en høy målkonsentrasjon (spor 1) og en med lav målkonsentrasjon (spor 2). Målkonsentrasjonene er angitt for hvert spor og syklus så vel som antall vaskinger (i parenteser) Figur 3 er et overleggsplott av to CD-spektre før (heltrukken linje) og etter (stiplet linje) oppvarming av His 6 -Z04674 til 96 C. Figur 4 viser et resultat av Biacore-analysen av polypeptidvariantene; sensorgram anskaffet etter sekvensiell injeksjon av His 6 -Z04674 (fylte rektangler), His6-Z04687

16 - 1-1 (fylte trekanter), His6-Z0466 (hule trekanter), His 6 -Z04674 (sort linje), His 6 -Z04781 (grå linje) og kjørebuffer (hule rektangler) over immobiliserte Dynazyme. Responsen (i RU) ble plottet mot tid (s). Figur viser analytisk HPLC elueringsprofiler for polypeptider med sekvensen maesekyakemr NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK (SEQ ID NO:) ved syntesetrinnet av aminosyrerestene 18 til 8. A) Syntese utført på polystyren resin ved å anvende pseudoproliner i posisjoner 22-23, 41-42, 4-46 og 3-4. B) Standard peptidsyntese på polystyren resin uten pseudoproliner. Figur 6 viser analytisk HPLC elueringsprofiler med sekvensen maesekyakemr NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK (SEQ ID NO:) ved syntesetrinnet av aminosyrerestene 1 til 8 (A) og -8 (B). A) syntese utført på polystyren resin ved å anvende pseudoproliner i posisjonene 22-23, 41-42, 4-46 og 3-4. B) Standard peptidsyntese på polystyren resin uten pseudoproliner. Figur 7 viser analytisk HPLC elueringsprofiler for polypeptider med sekvensen A) AEAKYAKEMW IAWEEIRNLP NLNGWQMTAF IAKLLDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKC (SEQ ID NO:11) (i henhold til foreliggende oppfinnelse) og B) AENKFNKEMW IAWEEIRNLP NLTGWQMTAF IASLLDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK (SEQ ID NO:12) (til sammenligning). Eksempler Eksempel 1 Konstruksjon av et kombinatorisk polypeptidbibliotek 2 3 Kombinatoriske polypeptidbibliotek ble konstruert i all vesentlighet som beskrevet i Grönwall C et al. (07) J Biotechnol 128: , ved PCR amplifikasjon av et 123-nukleotidtemplat oligonukleotid med visse degenererte kodoner ( -GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC-3 (SEQ ID NO: 38)) som koder heliksene 1 og 2 fra Staphylococcus aureus protein A-deriverte protein Z (Nilsson et al (1987), supra), med punktmutasjonene N3A, FY, N6A, N23T and S33K. PCR amplifikasjonen ble utført ved å anvende primerne AFFI-1364 og AFFI-136 med henholdsvis et Xho I sete and a Sac I sete, understreket i tabell 1.

17 Det resulterende genfragmentet som koder biblioteket ble restriksjonskuttet med Xho I og Sac I. Følgelig ble det bibliotekskodende genfragmentet ligert i en fagemidvektor restriksjonskuttet med Xho I- og Sac I tilpasset for fag fremvisning anmerket pay16, basert all vesentlighet på fagemidvektoren paffi1 (Grönwall C et al. (07), supra), i ramme med aminosyrerestene 41-8 av protein Z, som koder heliks 3 med punktmutasjonene A42S, N43E, A46S og A4S. Heliks 3 ble konstruert ved hybridisere av de to komplementære oligonukleotidene AFFI-1333 and AFFI-1334 (tabell 1). Den resulterende biblioteksvektoren ble eletroporert i Escherichia coli stammen RR1ΔM1 (Ruther U (1982) Nucl Acids Res :76-772), som gav et bibliotek på 2,4 x medlemmer. 1 Preparering av fag stocks fra biblioteket ble utført ved å anvende standardprosedyrer som involverer M13K07 hjelpe-fagen (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), som regelmessig gav bakteriofag-titere på omtrent 11 cfu per ml kultivering. Tabell 1. Liste over oligonukleotider Eksempel 2 fagdisplay seleksjon og karakterisering av humant HER2 bindings polypeptidvarianter 2 Sammendrag Biotinylerte HER2 proteiner er brukt som mål i bakteriofagfremvisnings seleksjon ved å anvende biblioteket konstruert i eksempel 1. Seleksjoner er utført ved å benytte et utvalg av betingelser for å maksimere sannsynligheten for å anskaffe molekyler som har høy affinitet til HER2. Etter eluering av selekterte fager, blir de korresponderende

18 uttrykte proteiner analysert for affiniteten til HER2 i et ELISA oppsett. Positive kloner er identifisert og sekvensert, og de predikerte aminosyresekvensene av det korresponderende polypeptidet og deres HER2 bindingsmotiv utledes, som gir et høyt antall sekvenser med HER2 bindende molekyler. Biotinylering av HER2 Lyofilisert humant HER2 protein (R&D Systems, #1129-ER) er løst opp i PBS (2,68 mm KCl, 1,47 mm KH 2 PO 4, 137 mm NaCl, 8,1 mm Na 2 HPO 4, ph 7,4) til en sluttkonsentrasjon på mg/ml. EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, #2133) er løst opp i vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mg/ml og en og ganger molart overskudd er tilsatt til 00 μg HER2 i et totalvolum på 0, ml. Blandingen inkuberes i romtemperatur (RT) i minutter. Ubundet biotin fjernes ved dialyse mot PBS ved å bruke en dialysekasett (Slide-A-Lyser, kda; Pierce). 1 Bakteriofagfremvisning seleksjon Totalt utføres fem seleksjonsrunder, ved å benytte økende stringente betingelser, slik som å redusere HER2 konsentrasjonen og øke antall vaskinger. Tre innledende runder er utført, hovedsakelig med hensyn på å etablere en egnet seleksjonsprotokoll. Seleksjon er så utført i to ytterligere runder ved å anvende kombinasjonene av seleksjonsbuffer, mål konsentrasjon og fastfasemateriale oppgitt i tabell 2. Tabell 2: seleksjonsbetingelser for HER2 seleksjon 2 Alle rør og kuler (Dynabeads M-280 Streptavidin, #112.06; Dynal) anvendt i denne seleksjonsprosedyren er forhåndsblokkert med TPBSB ( %) (0,0 % Tween, % bovint serum albumin (BSA), 0,02 % Na azid i PBS) eller gelatin (0, %) i minst minutter ved RT.

19 Seleksjonsløsninger (1 ml) inneholdt biotinylert humant HER2, bakteriofager, Na azid (0,02 %), Tween (0,0 %) og enten BSA (3 %) eller gelatin (0,1 %) i henhold til tabell 2, og er tibredt i PBS. Fagene er inkubert med biotinylert humant HER2 mål ved 4 C i tre dager i runde 4 og i én dag i runde, etterfulgt av 1 time inkubasjon under omrøring ved RT. Seleksjonsprøvene overføres til blokkerte streptavidinkuler i 1 minutter ved omrøring ved RT. Kulene er vasket ganger med 1 ml seleksjonsbuffer (Det vil si TPBSB (3 %) (0,0 % Tween, 3 % bovint albumin serum (BSA), 0,02 % Na azid i PBS) eller GT 0,1 (0,1 % gelatin 0,1 % Tween og 0,02 % Na azid i PBS)), etterfulgt av vask med PBS der den nest siste vaskingen er utført i minutter. Bakteriofagene er enten eluert med 00 μl 0 mm glycin-hcl, ph 2,2, i minutter ved RT, etterfulgt av umiddelbar nøytralisering med 900 μl PBS supplementert med 0 μl 1 M Tris-HCl, ph 8,0, eller eluert med 00 μl trypsin (2 mg/ml) i minutter ved RT etterfulgt av tilføying av 00 μl aprotinin (0,4 mg/ml). De eluerte fagene (3/4 av volumet) er brukt til å infisere 0 ml log fase E. coli RR1ΔM1 celler (Rüther, 1982, supra) etter hver seleksjonsrunde. Etter minutter inkubasjon med rolig omrøring og minutter kraftig omrøring ved 37 C, sentrifugeres cellene og pelleten løses i et mindre volum og fordelt på TYE-plater (1g/l agar, g/l tryptonvann (Merck), g/l gjærekstrakt, 3 g/l NaCl supplementert med 2 % glukose og 0 μg/ml ampicillin) og til slutt inkubert over natt ved 37 C. Bakteriofag stock preparering Celler fra platene blir resuspendert i TSB medium ( g/l tryptisk soya buljong) og cellekonsentrasjonen er bestemt ved å måle optisk densitet ved 600 nm ved å anta at OD 600 = 1 tilsvarer x 8 celler/ml. Celler er inokulert (omtrent 0 ganger overskudd av celler i forhold til eluerte fager) i 0 ml TSB + YE medium supplementert med 2 % glukose og 0 μg/ml ampicillin og dyrket ved 37 C til omtrent OD 600 = 0,6-0,7. Deretter, overføres ml til en ny flaske og infiseres med ganger molart overskudd av M13K07 hjelper-fag (New England Biolabs #NO31S) og inkuberes i minutter under lav omrøring. Cellene pelleteres ved 00 g i minutter og resuspenderes i 0 ml TSB + YE medium supplementert med 0 μm isopropyl-ß-d-1- tiogalaktopyranosid (IPTG), 0 μg/ml kanamycin og 0 μg/ml ampicillin og dyrket over natt ved 0 rpm og 2 C. En andel av de resuspenderte cellene lagres ved -80 C som en glyserol stock. 3 Overnattskulturen sentrifugeres ved 0 g i minutter og fagene i supernatanten presipiteres ved å tilsette ¼ av volumet til presipiteringsbufferen ( % PEG/2, M NaCl) og inkuberes på is i 1 time. Presipiterte fager pelleteres ved sentrifugering ved

20 g ved 4 C i minutter, resuspenderes i ml PBS og deretter gjentas presipiteringsprotokollen. Bakteriofagene er tilslutt resuspendert i 1 ml PBS og filtrert gjennom et 0,4 μm filter. 1 Seleksjon, vask og elueringsløsninger titreres etter hver seleksjonsrunde. Bakteriofagløsninger fortynnes i sterilt vann på en mikrotiterplate og 0 μl log fase E. coli RR1ΔM1 celler tilsettes til hver bakteriofagfagfortynning. Etter minutters inkubering ved RT, overføres μl fra hver titrering til en TYE-plate og inkuberes over natt ved 37 C. De resulterende koloniene telles og titere (cfu/ml) utregnes. ELISA analyse av HER2 binding Klonene fra den siste seleksjonsrunden er uttrykt og screenes for HER2 bindingsaktivitet ved å anvende et ELISA oppsett slik som beskrevet i eksempel 4 under (men anvender HER2 som målprotein), eller som beskrevet nedenfor. Tilfeldig utvalgte kolonier uttrykkes i 96 dyp-brønns plater ved å inokulere hver koloni i 1 ml TSB + YE medium supplementert med 0 μg/ml ampicillin og 1 mm IPTG og dyrket i timer ved 37 C. Etter inkubering, fremstilles replikatplater ved å overføre en liten andel fra hver kultur til en 96-brønnsplate med 1 % glyserol for lagring ved - C. Gjenværende celler pelleteres ved sentrifugering ved 00 g i minutter, resuspenderes i 400 μl PBS-T 0,0 (PBS supplementert med 0,0 % Tween ) og frosset ved -80 C. Frosne prøver tines i et vannbad og cellene pelleteres ved 3700 g i minst minutter. Supernatantene inneholdende uttrykte molekyler samles og anvendes i ELISA. 2 3 Halvflatede mikrotiterplater (Costar, #3690) belegges over natt ved 4 C med 0 μl HSA ved en konsentrasjon på 6 μg/ml i ELISA beleggingsbuffer (coatingbuffer) (Sigma, #41). Brønnene blokkeres med 0 μl blokkeringsbuffer (2 % fettfri tørrmelk i PBS) i 2 timer ved RT. Etter fjerning av blokkeringsbufferen, tilsettes 0 μl av de preparerte proteinene til brønnene, og platene inkuberes i 1, timer ved RT. Supernatanten fjernes, og biotinylert HER2 ved en konsentrasjon på 0,- μg/ml i PBS-T 0,0 tilsettes brønnene og inkuberes i 1, timer. Bundne komplekser detekteres med pepperrot peroksidase, konjugert med streptavidin (HRP, Dako #P0397) fortynnet 1:000 i PBS-T 0,0, inkuberes i 1 time ved RT. 0 μl ImmunoPure TMB substrat (Pierce, #34021) tilsettes i brønnene og platene behandles i henhold til produsentens anbefalinger. Absorbansen i brønnene avleses ved 40 nm i en Tecan Ultra 384 ELISA avleser (Tecan) og evalueres ved å anvende Magellan v..0 programvare (Tecan). Før tilsetting av hvert nye reagens, utføres fire vaskinger med PBS-T 0,0.

21 - - Basert på resultatene av dette eksperimentet, utvelges kloner for sekvensering som beskrevet videre. Sekvensering av ELISA-positive kloner PCR-fragmenter fra selekterte kolonier amplifiseres ved å anvende egnede oligonukleotider. Sekvensering av amplifiserte fragmenter utføres ved å anvende en BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), i henhold til produsentens anbefalinger og med egnede biotinlyerte oligonukleotider. Sekvenseringsreaksjonene renses ved binding til Dynabeads REGEN streptavidinbelagte paramagnetiske kuler ved å anvende et Magnatrix 8000 instrument (Magnetic Biosolutions), og tilslutt analysert på ABI PRISM Genetic Analyser (Applied Biosystems). 1 Subkloning i plasmid pa Y1448 DNA-kodede selekterte og HER2-spesifikke molekyler subklones i ekspresjonsvektoren pay1448 for å fremstille His 6 -taggede monomeriske molekyler uttrykt som MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD (His 6 -Z#####), hvori Z##### betegner et identifisert medlem av oppstartspopulasjonen av variantmolekylet. Plasmider inneholdende insertet renses fra 2 ml overnattskulturer fra E. coli RR1ΔM1 celler i TSB supplementert med 0 μg/ml ampicillin ved å anvende Qiagen Mini Kit (Qiagen) i henhold til fabrikantens anbefalinger. 2 DNA fra selekterte molekyler subklones i ekspresjonsvektoren pay1448 ved AccI-NotI PCR klebrig-ende kloning ved å anvende egnede PCR primer par. Uttrykksvektoren pay1448 restriksjonskuttes i to trinn ved 37 C i 4 timer ved å anvende AccI og NotI i henholdsvis NEB4 og NEB3 buffer (New England Biolabs), og defosforyleres med Calf intestinal alaisk fosfatase (CIAP; Fermentas) i 1 timer ved 37 C. Det kløyvede plasmidet og fragmentet renses med QIAquick PCR rensekit (Qiagen) i henhold til produsentens anbefalinger. 3 PCR produktet hybridiseres og ligeres i AccI-NotI restriksjonskuttet og defosforylert pay1448 i 1 time ved RT ved å anvende T4 DNA ligase ( enheter/μl; Fermentas). Alikvoter av ligeringene elektroporeres i E. coli BL21 (DE3) celler. Cellene plates på tryptose blodagar base (TBAB) plater supplementert med 0 μg/ml kanamycin og

22 inkuberes over natt ved 37 C. Positive kloner verifiseres først for inserter med PCRscreening og så analysert for korrekte sekvenser som beskrevet ovenfor. Uttrykk og rensing av His 6 -merkede polypeptider Selekterte molekyler, alle sub-klonet i pay1448 som beskrevet ovenfor, er uttrykt i E. coli BL21 (DE3) som fusjoner til en N-terminal His 6 -markør og renset med IMAC. En koloni fra hvert molekyl anvendes til å inokulere ml TSB medium supplementert med 0 μg/ml kanamycin. Kulturene dyrkes over natt ved 37 C. Den etterfulgte dagen, blir 0 μl fra hver kultur inokulert separat i 0 ml TSB + YE medium supplementert med 0 μg/ml kanamycin i en 1-liters flaske. Kulturene dyrkes ved 0 rpm ved 37 C til en OD 600 på 0,7-1 hvorpå IPTG tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0, mm og cellene inkuberes ved RT over natt ved 0 rpm. Kulturene høstes ved sentrifugering ved 8000 g i minutter og pelleten lagres i en fryser inntil protein preparering. 1 De His 6 -merkede proteinene blir IMAC renset under denaturerende betingelser ved å anvende 1, ml Ni-NTA Superflow kolonner (Qiagen). Bufferen byttes til PBS ved å anvende PD- kolonner (GE Healthcare). Proteinkonsentrasjon bestemmes ved å anvende A 280 og BCA Protein Assay Regent Kit (Pierce) etter anbefalingene til produsenten. Renheten til proteinet analyseres ved SDS-PAGE farget med Coomassie Blue R. 2 Biosensoranalyse av selekterte molekylers affinitet til humant HER2 Biosensoranalyse på et Biacore 00 instrument (GE Healthcare) er utført med humant HER2 immobilisert ved aminkobling til det karboksylerte dekstranlaget på overflaten til en CM- brikke (forskningskvalitet; GE Healthcare) i henhold til produsentens anbefalinger. Overflate 1 på brikken er aktivert og deaktivert og anvendt som referanse celle under injeksjoner. De selekterte molekylene, uttrykt og renset som beskrevet over, fortynnes i HBS-EP (GE Healthcare) til 2 nm og injiseres med en konstant væskestrøm på 2 μl/min i minutter, etterfulgt av dissosiasjon i HBS-EP i minutter. Overflaten regenereres med to injeksjoner med 2 mm HCl. 3 Eksempel 3 Kloning, produksjon og evaluering av smeltetemperatur og in vitro antigenisitet og nyskapende stillasvarianter Sammendrag

23 Dette eksempelet beskriver kloning, produksjon og evaluering av originale og nyskapende stillasvarianter. De introduserte stillasmutasjonene er antatt å forbedre flere egenskaper til polypeptidmolekylet, slik som antigenisitet, hydrofilisitet og alkalisk og strukturell stabilitet. Således, ble forskjellige molekyler evaluert for smeltetemperatur og in vitro antigenisitet og resultatene viste at de nyskapende molekylene hadde økt smeltetemperaturer og utviste lavere in vitro antigenisitet (lavere IgG binding) sammenlignet med originale molekyler. 1 Kloning av polypeptider For originalkonstrukter, ble DNA-sekvenser som koder molekyler spesifikt for tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), HER2, insulin, Taq polymerase og platederivert vekstfaktor reseptor beta (PDGF-Rβ) (Tabell 3) amplifisert ved PCR i to individuelle reaksjoner hver (PCR1 og PCR2). Primerpar AFFI-267/AFFI-14 og AFFI-1/AFFI- 270 (Tabell 4), koder deler av AccI restriksjonssete i -enden, ble anvendt i henholdsvis PCR1 og PCR2. For å preparere plasmidtemplatene, ble bakterier som inneholder plasmid DNA-et dyrkes over natt i TBS medium, supplementert med 0 μg/ml kanamycin. Cellene ble pelletert ved sentrifugering og plasmidene preparert ved å anvende QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). 2 For nyvinnende konstrukter, ble PCR amplifikasjon (PCR1 og PCR2) av nukleotidsekvensene kodende modifiserte nyvinnende molekyler utført ved å anvende delvis overlappende oligonukleotider som templat (AFFI-13-AFFI-1323, AFFI-1326 og AFFI-1327) eller å anvende vektor med originalkonstrukt og oligonukleotider inneholdende relevante mutasjoner (AFFI-69, AFFI-70, AFFI-111 og AFFI-112) (Tabell 4). Primerparene AFFI-1328/AFFI-1331 and AFFI-1329/AFFI-13, som koder deler av AccI restriksjonssetet i -enden, ble inkludert i PCR-reaksjonen. PCR-reaksjonene ble amplifisert ved å anvende Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene, # ) i henhold til en standard PCR-protokoll og PCR-produktet ble analysert med 1 % agarose geleelektroforese. 3 PDFG-Rβ bindende Z-variantene ble generert ved å anvende oligonukleotider med varierte kodoner og en PCR-basert mutageneseteknikk. Oppnådde PCR-fragment ble ligert i kløyvede ekspresjonsvektorer ved å anvende In-Fusion teknologi (Clontech, #639607).

24 For å generere DNA fragmenter inneholdende oppstrøms og nedstrøms AccI klebrige ender for alle konstrukter, ble oppstrøms og nedstrøms nukleotid-tråder fra PCR1 og PCR2 produktene separert ved å anvende magnetiske streptavidinkuler. Etter minutter inkubering ved RT, under kontinuerlig rotering, ble kulene vasket med vaskebuffer (0 mm Tris-HCl ph 7,, mm MgCl 2, mm DTT) og oppvarmet til 9 C i minutter. Supernatanten inneholdende ikke-biotinylerte fragmenter ble samlet og varmet til 9 C etterfulgt av trinnvis avkjøling til 2 C i minutter for å hybridisere DNA-trådene. 1 DNA-fragmentet som koder bindingsmolekyler ble således ligert ved RT, i enten 2 timer eller over natt, i en CIP-behandlet (Kalve-tarm alkaisk fosfatase) og renset uttrykksvektor, tidligere restriksjonskuttet med AccI restriksjonsenzym. De oppnådde konstruktene var MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD, MGSSLQ-[Z#####]-VDC (for Z PDGF- Rβ:246) eller M-[Z#####]-C (for Z PDGF-Rβ:338 ). Ligeringene, ble transformert i elektrokompetente E. coli TOP celler og dyrket på plater slik som beskrevet i eksempel 2. Bakteriekolonier som inneholdt de nye konstruerte plasmidene ble PCR-screenet, og insert DNA sekvensene ble verifisert slik som beskrevet i eksempel 2. Verifiserte plasmider ble preparert som beskrevet tidligere. 2 Uttrykk av polypeptider E. coli BL21 (DE3) kulturer transformert med relevante plasmider ble inokulert i 800 ml TSB-YE medium supplementert med 0 μg/ml kanamycin og 0,3 ml/l skumhemmende middel (Breox FMT ) og dyrket ved 37 C til en OD 600 på omtrent 2. Proteinuttrykk ble så indusert ved tilføying av 1 M IPTG til en sluttkonsentrasjon på 0, mm. Dyrkingen ble utført ved å anvende multifermenteringssystemet Greta (Belach). Kulturene ble innhøstet timer etter induksjon ved sentrifugering ved x g i minutter. Supernatanten ble forkastet og cellepelleten samlet og lagret ved - C. Uttrykksgraden av proteinene ble bestemt ved å anvende SDS-PAGE og visuell inspeksjon fargede geler. 3 Rensing av uttrykte polypeptider Proteiner med His 6 markør ble renset som følger: Pelleterte bakterielle celler inneholdende løselig His 6 merkede polypeptider ble suspendert i His GraviTrap bindingsbuffer ( mm natriumfosfat, 0, M NaCl, 60 mm imidazol og 40 U/ml