1 / 14. Figurer. Figur 1. FSH ekpresjonsvektor

Transkript

1 1 / 14 Figurer Fig. 1, 2 og 3: Plasmidkart av pfshalfa/beta, pst3 og pst6 ekspresjonsvektorer. CMW = Cytomegalovirus-promoter, BGHp(A) = Bovin Veksthormon polyadenyleringssekvens, fl ori = fl replikasjonsstart, SV40 = SImian Virus 40 promoter, Neo = Neomycin resistensmarkør, Hyg = Hygromycin resistensmarkør, SV40 p(a) = Simian Virus 40 polyadenyleringssekvens, FSH A = Follikkelstimulerende hormon alfa polypeptid, FSH B = Follikkel-stimulerende hormon beta polypeptid, ST3GAL4 = α2,3-sialyltransferase, ST6GAL1 = α2,6-sialyltransferase, ColE1 = ColE1 replikasjonsstart, Amp = ampicillin resistens-markør. Figur 1. FSH ekpresjonsvektor

2 2 / 14 Figur 2. α2,3-sialyltransferase (ST3GAL4) ekspresjonsvektor Figur 3. α2,6-sialyltransferase (ST6GAL1) ekspresjonsvektor

3 3 / 14 Figur 4. Isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH dannet av Per.C6-celler som uttrykker stabilt FSH. Cellekultursupernatanter separert under native betingelser på en ph 3,0-7,0-grandient. Klon 005 er representativ for de fem kloner tatt forover for sialyltransferase-manupulering. Kloner inneholdende mindre sure isoformer ble kastet.

4 4 / 14 Figur 5. Eksempel på kloner analysert med isoelektrisk fokusering av rekombinant FSH fremstilt av Per.C6-celler som uttrykker FSH stabilt etter manipulering med α2,3- eller α2,6-sialyltransferase. Cellekultur-supernatanter separert under native betingelser på en ph 3,0-7,0 gradient. Klon 005 er den parentale Per.C6 FSH cellelinje. Kloner som oppviser basiske eller blandete profiler ble kastet (*). De gjenværende kloner oppviser oppnådd manipulering med en sialyltransferase for å øke antallet sialsyremolekyler på FSH.

5 5 / 14 Figur 6. Analyse av sialsyrebindinger av Per.C6 FSH. Renset Per.C6 FSH ble separert med SDS PAGE på duplikat-geler, overført til nitrocellulose og visualisert ved å bruke et DIG Glykan Differensieringssett (Kat. nr , Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Positive reaksjoner med Sambucus nigra agglutinin (SNA) indikerte terminalt bundet (2-6) sialsyre (A). Positive reaksjoner med Maackia amurensis agglutinin (MAA) indikerte terminalt bundet (2-3) sialsyre (B). Spor I produsents kontroll inneholdende α2,6-bindinger alene. Spor II produsents kontroll inneholdende α2,6- og α2,3-bindinger. Prøve a, kommersiell CHO-avledet rekombinant FSH (Gonal-f, Serono). Prøve b, parental Per.C6 rfsh, ingen sialyl-transferase-manipulering. Prøve c, Per.C6 rfsh med α2,6- sialyltransferase-manipulering. Prøve d, Per.C6 rfsh med α2,3-sialyltransferasemanipulering. A

6 6 / 14

7 7 / 14

8 8 / 14 Figur 7. Metabolske fjerningshastigheter av Per-C6 FSH-prøver. Hunnrotter (3 dyr per klon) ble injisert i halevenen på tidspunkt null med en bolus av rfsh (1 10 µg/rotte). Blodprøver samlet opp over tid ble undersøkt for FSH-innhold med ELISA.

9 9 / 14 Figur 8. Metabolske fjerningshastigheter av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per- C6 FSH-prøver. Hunnrotter (3 dyr per klon) ble injisert i halevenen på tidspunkt null med en bolus av rfsh (1 10 µg/rotte). Blodprøver samlet opp over tid ble undersøkt for FSH-innhold med ELISA.

10 10 / 14 Figur 9. Metabolske fjerningshastigheter av α2,6-sialyltransferase-manipulerte Per- C6 FSH-prøver med samtidig administrasjon av et 7500 gangers molart overskudd av asialofetuin for å mette ASGP-R i 1-2 timer.

11 11 / 14 Figur 10. Metabolske fjerningshastigheter av α2,3-sialyltransferase-manipulerte Per-C6 FSH-prøver. Prøver ble valgt for sitt sialsyre-innhold basert på sin IEFprofil.

12 12 / 14 Figur 11. Ovarivektøkning i henhold til metoden til Steelman og Pohley (1953). Per.C6 rfsh og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved forskjellige doser (3 rotter/dose).

13 13 / 14 Figur 12. Ovarivektøkning i henhold til metoden til Steelman og Pohley (1953). Α2,6-sialyltransfrease-manipulerte Per.C6 rfsh og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved forskjellige doser (3 rotter/dose).

14 14 / 14 Figur 13. Ovarivektøkning i henhold til metoden til Steelman og Pohley (1953). Parental Per.C6 rfsh, α2,6-sialyltransfrease-manipulerte Per.C6 rfsh og standarder (Gonal-f rfsh) ble undersøkt ved fem forskjellige doser (3 rotter/dose).