(12) PATENT (19) NO (11) (13) B1

Transkript

1 (12) PATENT (19) NO (11) (13) B1 NORGE (1) Int Cl. C07K 16/24 (06.01) A61K 39/39 (06.01) A61P 3/00 (06.01) A61P 37/00 (06.01) A61P 43/00 (06.01) C12N / (06.01) C12N 1/13 (06.01) Patentstyret (21) Søknadsnr 06 (86) Int.inng.dag og søknadsnr PCT/US01/2478 (22) Inng.dag (8) Videreføringsdag (24) Løpedag () Prioritet , US, , US, , US, 9137 (41) Alm.tilgj (4) Meddelt (73) Innehaver Janssen Biotech Inc, 800/80 Ridgevlew Drive, US-PA19044 HORSHAM, USA (72) Oppfinner Jill Giles-Komar, 31 Blakely Road, US-PA1933 DOWNINGTOWN, USA David M Knight, 24 Whitehorse Road, US-PA19312 BERWYN, USA Bernard Scallon, 139 Hemlock Drive, Collegeville, PA 19426, USA David Shealy, 131 Pennsridge Place, US-PA1933 DOWNINGTOWN, USA George Heavner, 6 Oak Glen Drive, Malvern, PA 193, USA (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 03 Vika, 012 OSLO, Norge (4) Benevnelse Humant anti-tnf-antistoff, isolert nukleinsyremolekyl, rekombinant vektor, vertcelleog sammensetning (6) Anførte publikasjoner (7) Sammendrag WO A1 US A MENDEZ MJ ET AL., "Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice" NATURE GENETICS (2): wo a STEPHENS S ET AL., "Comprehensive pharmacokinetics of a humanized antibody and analysis of residual anti-idiotypic responses" IMMUNOLOGY, 199, 8(4): SIEGEL SA ET AL., "The mouse/human chimeric monoclonal antibody ca2 neutralizes TNF in vitro and protects transgenic mice from cachexia and TNF lethality in vivo". CYTOKINE, 199, 7(1):1-2 Foreliggende oppfinnelse gjelder minst et nytt anti-tnf-antistoff og omfatter isolerte nukleinsyrer som koder for minst et anti-tnf-antistoff, TNF, vektorer, vertsceller, transgene dyr eller planter og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav.

2 1 Foreliggende oppfinnelse gjelder antistoffer, innbefattet spesifiserte deler eller varianter derav, som er spesifikke for minst et tumornekrosefaktor alfa (TNF)-protein eller et fragment derav, så vel som nukleinsyrer som koder for slike anti-tnf-antistoffer, komplementære nukleinsyrer, vektorer, vertsceller. TNF alfa er en løselig homotrimer bestående av proteinsubenheter på 17 kd (Smith et al., J. Biol. Chem. 262: (1987)). En membranbundet forløperform for TNF på 26 kd foreligger også (Kriegler et al., Cell 3:4-3 (1988)). For oversiktsartikler vedrørende TNF, se Beutler et al., Nature 3:84 (1986); Old, Science 2:6 (1986); og Le et al., Lab. Invest. 6:234 (1987). 1 Andre celler enn monocytter og makrofager danner også TNF alfa. For eksempel danner humane ikke-monocyttumorcellelinjer TNF alfa (Rubin et al., J. Exp. Med. 164:1 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:663 (1987)). CD4+ og CD8+ T- lymfocytter fra perifert blod og noen dyrkede T- og B-cellelinjer (Cuturi et al., J. Exp. Med. 16:181 (1987); Sung et al., J. Exp. Med. 168:139 (1988); Turner et al., Eur. J. Immunol. 17: (1987)) danner også TNF alfa. 2 TNF alfa forårsaker pro-inflammatoriske aktiviteter som fører til vevsskader, f.eks. degradering av brusk og ben (Saklatvala, Nature 322:47-49 (1986); Bertolini, Nature 319:16-18 (1986)), induksjon av adhesjonsmolekyler, induksjon av prokoagulantaktivitet på vaskulære endotelceller (Pober et al., J. Immunol. 136:1680 (1986)), økt adherens av neutrofile celler og lymfocytter (Pober et al., J. Immunol. 138:3319 (1987)), og stimulering av frigivning av blodplateaktiverende faktor fra makrofager, neutrofile celler og vaskulære endotelceller (Camussi et al., J. Exp. Med. 166:1390 (1987)). Nyere materialer viser forbindelser mellom TNF alfa og infeksjoner (Cerami et al., Immunol. Today 9:28 (1988)), immunforstyrrelser, neoplastiske sykdomstilstander (Oliff et al., Cell 0: (1987)), autoimmune sykdomstilstander og graf-versus-host - sykdomstilstander (Piguet et al., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). Forbindelsen mellom TNF alfa og kreft og infeksiøse sykdomstilstander er ofte forbundet med vertens katabolske tilstand. Kreftpasienter lider av vekttap, vanligvis forbundet med anoreksi. 3 Den omfattende uttæring som er forbundet med kreft og andre sykdommer betegnes kakeksi (Kern et al., J. Parent Enter. Nutr. 12: (1988)). Kakeksi induserer progressivt vekttap, anoreksi og vedvarende erosjon av ikke-fettvev i kroppen som re-

3 2 spons på en ondartet svulst. Kakeksitilstanden forårsaker mye sykelighet og dødelighet forbundet med kreft. Det finnes bevis for at TNF alfa deltar i kakeksi ved kreft, infeksiøse sykdomstilstander og andre katabolske tilstander (se f.eks. Beutler og Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7:62-6 (1989)) TNF alfa antas å spille en sentral rolle ved gram-negativ sepsis og endotoksisk sjokk (Michie et al., Br. J. Surg. 76: (1989); Debets et al., Second Vienna Shock Forum, s (1989); Simpson et al., Crit. Care Clin. :27-47 (1989)), innbefattet feber, utilpassethet, anoreksi og kakeksi. Endotoksin aktiverer kraftig monocytt/makrofagdannelsen og sekresjonen av TNF alfa og andre cytokiner (Kornbluth et al., J. Immunol. 137: (1986)). TNF alfa og andre monocyttavledede cytokiner formidler de metabolske og neurohormonale responser på endotoksin (Michie et al. New Engl. J. Med. 318: (1988)). Endotoksintilførsel til frivillige forsøkspersoner gir akutt sykdom med influensalignende symptomer, innbefattet feber, takykardi, økt metabolisme og frigivelse av stresshormon (Revhaug et al., Arch. Surg. 123: (1988)). TNF alfa-konsentrasjonen i sirkulasjonen øker hos pasienter som lider av Gram-negativ sepsis (Waage et al., Lancet 1:3-37 (1987); Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, s (1989); Debets et al., Crit. Care Med. 17: (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis. 161: (1990)). TNF alfa har således blitt vist å delta i inflammatoriske sykdommer, autoimmune sykdommer, virale, bakterielle og parasittiske infeksjoner, ondartede tilstander og/eller neurodegenerative sykdommer, og er et anvendbart mål for spesifikk biologisk behandling ved sykdommer som reumatoid artritt og Crohn s sykdom. Gunstige virkninger i åpne forsøk med et chimert monoklonalt antistoff mot TNF alfa (ca2) har blitt rapportert, med undertrykkelse av inflammasjonen og med vellykket bedring etter tilbakefall ved reumatoid artritt (Elliott et al., Arthritis Rheum. 36: (1993); og Elliott et al., Lancet 344: (1994)) og ved Crohn s sykdom (Van Dullemen et al., Gastroenterology 9: (199)). Gunstige resultater i et randomisert, dobbeltblindt, placebokontrollert forsøk med ca2 har også blitt rapportert ved reumatoid artritt, med undertrykkelse av inflammasjonen (Elliott et al., Lancet 344:1-11 (1994)). Antistoffer mot et modulator -materiale som ble karakterisert som cachectin (senere vist å være identisk med TNF) ble beskrevet av Cerami et al. (EPO patentskrift nr , 4. mars 1987). Slike antistoffer ble sagt å være anvendbare i diagnostiske immunanalyser og ved behandling av sjokk forbundet med bakterieinfeksjoner. Rubin et al. (EPO patentskrift nr , 22. april 1987) beskrev monoklonale antistoffer mot human TNF, hybridomene som utskilte slike antistoffer, fremgangsmåter for fremstilling av

4 3 slike antistoffer og anvendelse av slike anvendelse av slike antistoffer i immunanalyse av TNF. Yone et al. (EPO patentskrift nr , 26. oktober 1988) beskrev anti- TNF-antistoffer innbefattet mab, og deres anvendbarhet i immunanalyttisk diagnose av sykdomstilstander, nærmere bestemt Kawasaki s sykdom og bakterieinfeksjoner. Kroppsvæskene hos pasienter med Kawasaki s sykdom (infantilt akutt febrilt mukokutant lymfeknutesyndrom; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:93 (198)) ble sagt å inneholde forhøyet TNF-nivå som var forbundet med sykdommens utvikling (Yone et al., supra). 1 Andre forskere har beskrevet mab spesifikke for rekombinant humant TNF som hadde nøytraliserende aktivitet in vitro (Liang, C-M. et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6:-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: (1987); Bringman, T.S. et al., Hybridoma 6: (1987); Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96:7-62 (1987); Moller, A. et al., (Cytokine 2: (1990)). Noen av disse mab ble anvendt for kartlegging av epitoper i human TNF og utvikling av enzymimmunanalyser (Fendly et al., supra; Hirai et al., supra; Moller et al., supra) og som hjelp ved rensing av rekombinant TNF (Bringman et al., supra). Disse undersøkelsene ga imidlertid intet grunnlag for produksjon av TNF-nøytraliserende antistoffer som kan anvendes for in vivo diagnostiske eller -terapeutiske anvendelser i mennesker, grunnet immunogenisitet, manglende spesifisitet og/eller manglende farmasøytisk egnethet. 2 Nøytraliserende antisera eller mab mot TNF har hos pattedyr andre enn mennesker blitt vist å lindre uønskede fysiologiske endringer og forebygge dødsfall etter dødelig infeksjon ved eksperimentell endotoksemi og bakteriemi. Denne virkningen har f.eks. blitt påvist i gnagerdødelighetsanalyser og i primatbaserte sykdomsmodellsystemer (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81: (1988); Beutler, B. et al., Science 229: (198); Tracey, K.J. et al., Nature 3: (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17: (1988); Silva, A.T. et al., J. Infect. Dis. 162: (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161: (1990); Hinshaw, L.B. et al., Circ. Shock : (1990)). 3 Mulige reseptorbindingsloci i htnf har blitt beskrevet av Eck og Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), (1989), som påviste reseptorbindingsloci i TNF-a som besto av aminosyrene 11-13, 37-42, 49-7 og PCT patentsøknad WO91/078 (prioritetsdato 7. august 1989) beskriver TNF-ligander som kan bindes til monoklonale antistoffer med følgende epitoper: minst en av 1-, 6-77 og 8-127; minst to av 1-

5 4, 6-77, og ; alle av 1-18, 8-6, og ; alle av 1-18 og 8-128; alle av 6-79, og 13- eller 136-1; alle av 1-, og ; alle av 1-26, og ; alle av 22-40, eller -97, og ; alle av 12-22, 36-4, 96- og ; både 1- og 76-90; alle av 22-40, 69-97, -128 og 13-1; alle av og ; alle av og 49-98; minst en av 22-40, og og både og WO A beskriver antistoff som binder humant TNF-α og inhiberer effekter av cytokinet. Effekter av antistoffet er vist in vitro ved at det inhiberer TNF-α indusert cytotoksisitet og inhibering av binding mellom TNF-α og dens reseptor i U-937 celler. Det er også påvist in vivo at antistoffet også beskytter mot TNF-α indusert dødelighet i en leversviktmodell i mus. 1 US AA beskriver utvikling og bruk av monoklonalt humant og muse antistoff mot TNF-α. In vitro forsøk viser at antistoffet binder TNF-α (Figur 1-7). I celleforsøk er det videre vist at antistoffet inhiberer effekten av cytokinet (figur -12). 2 Antistoffer fra ikke-humane pattedyr, chimere antistoffer, polyklonale antistoffer (f.eks. antiserum) og/eller monoklonale antistoffer (Mab) og fragmenter av disse (f.eks. proteolyttiske spaltingsprodukter eller fusjonsproteinprodukter) er mulige terapeutiske midler som i noen tilfeller undersøkes i forsøk på å behandle visse sykdommer. Slike antistoffer eller fragmenter kan imidlertid utløse en immunrespons ved tilførsel til mennesker. En slik immunrespons kan føre til en immunkompleksformidlet fjerning av antistoffene eller fragmentene fra sirkulasjonen og gjøre gjentatt tilførsel uegnet for behandling, hvorved den terapeutiske nytte for pasienten reduseres og gjentatt tilførsel av antistoffet eller fragmentet begrenses. For eksempel kan gjentatt tilførsel av antistoffer eller fragmenter som omfatter ikke-humane deler føre til serumsyke og/eller anafalakse. For å unngå disse og andre problemer har en rekke tilnærminger blitt benyttet for å redusere immunogenisteten av slike antistoffer og deler av disse, innbefattet chimerisering og humanisering, som velkjent innen faget. Disse og andre tilnærminger kan imidlertid fortsatt føre til antistoffer eller fragmenter med en viss immunogenisitet, lav affinitet, lav aviditet eller med problemer i cellekultur, oppskallering eller produksjon, og/eller lavt utbytte. Slike antistoffer eller fragmenter kan således være mindre enn ideelt egnet for fremstilling eller anvendelse som terapeutiske proteiner. 3

6 Det foreligger følgelig et behov for tilveiebringelse av anti-tnf-antistoffer eller fragmenter derav som overvinner et eller flere av disse problemer, så vel som forbedringer sammenlignet med kjente antistoffer eller fragmenter derav. Foreliggende oppfinnelse omfatter humant anti-tnf-antistoff, kjennetegnet ved at det omfatter tungkjede komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) og variable rammeverksregioner (framework regions) (FR) fra mab TNV148 som beskrevet i Figur 4; og lettkjede CDR og variable FR fra mab TNV 148 som beskrevet i Figur ; som eventuelt ytterligere omfatter den spesifiserte substitusjonen fra prolin til serin i FR3 fra mab TNV148B som beskrevet i Figur Videre omfatter foreliggnede oppfinnelse isolert nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det omfatter et polynukleotid som koder for antistoffet i følge et hvilket som helst av de foregående kravene. Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også rekombinant vektor, kjenntegnet ved at den omfatter nukleinsyremolekylet i følge krav 3. Vertcelle, kjennetegnet ved at den omfatter nukleinsyremolekylet i følge krav 3 eller vektoren i følge krav 4 er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. 2 Foreliggende oppfinnelse omfatter også sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter antistoffet i følge krav 1 eller 2 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. 3 Det er også mulig å tilveiebringe isolerte anti-tnf-antistoffer fra primat, gnager, pattedyr, chimere anti-tnf-antistoffer, humaniserte anti-tnf-antistoffer og/eller CDRtransplanterte anti-tnf-antistoffer, immunoglobuliner, spaltingsprodukter og andre spesifiserte deler eller varianter av disse, så vel som anti-tnfantistoffsammensetninger, kodende eller komplementære nukleinsyrer, vektorer, vertsceller, sammensetninger, preparater, innretninger, transgene dyr, transgene planter og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse derav, som beskrevet og muliggjort heri, i kombinasjon med hva som er kjent innen faget. Videre er det mulig å tilveiebringe minst et isolert anti-tnf-antistoff som beskrevet heri. Et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et hvert protein- eller peptid-

7 6 holdig molekyl som omfatter minst en del av et immunglobulinmolekyl, f.eks., men ikke begrenset til, minst et komplementaritetsbestemmende område (CDR) fra en tungkjede eller lettkjede eller en ligandbindende del derav, et variabelt område fra en tungkjede eller lettkjede, et konstant område fra en tungkjede eller lettkjede, et rammeverksområde eller enhver del derav, som kan innføres i et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan omfatte eller være avledet fra et hvert pattedyr, f.eks., men ikke begrenset til, et menneske, en mus, en kanin, en rotte, en gnager, en primat eller enhver kombinasjon derav, og lignende. 1 Videre kan det tilveiebringes isolerte nukleinsyremolekyler som omfatter, er komplementære til eller hybridiserer til et polynukleotid som koder for spesifikke anti-tnfantistoffer, omfattende minst en angitt sekvens, et domene, en del eller en variant derav. Rekombinante vektorer som omfatter disse anti-tnf-antistoffkodende nukleinsyremolekylene, vertsceller som inneholder slike nukleinsyrer og/eller rekombinante vektorer, så vel som fremgangsmåter for fremstilling og/eller anvendelse av slike antistoffnukleinsyrer, vektorer og/eller vertsceller er videre mulig å tilveibringe. 2 Minst et antistoff ifølge oppfinnelsen bindes til minst en spesifisert epitop som er spesifikk for minst et TNF-protein eller en subenhet, et fragment eller en del derav, eller enhver kombinasjon av disse. Epitopen eller epitopene kan omfatte minst et antistoffbindende område som omfatter minst en del av proteinet, hvor epitopen fortrinnsvis omfatter fra minst 1- aminosyrer fra minst en del derav, f.eks., men ikke begrenset til, minst et funksjonelt, ekstracellulært, løselig, hydrofilt, eksternt eller cytoplasmatisk domene fra proteinet, eller enhver del derav. Antistoffet eller antistoffene kan om ønskelig omfatte minst en spesifisert del lav minst et komplementaritetsbestemmende område (CDR), (f.eks. CDR1, CDR2 eller CDR3 fra tungkjedens eller lettkjedens variable område) og/minst et konstant eller variabelt rammeverksområde eller enhver del derav. Antistoffaminosyresekvensen eller -sekvensene kan videre om ønskelig omfatte minst en spesifisert substitusjon, insersjon eller delesjon som beskrevet heri eller som kjent innen faget. 3 Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også minst et isolert anti-tnf-antistoff som beskrevet heri, hvori antistoffet har minst en aktivitet, f.eks., men ikke begrenset til, inhibering av TNF-induserte celleadhesjonsmolekyler, inhibering av TNF-binding til reseptor, artrittindeksforbedring i musemodeller (se f.eks. eksempel 3-7). Et anti-tnf-

8 7 antistoff kan således analyseres for en tilsvarende aktivitet ifølge kjente fremgangsmåter, f.eks., men ikke begrenset til, minst en biologisk aktivitet mot et TNF-protein. Det er videre mulig å tilveiebringee minst et TNF-anti-idiotypeantistoff rettet mot minst et TNF-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Anti-idiotypeantistoffet omfatter et hvert protein- eller peptidholdig molekyl som omfatter minst en del av et immunglobulinmolekyl, f.eks. men ikke begrenset til, minst et komplementaritetsbestemmende område (CDR) fra en tungkjede eller lettkjede eller en ligandbindende del derav, en tungkjedes eller lettkjedes variable område, en tungkjedes eller lettkjedes konstante område, et rammeverksområde eller enhver del derav, som kan innføres i et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan omfatte eller være avledet fra et hvert pattedyr, f.eks., men ikke begrenset til, et menneske, en mus, en kanin, en rotte, en gnager, en primat og lignende. 1 Foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringe isolerte nukleinsyremolekyler som omfatter, er komplementære til eller hybridiserer til et polynukleotid som koder for minst et TNFanti-idiotypeantistoff, innbefattet minst en spesifisert sekvens, et domene, en del eller en variant derav. Videre er det mulig å tilveibringe rekombinante vektorer som omfatter slike TNF-anti-idiotypeantistoffkodende nukleinsyremolekyler, vertsceller som inneholder slike nukleinsyrer og/eller rekombinante vektorer, så vel som fremgangsmåter for fremstilling og/eller anvendelse av slike anti-idiotypeantistoff-nukleinsyrer, vektorer og/eller vertsceller. 2 Det kan tilveiebringes minst en fremgangsmåte for ekspresjon av minst et anti-tnfantistoff, eller TNF-anti-idiotypeantistoff, i en vertscelle, som omfatter dyrking av en vertscelle som beskrevet heri under betingelser ved minst et anti-tnf-antistoff uttrykkes i påvisbare og/eller gjenvinnbare mengder. 3 Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer minst en sammensetning som omfatter (a) en isolert anti-tnf-antistoffkodende nukleinsyre og/eller et antistoff som beskrevet heri, og (b) et egnet bærestoff eller fortynningsmiddel. Bærestoffet eller fortynningsmidlet kan om ønskelig være farmasøytisk aksepterbart ifølge kjente bærestoffer eller fortynningsmidler. Sammensetningen kan om ønskelig videre omfatte minst en annen forbindelse, et protein eller en sammensetning. Også en minst en anti-tnf-antistoffbasert fremgangsmåte eller sammensetning for tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde for modulering eller behandling av minst en

9 8 TNF-forbundet tilstand i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, og/eller forut for, etter eller under en TNF-forbundet tilstand, som kjent innen faget og/eller som beskrevet heri er mulig å tilveibringe. Videre er det mulig å tilveiebringe minst en sammensetning, en innretning og/eller en fremgangsmåte for tilførsel av en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av minst et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Det kan også tilveiebringes minst en anti-tnf-antistoffbasert fremgangsmåte eller sammensetning for diagnose av minst en TNF-forbundet tilstand i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, og/eller, forut for, etter eller under en TNF-forbundet tilstand, som kjent innen faget og/eller som beskrevet heri. 1 Videre kan det tilveiebringes minst en sammensetning, innretning og/eller fremgangsmåte for diagnostisk tilførsel av minst et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. 2 3 Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser en analyse av evnen til TNV-mAb i hybridomcellesupernatanter til å inhibere TNF! til rekombinant TNF-reseptor. Varierende mengder hybridomcellesupernatant inneholdende kjente mengder TNV-mAb ble preinkubert med en fast konsentrasjon ( ng/ml) 12 I-merket TNF!. Blandingen ble overført til 96-brønners Optiplater som på forhånd var belagt med p-sf2, et rekombinant TNFreseptor/IgG-fusjonsprotein. Mengden TNF! som ble bundet til p-reseptoren i nærvær av de monoklonale antistoffer ble bestemt etter bortvasking av ubundet materiale og måling av radioaktivitet i en gamma-teller. Selv om åtte TNF-mAb-prøver ble analysert i disse eksperimentene viser for enkelthets skyld ikke tre mab som ble vist ved DNA-sekvensanalyse å være identisk med ett av de andre TNV-mAb her (se seksjon.2.2). Hver prøve ble analysert i duplikat. De viste resultater er representative for to uavhengige eksperimenter. Figur 2 viser DNA-sekvensen til variable områder fra tungkjeden i TNV-mAb. Kimcellelinjegenet som vises er DP-46-genet. TNV angir at sekvensen vist er sekvensen til TNV14, TNV1, TNV148 og TNV196. De første tre nukleotider til TNV-sekvensen definerer translasjonsinitierings-met-kodonet. Prikker i TNV-mAb-gensekvensene angir at nukleotidet er det samme som i kimcellelinjesekvensen. De første 19 nukleotidene (understrekede) i TNV-sekvensene tilsvarer oligonukleotidet som ble anvendt for PCRamplifisering av det variable området. En aminosyretranslasjon (enbokstavforkortelser)

10 9 med start ved det modne mab er vist kun for kimcellelinjegenet. De tre CDR-domener i aminosyretranslasjonen for kimcellelinjen er markert med uthevet skrift og understreket. Streker merket TNV148(B) angir at den viste sekvens gjelder både TNV148 og TNV148B. Gap i kimcellelinjens DNA-sekvens (CDR3) skyldes at sekvensen ikke er kjent eller ikke foreligger i kimcellelinjegenet. Tungkjedene i TNV-mAb benytter J6- koblingsområdet. 1 2 Figur 3 viser DNA-sekvenser for de variable områder i lettkjede fra TNV-mAb. Kimcellelinjegenet som vises er et representativt medlem av Vg/38K-familien av humane gener for kappavariabelt område fra kimcellelinjen. Prikker i TNV mab-gensekvensene angir at nukleotidet er det samme som i kimcellelinjesekvensen. De første 16 nukleotider (understreket) i TNV-sekvensene tilsvarer oligonukleotidet som ble anvendt for PCR-amplifisering av det variable området. En aminosyretranslasjon for det modne mab (enbokstavforkortelser) er kun vist for kimcellelinjegenet. De tre CDR-domener i aminosyretranslasjonen for kimcellelinjen er markert med uthevet skrift og understreket. Streker merket TNV148(B) angår at den viste sekvens gjelder både TNV148 og TNV148B. Gap i kimcellelinjens DNA-sekvens (CDR3) skyldes at sekvensen ikke er kjent eller ikke foreligger i kimcellelinjegenet. Lettkjedene i TNV-mAb benytter J3- koblingssekvensen. Figur 4 viser utledede aminosyresekvenser for tungkjedens variable områder i TNVmAb. De viste aminosyresekvenser (enbokstavforkortelser) ble utledet fra DNAsekvensen bestemt fra både uklonede PCR-produkter og klonede PCR-produkter. Aminosyresekvensene er vist oppdelt i den sekretoriske signalsekvens (signal), rammeverks- (FW) domener, og komplementaritetsbestemmende område (CDR)-domener. Aminosyresekvensen for DP-46-kimcellelinjegenet er vist i øvre linje for hvert domene. Prikker angir at aminosyresekvensen i TNV-mAb er identisk med kimcellelinjegenet. TNV148(B) angir at den viste sekvens gjelder både TNV148 og TNV148B. TNVs angir at den viste sekvens gjelder alle TNV-mAb med mindre en annen sekvens er vist. Streker i kimcellelinjesekvensen (CDR3) angir at sekvensene ikke er kjent eller ikke foreligger i kimcellelinjegenet. 3 Figur viser utledede aminosyresekvenser for de variable områder fra lettkjeden i TNV-mAb. De viste aminosyresekvenser (enbokstavforkortelser) ble utledet fra DNAsekvensen bestemt fra både ikke-klonede PCR-produkter og klonede PCR-produkter. Aminosyresekvensene vises inndelt i den sekretoriske signalsekvens (signal), rammeverks (FW)-domener og komplementaritetsbestemmende område (CDR)-domener.

11 Aminosyresekvensen for kimcellelinjens lettkjedegen av Vg/38K-type er vist i øvre linje for hvert domene. Prikker angir at aminosyren i TNV-mAb er identisk med aminosyren i kimcellelinjegenet. TNV148(B) angir at den viste sekvens gjelder både TNV148 og TNV148B. Alle angir at den viste sekvens gjelder TNV14, TNV1, TNV148, TNV148B og TNV Figur 6 viser skjematiske illustrasjoner av tung- og lettkjedeekspresjonsplasmidene som ble anvendt for fremstilling av de rtnv148b-uttrykkende C466-celler. p1783 er tungkjedeplasmidet og p1776 er lettkjedeplasmidet. Domenene i rtnv148b som koder for variabelt og konstant område er vist som sorte bokser. Immunglobulinenhancerene i J- C-intronene er vist som grå bokser. Relevante restriksjonsseter er vist. Plasmidene er vist orientert slik at transkripsjonen av Ab-genene forløper med klokken. Plasmid p1783 er 19,3 kb langt, og plasmid p1776 er 1,06 kb langt. Den fullstendige nukleotidsekvens til begge plasmider er kjent. Sekvensen som koder for variabelt område i p1783 kan lett erstattes med en annen variabel områdesekvens fra tungkjede ved å erstatte BsiWI/BstBI-restriksjonsfragmentet. Sekvensen som koder for variabelt område i p1776 kan erstattes med en annen varibel områdesekvens ved å erstatte SalI/AflIIrestriksjonsfragmentet. 2 3 Figur 7 viser en grafisk fremstilling av vekstkurveanalyser for fem rtnv148bproduserende cellelinjer. Kulturene ble startet på dag 0 ved å utså celler i T7-flasker i IQ+MHX-medium til en tetthet av levedyktige celler på 1,0 x celler/ml i et volum på ml. Cellekulturene som ble anvendt for disse undersøkelsene hadde vært i kontinuerlig kultur siden transfeksjoner og subkloninger ble utført. På de påfølgende dager ble cellene i T-flaskene grundig resuspendert, og det ble tatt et uttak på 0,3 ml av kulturen. Vekstkurveundersøkelsene ble avsluttet når celletallet fallt til under 1, x celler/ml. Antall levende celler i uttaket ble bestemt ved typanblåtteksklusjon, og resten av uttaket ble lagret for senere mab-konsentrasjonsbestemmelse. En ELISA for humant IgG ble utført for alle uttak samtidig. Figur 8 viser en grafisk fremstilling av sammenligningen av celleveksthastigheten i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av MHX. Cellesubklonene C466A og C466B ble opptint i MHX-fritt medium (IMDM. % FBS, 2 mm glutamin) og dyrket i ytterligere to dager. Hver av cellekulturene ble så oppdelt i tre kulturer som inneholdt enten intet MHX, 0,2 x MHX eller 1 x MHX. En dag senere ble kulturene utsådd i nye T7- flasker ved en utgangstetthet på 1 x celler/ml, og cellene ble talt med 24 timers mel-

12 11 lomrom i 1 uke. Doblingstiden under de første fem dager ble beregnet ved anvendelse av formelen i SOP PD32.02, og er vist supra søylene. Figur 9 viser grafiske fremstillinger av stabiliteten av mab produksjonen over tid fra to rtnv148b-produserende cellelinjer. Cellesubkloner som hadde vært i kontinuerlig kultur siden transfeksjoner og subkloninger ble utført ble anvendt for start av langtidsseriekulturer i 24-brønners dyrkningsskåler. Cellene ble dyrket i IQ-medium med og uten MHX-seleksjon. Cellene ble passert kontinuerlig ved å splitte kulturene hver 4. til 6. dag for opprettholdelse av nye levedyktige kulturer, mens tidligere kulturer fikk vokse videre. Uttak av supernatanter fra utvokste celler ble oppsamlet kort tid etter at kulturene var utvokst og lagret inntil mab-konsentrasjonene ble bestemt. En ELISA for humant IgG ble utført på alle prøveuttak samtidig Figur viser vektsendringer hos Tg 197-mus, en musemodell for artritt, som respons på anti-tnf-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, sammenlignet med kontroller i eksempel 4. Ved en alder på tilnærmet 4 uker ble de anvendte Tg197-mus ut fra kjønn og kroppsvekt fordelt på 9 behandlingsgrupper og behandlet med en enkelt, intraperitoneal bolusdose av Dulbecco s PBS (D-PBS) eller et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse (TNV14, TNV148 eller TNV196) enten ved 1 mg/kg eller mg/kg. Når vekten ble analysert som endring fra vekten før doseringen, viste dyrene behandlet med mg/kg ca2 konsistent høyere vektsøkning i de D-PBS-behandlede dyr gjennom hele undersøkelsen. Denne vektøktningen var signifikant i ukene 3-7. Dyrene som ble behandlet med mg/kg TNV148 oppnådde også en signifikant vektsøkning på undersøkelsens uke 7. Figurene 11A-C viser forløpet av sykdomsomfanget basert på artrittindeksen, som presentert i eksempel 4. Artrittindeksen for gruppen behandlet med mg/kg ca2 var lavere enn for D-PBS-kontrollgruppen med start i uke 3, og dette fortsatte gjennom resten av undersøkelsen (uke 7). Dyrene behandlet med 1 mg/kg TNV14 og dyrene behandlet med 1 mg/kg ca2 viste ingen signifikant reduksjon i AI etter uke 3, sammenlignet med den D-PBS-behandlede gruppen. Det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppene behandlet med mg/kg når hver av disse ble sammenlignet med de andre gruppene med tilsvarende dose ( mg/kg ca2 sammenlignet med mg/kg TNV14, 148 og 196). Ved sammenligning av gruppene behandlet med 1 mg/kg viste gruppen med 1 mg/kg TNV148 signifikant lavere AI enn gruppen behandlet med 1 mg/kg ca2 i uke 3, 4 og 7. Gruppen behandlet med 1 mg/kg TNV148 var også signifikant lavere enn gruppen behandlet med 1 mg/kg TNV14 i uke 3 og 4. Selv om TNV196 viste signifikant

13 12 reduksjon i AI opp til undersøkelsens uke 6 (ved sammenligning med den D-PBSbehandlede gruppe), var TNV148 den eneste behandling med 1 mg/kg som forble signifikant ved undersøkelsens avslutning. Figur 12 viser vektsendringer hos Tg 197-mus, en artrittmodell i mus, som respons på anti-tnf-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, sammenlignet med kontroller i eksempel. I en alder på tilnærmet 4 uker ble de benyttede Tg197-mus basert på kroppsvekt fordelt på en av 8 behandlingsgrupper og behandlet med en intraperitoneal bolusdose av kontrollmaterialet (D-PBS) eller antistoff (TNV14, TNV148) i en dose på 3 mg/kg (uke 0). Injeksjonene ble gjentatt for alle dyr i uke 1, 2, 3 og 4. Gruppe 1-6 ble evaluert for virkning av analyseforbindelse. Serumprøver erholdt fra dyrene i gruppe 7 og 8 ble evaluert for immunresponsinduksjon og farmakokinetisk fjerning av TNV14 eller TNV148 i ukene 2, 3 og Figurene 13A-C er kurver som viser forløpet av sykdomsomfang i eksempel basert på artrittindeksen. Artrittindeksen i gruppen behandlet med mg/kg ca2 var signifikant lavere enn for D-PBS-kontrollgruppen med start i uke 2, og dette fortsatte gjennom resten av undersøkelsen (uke ). Dyrene behandlet med 1 mg/kg eller 3 mg/kg ca2 og dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV14 oppnådde ingen signifikant reduksjon i AI på noe tidspunkt i undersøkelsen, sammenlignet med d-pbs-kontrollgruppen. Dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV148 viste en signifikant reduksjon sammenlignet med den d- PBS-behandlede gruppe med start i uke 3, og dette fortsatte gjennom uke. Dyrene behandlet med mg/kg ca2 viste en signifikant reduksjon i AI sammenlignet med de to lavere dosene (1 mg/kg og 3 mg/kg) av ca2 i undersøkelsens uke 4 og, og var også signifikant lavere enn for de TNV14-behandlede dyr i uke 3-. Selv om det ikke så ut til å være signifikante forskjeller mellom noen av gruppene behandlet med 3 mg/kg var AI for dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV14 signifikant høyere på noen tidspunkter enn gruppene behandlet med mg/kg, mens dyrene behandlet med TNV148 ikke var signifikant forskjellige fra dyrene behandlet med mg/kg ca2. Figur 14 viser vektsendringer hos Tg 197-mus en musemodell for artritt, som respons på anti-tnf-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse sammenlignet med kontroller i eksempel 6. I en alder på tilnærmet 4 uker ble Tg197-musene basert på kjønn og kroppsvekt fordelt på en av 6 behandlingsgrupper og behandlet med en enkelt, intraperitoneal bolusdose av antistoff (ca2 eller TNV148), enten ved 3 mg/kg eller mg/kg. Denne undersøkelsen benyttet D-PBS-kontrollgruppen og mg/kg ca2- kontrollgruppen.

14 13 Figur 1 viser forløpet av sykdomsomfanget basert på artrittindeksen som vist i eksempel 6. Alle behandlingsgrupper viste en viss beskyttelse på tidlige tidspunkter, hvor gruppene behandlet med mg/kg ca2 og mg/kg TNV148 viste signifikant reduksjon i AI i uke 1-3 og alle behandlingsgrupper viste signifikant reduksjon i uke 2. Senere i undersøkelsen viste dyrene behandlet med mg/kg ca2 en viss beskyttelse, med signifikant reduksjon i uke 4, 6 og 7. Den lave dose (3 mg/kg) av både ca2 og TNV148 viste signifikant reduksjon i uke 6 og alle behandlingsgrupper viste signifikant reduksjon i uke 7. Ingen av behandlingsgruppene kunne vedlikeholde en signifikant reduksjon ved undersøkelsens avslutning (uke 8). Det var ingen signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene (bortsett fra saltvannskontrollgruppen) på noe tidspunkt. 1 Det kan tilveiebringes isolerte, rekombinante og/eller syntetiske anti-tnf-antistoffer fra menneske, primat, gnager og pattedyr, chimere anti-tnf-antistoffer, humaniserte anti- TNF-antistoffer og CDR-transplanterte anti-tnf-antistoffer og TNF-anti-idiotype antistoffer, så vel som sammensetninger og kodende nukleinsyremolekyler som omfatter minst en polynukleotid som koder for minst et anti-tnf-antistoff eller -anti-idiotype antistoff. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre, men er ikke begrenset til, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av slike nukleinsyrer, antistoffer og antiidiotype antistoffer, innbefatter diagnostiske og terapeutiske sammensetninger, fremgangsmåter og innretninger. 2 3 Som anvendt heri omfatter et anti-tumornekrosefaktor alfa-antistoff, anti-tnfantistoff, anti-tnf-antistoffdel, eller anti-tnf-antistoffragment og/eller anti- TNF-antistoffvariant og lignende et hvert protein- eller peptidholdig molekyl som omfatter minst en del av et immunglobulinmolekyl, for eksempel, men ikke begrenset til, minst et komplementaritetsbestemmende område (CDR) fra en tungkjede eller lettkjede eller en ligandbindende del derav, en tungkjedes eller lettkjedes variable område, en tungkjedes eller lettkjedes konstante område, et rammeverksområde eller enhver del derav, eller minst en del av en TNF-reseptor eller et TNF-bindende protein som kan innføres i et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Et slikt antistoff påvirker videre om ønskelig en spesifikk ligand, f.eks., men ikke begrenset til tilfeller hvor et slikt antistoff modulerer, reduserer, forhøyer, antagoniserer, agoniserer, fremmer, lindrer, blokkerer, inhiberer, fjerner og/eller interfererer med minst en TNF-aktivitet eller -binding, eller med TNF-reseptoraktivitet eller -binding in vitro, in situ og/eller in vivo. Som et ikke-begrensende eksempel kan et egnet anti-tnf-antistoff eller en spesifisert del eller variant derav ifølge foreliggende oppfinnelse, bindes til minst et TNF eller spesifiserte

15 14 1 deler, varianter eller domener derav. Et egnet anti-tnf-antistoff, eller en spesifisert del eller variant derav, kan også om ønskelig påvirke minst en TNF-aktivitet eller -funksjon, f.eks., men ikke begrenset til, RNA-, DNA- eller proteinsyntese, TNFfrigivning, TNF-reseptorsignallisering, spalting av TNF i membranen, TNF-aktivitet, TNF-produksjon og/eller TNF-syntese. Begrepet antistoff er videre ment å omfatte antistoffer, spaltningsfragmenter, spesifiserte deler og varianter derav, innbefattet antistoffetterlignende forbindelser, eller omfattende deler av antistoffer som etterligner struktur og/eller funksjon av et antistoff eller et spesifisert fragment eller en del derav, innbefattet enkeltkjedede antistoffer og fragmenter av disse. Funksjonelle fragmenter omfatter antigenbindende fragmenter som bindes til TNF fra et pattedyr. For eksempel, omfattes antistoffragmenter som bindes til TNF eller deler derav, innbefattet, men ikke begrenset til, Fab (f.eks. ved papainspalting), Fab (f.eks. ved pepsinspalting og delvis reduksjon) og F(ab ) 2 (f.eks. ved pepsinspalting), facb (f.eks. ved plasminspalting), pfc (f.eks. ved spalting med pepsin eller plasmin), Fd (f.eks. ved pepsinspalting, delvis reduksjon og reaggregering), Fv eller scfv (f.eks. ved molekylærbiologiske teknikker) av oppfinnelsen (se f.eks. Colligan, Immunology, supra). 2 Slike fragmenter kan dannes ved enzymatisk spalting eller syntetiske eller rekombinante teknikker, som kjent innen faget og/eller som beskrevet heri. Antistoffer kan også fremstilles i en rekke avkortede former ved anvendelse av antistoffgener hvori ett eller flere stoppkodoner har blitt innført oppstrøms for det naturlige stoppsetet. For eksempel kan et kombinasjonsgen som koder for en del av en F(ab ) 2 -tungkjede utformes slik at det omfatter DNA-sekvenser som koder for CH 1 -domenet og/eller hengselområdet i tungkjeden. De forskjellige antistoffdelene kan kobles sammen kjemisk ved konvensjonelle teknikker, eller de kan fremstilles som et kontinuerlig protein ved anvendelse av teknikker for genetisk modifisering. 3 Som anvendt heri viser begrepet humant antistoff til et antistoff i hvilket idet vesentlige hver del av proteinet (f.eks. CDR-domener, rammeverksdomener, C L -domener, C H - domener (f.eks. C H 1, C H 2, C H 3), hengeseldomene (V L, V H )) er idet vesentlige ikkeimmunogene i mennesker, med kun mindre sekvensendringer eller variasjoner. På tilsvarende måte betegner antistoffer som angis å være fra primater (aper, bavian, sjimpanse, osv.), gnager (mus, rotte, kanin, marsvin, hamster og lignende) og andre pattedyrantistoffer som er spesifikke for slike arter, subslekter, slekter, subfamilier og familier. Videre omfatter chimere antistoffer enhver kombinasjon av de ovenfor nevnte antistoffer. Slike endringer eller variasjoner vil om ønskelig og fortrinnsvis bibeholde eller redusere immunogenisiteten i mennesker eller andre arter relativt til ikke-modifiserte

16 1 1 2 antistoffer. Et humant antistoff er således forskjellig fra et chimert eller humanisert antistoff. Det bør understrekes at et humant antistoff kan dannes av et ikke-humant dyr eller en prokaryot eller eukaryot celle som kan uttrykke funksjonelt rearrangerte humane immunglobulingener (f.eks. tungkjede- og/eller lettkjedegener). Dersom et humant antistoff er et enkeltkjedet antistoff kan det videre omfatte et linkerpeptid som ikke finnes i native humane antistoffer. Et Fv kan f.eks. omfatte et linkerpeptid, f.eks. fra to til tilnærmet åtte glycinrester eller andre aminosyrerester, som binder det variable området fra tungkjeden sammen med det variable området fra lettkjeden. Slike linkerpeptider anses å være av humant opphav. Bispesifikke antistoffer, heterospesifikke antistoffer, heterokonjugerte antistoffer eller tilsvarende antistoffer kan også anvendes, og dette er monoklonale, fortrinnsvis humane eller humaniserte, antistoffer som har bindingsspesifisitet for minst to forskjellige antigener. I det foreliggende tilfellet er en av bindingsspesifisiteten for minst et TNFprotein, mens den andre er for et hvilket som helst antigen. Fremgangsmåter for fremstilling av bispesifikke antistoffer er kjente innen faget. Tradisjonelt bygger rekombinant fremstilling av bispesifikke antistoffer på samtidig ekspresjon av to immunglobulin-tungkjede-lettkjedepar, hvor de to tungkjeder har forskjellig spesifisitet (Milstein og Cuello, Nature :37 (1983)). Grunnet tilfeldig fordeling av immunglobulintungkjeder og -lettkjeder danner disse hybridomene (kvadromer) en mulig blanding av forskjellige antistoffmolekyler, av hvilket kun ett har den korrekte bispesifikke struktur. Rensing av det korrekte molekyl, noe som vanligvis utføres ved affinitetskromatografitrinn, er relativt komplisert, og produktutbyttet er lavt. Tilsvarende fremgangsmåter beskrives f.eks. i WO 93/08829, US patentskrifter nr , , , 66833, , , 60902, 989, 99084, 99083, , 83398, , , 64379, , 82996, 49649, , WO 91/00360, WO 92/00373, EP 089, Traunecker et al., EMBO J. :36 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:2 (1986). 3 Anti-TNF-antistoffer (også betegnet TNF-antistoffer) som er anvendbare i fremgangsmåtene og sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan om ønskelig særpreges ved høyaffinitetsbinding til TNF, og om ønskelig og fortrinnsvis ved lav toksisitet. Nærmere bestemt er et antistoff eller et spesifisert fragment eller en variant ifølge oppfinnelsen hvori de enkelte bestanddeler, f.eks. det variable området, det konstante området og rammeverksområdet, hver for seg og/eller under ett, om ønskelig og fortrinnsvis, besitter lav immunogenisitet anvendbart i foreliggende oppfinnelse. Antistoffene som kan anvendes i oppfinnelsen er om ønskelig karakterisert ved deres evne til å behandle

17 16 pasienter over lengre tidsrom ved målbar lindring av symptomer og lav og/eller aksepterbar toksisitet. Lav eller aksepterbar immunogenisitet og/eller høy affinitet så vel som andre egnede egenskaper kan bidra til de oppnådde terapeutiske resultater. Lav immunogenisitet defineres heri som utløsning av signifikante HAHA-, HACA- eller HAMAresponser i mindre enn tilnærmet 7%, eller fortrinnsvis mindre enn tilnærmet 0%, av de behandlede pasienter, og/eller utløsning av lave titere i den behandlede pasient (mindre enn tilnærmet 0, fortrinnsvis mindre enn tilnærmet 0, målt med en dobbelt antigen-enzymimmunanalyse (Elliott et al., Lancet 344: (1994). 1 Anvendbarhet De isolerte nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for fremstilling av minst et anti-tnf-antistoff eller en spesifisert variant derav, som kan anvendes for å måle eller oppnå i en celle, et vev, et organ eller et dyr (innbefattet pattedyr og mennesker), å diagnostisere, måle, modulere, behandle, lindre, bidra til å forhindre forekomst av eller redusere symptomene på minst en TNF-tilstand utvalgt blant, men ikke begrenset til, minst en immunforstyrrelse eller -sykdom, en kardiovaskulær forstyrrelse eller sykdom, en infeksiøs, ondartet og/eller neurologisk forstyrrelse eller sykdom. 2 En slik fremgangsmåte kan omfatte tilførsel av en effektiv mengde av en sammensetning eller et farmasøytisk preparat som omfatter minst et anti-tnf-antistoff til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling, lindring, forebyggelse eller reduksjon av symptomer, virkninger eller mekanismer. Den effektive mengde kan omfatte en mengde på fra tilnærmet 0,001 til 00 mg/kg pr. enkeltvise (f.eks. bolus), multippel eller kontinuerlig tilførsel, eller for oppnåelse av en serumkonsentrasjon på fra 0,01 til 000 μg/ml serum pr. enkeltvise, multiple eller kontinuerlige tilførsel, eller et hvert effektivt område eller enhver verdi deri, som utført og bestemt ved anvendelse av kjente fremgangsmåter som beskrevet heri eller som kjent innen de relevante fag. 3 Siteringer Alle publikasjoner eller patenter som siteres viser teknikkens stand på foreliggende oppfinnelses tidspunkt og/eller gir en beskrivelse og muliggjørelse av foreliggende oppfinnelse. Publikasjoner viser til enhver vitenskapelig publikasjon eller patentpublikasjon, eller enhver annen informasjon som er tilgjengelig i et hvert format, innbefattet alle innspilte elektroniske eller trykte formater. Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, NY (1989); Har-

18 17 low og Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). 1 Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse Minst et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan om ønskelig fremstilles fra en cellelinje, en blandet cellelinje, en immortalisert celle eller en klonal populasjon av immortaliserte celler, som er velkjent innen faget. Se f.eks. Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY ( ); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow og Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., red., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY ( ); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ). Humane antistoffer som er spesifikke for humane TNF-proteiner eller fragmenter av disse kan frembringes mot et egnet immunogent antigen, f.eks. et isolert TNF-protein eller en del av denne (innbefattet syntetiske molekyler, f.eks. syntetiske peptider). Andre spesifikke eller generelle pattedyrsantistoffer kan frembringes på tilsvarende måte. Fremstilling av immunogene antigener og produksjon av monoklonalt antistoff kan oppnås ved anvendelse av enhver egnet teknikk. 2 3 I en tilnærming dannes en hybridom ved å fusjonere en egnet, immortalisert cellelinje (f.eks. en myelomcellelinje, f.eks., men ikke begrenset til, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L., >243, P3X63Ag8.63, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-62, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, eller lignende, eller heteromyelomer, fusjonsprodukter derav eller enhver celle eller fusjonert celle avledet derfra, eller enhver annet egnet cellelinje som er kjent innen faget. Se f.eks. og lignende, til antistoffproduserende celler, f.eks., men ikke begrenset til, isolerte eller klonede miltceller, celler fra perifert blod, lymfeceller, tonsillceller eller andre immunceller eller B-celleholdige celler, eller hvilke som helst andre celler som uttrykker konstante eller variable tung- eller lettkjedeområder, rammeverksområder eller CDR-sekvenser, enten som endogen eller heterolog nukleinsyre, som rekombinant eller endogent DNA, viralt DNA, bakterielt DNA, alge-dna, prokaryot DNA, amfibie-dna, insekt-dna, reptil-dna, fiske-dna, pattedyrs-dna, gna-

19 18 ger-dna, heste-dna, saue-dna, geite-dna, saue-dna, primat-dna, eukaryot DNA, genomisk DNA, cdna, rdna, mitokondrielt DNA eller RNA, kloroplast-dna eller RNA, hnrna, mrna, trna, enkelttrådet, dobbelttrådet eller trippeltrådet, hybridisert og lignende, eller en hver kombinasjon derav. Se f.eks. Ausubel, supra, og Colligan, Immunology, supra, kapittel 2. 1 Antistoffproduserende celler kan også erholdes fra perifert blod eller, fortrinnsvis, milt eller lymfeknuter, fra mennesker eller andre egnede dyr som har blitt immunisert med antigenet av interesse. Enhver annen egnet vertscelle kan også anvendes for ekspresjon av heterolog eller endogen nukleinsyre som koder for et antistoff eller et spesifisert fragment eller en variant derav ifølge foreliggende oppfinnelse. De fusjonerte cellene (hybridomer) eller de rekombinante cellene kan isoleres ved anvendelse av selektive dyrkningsbetingelser eller andre egnede, kjente fremgangsmåter, og klones ved begrensende fortynning, cellesortering eller andre kjente fremgangsmåter. Celler som danner antistoffer med den ønskede spesifisitet kan utvelges ved en egnet analyse (f.eks. ELISA). 2 3 Andre egnede fremgangsmåter for fremstilling eller isolering av antistoffer med den ønskede spesifisitet kan anvendes, innbefattet, men ikke begrenset til, fremgangsmåter som selekterer rekombinant antistoff fra et peptid- eller proteinbibliotek (f.eks., men ikke begrenset til, et bakteriofagfremvisningsbibliotek, et ribosomfremvisningsbibliotek, et oligonukleotidbibliotek, et RNA-bibliotek, et cdna-bibliotek eller lignende, f.eks. som tilgjengelig fra Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, England; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Skottland, UK; BioInvent, Lund, Sverige; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Bergeley, CA; Ixsys. Se f.eks. EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/017; PCT/GB92/002240, PCT/GB92/00883; PCT/GB93/0060; US 08/260(/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/0183; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/144; PCT/US94/1234; WO92/18619, WO96/0774; (Scripps); EP (MorphoSys); WO9/16027 (BioInvent); WO88/066; WO90/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP ; EP 0 400; (Xoma); EP ; PCT/US91/07149 (Ixsys); eller stokastisk fremstilte peptider eller proteiner - U.S. patentskrifter nr , , , , 82414, , WO 86/0803, EP (Ixsys, nå Applied Molecular Evolution (AME)) eller som bygger på immunisering av transgene dyr (f.eks. SCID-mus, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:9-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: (1998), så vel som beslektede patenter og

20 19 patensøknder) som kan danne et repertoar av humane antistoffer som kjent innen faget og/eller som beskrevet heri. Slke teknikker omfatter, men er ikke begrenset til, ribosomfremvisning (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: (Mai 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9: (november 1998)); teknologier for produksjon av antistoff fra enkeltceller (f.eks. selektert lymfocyttantistofffremgangsmåten ( SLAM ) (US patentskrift nr.,627,02, Wen et al., J. Immunol. 17: (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: (1996); gelmikrodråper og flow -cytometri (Powell et al., Biotechnol. 8: (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:1-163 (199); Kenny et al., Bio/Technol. 13: (199)); B-celleseleksjon (Steensbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: (1994); Jonak et al., Progress Biotech, bind., In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, red., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Nederland (1988)) Fremgangsmåter for modifisering eller humanisering av ikke-humane eller humane antistoffer kan også anvendes og er velkjente innen faget. Generelt har et humanisert eller modifisert antistoff en eller flere aminosyrerester fra en kilde som er ikke-human, f.eks., men ikke begrenset til, mus, rotte, kanin, ikke-human primat eller et annet pattedyr. Disse humane aminosyrerestene betegnes ofte import -rester, som typisk tas fra et variabelt, konstant eller et annet import -domene fra en kjent human sekvens. Kjente humane Ig-sekvenser beskrives f.eks. hos: mcb.harvard.edu/biolinks/immunology.html; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;

21 ww.m.ehime-u-ac.jp/~yasuhito/elisa.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/~rek/aepstart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; imgt.cnusc.fr:84/; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Depth. Health (1983). 3 Slike importerte sekvenser kan anvendes for å redusere immunogenisiteten eller redusere, forsterke eller modifisere binding, affinitet, påhastighet, avhastighet, aviditet, spesifisitet, halveringstid eller enhver annen egnet egenskap, som kjent innen faget. Generelt beholdes deler av eller hele de ikke-humane eller human CDR-sekvenser, mens de ikkehumane sekvensene i de variable og konstante områder erstattes med humane aminosyrer eller andre aminosyrer. Antistoffer kan også om ønskelig humaniseres med bibeholdelse av høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette mål kan humaniserte antistoffer om ønskelig fremstilles ved en prosess som omfatter analyse av utgangssekvensene og forskjellige teoretiske humaniserte produkter

22 21 1 ved anvendelse av tredimensjonale modeller av utgangssekvensene og de humaniserte sekvenser. Tredimensjonelle immunglobulinmodeller er vanlig tilgjengelige og er velkjente blant fagfolk. Datamaskinprogrammer som illustrerer og fremviser mulige tredimensjonale konformasjonsstrukturer av utvalgte immunglobulinsekvenskandidater er tilgjengelige. En undersøkelse av de viste sekvenser tillater analyse av aminosyrerestenes sannsynlige rolle i funksjonen av immunglobulinsekvenskandidaten, dvs. analyse av aminosyrerester som påvirker immunglobulinkandidatens evne til å binde sitt antigen. På denne måte kan FR-aminosyrerester utvelges og kombineres fra konsensussekvenser og importsekvenser slik at den ønskede antistoffegenskap, f.eks. forhøyet affinitet overfor målantigenet eller -antigenene, oppnås. Generelt har CDR-aminosyrerestene mest direkte og mest vesentlig innflytelse på antigenbindingen. Humanisering eller modifisering av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres ved anvendelse av enhver kjent fremgangsmåte, f.eks., men ikke begrenset til, fremgangsmåtene beskrevet i Winter (Jones et al., Nature 321:22 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:134 (1988), Sims et al., J. Immunol. 11:2296 (1993); Chothia og Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:428 (1992); Presta et al., J. Immunol. 11:2623 (1993), US patentskrifter nr , , 82414, , , , , , 71432, 64023, , , 1, 8089, 2239, , PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/096, US91/0939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/017; WO90/14443, WO90/14424, WO90/144, EP Anti-TNF-antistoffet kan også om ønskelig frembringes ved immunisering av et transgent dyr (f.eks. en mus, rotte, hamster, ikke-menneskelig primat og lignende) som kan danne et repertoar av humane antistoffer som beskrevet heri og/eller som kjent innen faget. Celler som danner et humant anti-tnf-antistoff kan isoleres fra slike dyr og immortaliseres ved anvendelse av egnede fremgangsmåter, f.eks. fremgangsmåtene som beskrives heri. 3 Transgene mus som kan danne et repertoar av humane antistoffer som bindes til humane antigener kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter (f.eks., men ikke begrenset til, U.S. patentskrifter nr.,770,428,,69,82,,4,806,,62,126,,62,82,,63342,,661,016 og,789,60 tildelt Lonberg et al; Jakobovits et al., WO 98/0433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/1382, Lonberg et al. WO94/28, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP B1, Kucherlapate et al. EP A1, Surani et al. US patentskrift nr.,4,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP B1,

23 22 Lonberg et al. EP A2, Lonberg et al. GB A, Lonberg et al. Nature 368:86-89 (1994), Taylor et al. Int. Immunol. 6(4)79-91 (1994), Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al. Nature Genetics 1: (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research (23): (1992), Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(8) (1993), Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(1):6-93 (199) og Fishwald et al., Nat. Biotechnol. 14(7):84-81 (1996)). Generelt omfatter disse musene minst et transgen som omfatter DNA fra minst et humant immunglobulinlokus som er funksjonelt rearrangert eller som kan gjennomgå funksjonell rearrangering. De endogene immunglobulinloki i slike mus kan være oppbrudt eller delert for å fjerne dyrets evne til å danne antistoffer som kodes av endogene gener Analyse av antistoffer for spesifikk binding til lignende proteiner eller fragmenter kan med fordel oppnås ved anvendelse av peptidfremvisningsbiblioteker. Denne fremgangsmåten omfatter gjennomsøking av store samlinger av peptider etter enkeltmedlemmer med den ønskede funksjon eller struktur. Antistoffanalyse av peptidfremvisningsbiblioteker er velkjente innen faget. De fremviste peptidsekvensene kan være fra 3 til 000 eller flere aminosyre lange, hyppig fra til 0 aminosyrer lange og ofte fra tilnærmet 8 til 2 aminosyrer lange. I tillegg til direkte kjemiske syntesefremgangsmåter for dannelse av peptidbiblioteker har flere rekombinant DNA-fremgangsmåter blitt beskrevet. En type omfatter fremvisning av en peptidsekvens på overflaten av en bakteriofag eller celle. Hver bakteriofag eller celle inneholder nukleotidsekvensen som koder for den fremviste peptidsekvens. Slike fremgangsmåter beskrives i PCT patentskrift nr. 91/17271, 91/18980, 91/19818 og 93/ Andre systemer for dannelse av peptidbiblioteker omfatter både in vitro kjemisk syntese og rekombinante fremgangsmåter. Se PCT patentskrift nr. 92/028, 92/14843 og 96/1926. Se også U.S. patentskrifter nr.,68,74 og,643,768. Peptidfremvisningsbiblioteker, vektorer og analysesett er kommersielt tilgjengelige fra leverandører som Invitrogen (Carlsbad, CA) og Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Se f.eks. U.S. patentskrifter nr , , , 2603, 40, 18889, 34621, 667, , , 8646, tildelt Enzon; , , 71698, 83700, tildelt Dyax, , 80717, tildelt Affymax; 88793, tildelt Cambridge antibody Technologies; 70373, tildelt Genentech, 6189, 9898, 7619, 69843, , , tildelt Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra eller Sambrook, supra. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved anvendelse av minst en anti-tnf-antistoffkodende nukleinsyre for erholdelse av transgene dyr eller

24 23 pattedyr, f.eks. geiter, kuer, hester, sauer og lignende, som danner slike antistoffer i melken. Slike dyr kan erholdes ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Se f.eks., men ikke begrenset til, U.S. patentskrifter nr.,827,690;,849,992; 4,873,316;,849,992;,994,616;,6,362;,4,489, og lignende. 1 2 Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan i tillegg fremstilles ved anvendelse av minst en anti-tnf-antistoffkodende nukleinsyre for erholdelse av transgene planter og dyrkede planteceller (f.eks., men ikke begrenset til, tobakk og mais) som danner slike antistoffer, spesifiserte deler eller varianter i plantedelene eller i celler som dyrkes fra disse. Som et ikke-begrensende eksempel har tobakkblader som uttrykker rekombinante proteiner med hell blitt anvendt for erholdelse av store mengder rekombinante proteiner, f.eks. ved bruk av en induserbar promoter. Se f.eks., Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:9-118 (1999) og referanser som siteres deri. Videre har transgen mais blitt anvendt for ekspresjon av pattedyrproteiner i et kommersielt produksjonsnivå, med biologiske aktiviteter som tilsvarer aktivitetene oppnådd i andre rekombinante systemer eller renset fra naturlige kilder. Se f.eks. Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: (1999) og referanser som siteres deri. Antistoffer har også blitt fremstilt i store mengder fra transgene plantefrø, innbefattet antistoffragmenter, f.eks. enkeltkjedede antistoffer (scfv), innbefattet tobakkfrø og potetknoller. Se f.eks. Conrad et al., Plant. Mol. Biol. 38:1-9 (1998) og referanser som siteres deri. Således kan antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse også fremstilles ved anvendelse av transgene planter ifølge kjente fremgangsmåter. Se også f.eks. Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. :99-8 (Oktober 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:22-7 (199); Ma et al. Plant Physiol. 9:341-6 (199); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: (1994); og referanser som siteres deri. Se også generelt for planteekspresjon av antistoffer, men ikke begrenset til. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan binde human TNF med et bredt utvalg av affiniteter (K D ). I en foretrukket utførelse kan minst et humant mab ifølge foreliggende oppfinnelse om ønskelig binde humant TNF med høy affinitet. For eksempel kan et humant mab binde humant TNF med en K D lik eller mindre enn tilnærmet -7 M, f.eks., men ikke begrenset til 0,1-9,9 (eller et hvert område eller enhver verdi deri) x -7, -8, -9, -, -11, -12, -13 eller et hvert område eller enhver verdi deri. 3 Affinitet eller aviditet av et antistoff for et antigen kan bestemmes eksperimentelt ved anvendelse av enhver egnet fremgangsmåte. (Se f.eks. Berzofsky, et al., Antibody- Antigen Interactions, i Fundamental Immunology, Paul, W.E., red., Raven Press: New

25 24 York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); og fremgangsmåter som beskrives heri). Den målte affinitet av en gitt antistoff-antigeninteraksjon kan variere dersom den måles under forskjellige betingelser (f.eks. saltkonsentrasjon, ph). Således utføres målinger av affinitet og andre antigenbindingsparametere (f.eks. K D, K a, K d ) fortrinnsvis med standardiserte løsninger av antistoff og antigen og en standardisert buffer, f.eks. bufferen som beskrives heri. 1 Nukleinsyremolekyler Ved anvendelse av informasjonen som tilveiebringes heri, f.eks. nukleotidsekvensene som koder for minst 70-0% av de på hverandre følgende aminosyrer ifølge minst en av SEKV. ID. NR.. 1, 2, 3, 4,, 6, 7 og 8, spesifiserte fragmenter, varianter eller konsensussekvenser derav, eller en deponert vektor som omfatter minst en av disse sekvensene, kan et nukleinsyremolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse som koder for minst et anti-tnf-antistoff erholdes ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives heri eller som er kjente innen faget. Nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan foreligge i form av RNA, f.eks. mrna, hnrna, trna eller enhver annen form, eller i form av DNA, innbefattet, men ikke begrenset til cdna og genomisk DNA erholdt ved kloning eller fremstilt syntetisk, eller hvilke som helst kombinasjoner av disse. DNA kan være trippeltrådet, dobbelttrådet eller enkelttrådet, eller enhver kombinasjon av disse. Enhver del av minst en tråd i DNA eller RNA kan være den kodende tråd, også betegnet sens -tråden, eller den kan være den ikke-kodende tråd, også betegnet anti-sens -tråden. 2 3 Isolerte nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte nukleinsyremolekyler som omfatter en åpen leseramme (ORF), om ønskelig med ett eller flere introner, f.eks., men ikke begrenset til, minst en spesifisert del av minst ett CDR, f.eks. CDR1, CDR2 og/eller CDR3, fra minst en tungkjede (f.eks. SEKV. ID. NR.. 1-3) eller lettkjede (f.eks. SEKV. ID. NR.. 4-6); nukleinsyremolekyler som omfatter den kodende sekvens for et anti-tnf-antistoff eller et variabelt område (f.eks. SEKV. ID. NR.. 7 og 8); og nukleinsyremolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som er vesentlig forskjellig fra den beskrevet ovenfor, men som grunnet den genetiske kodes degenererthet fortsatt koder for minst et anti-tnf-antistoff som beskrevet heri og/eller som kjent innen faget. Den genetiske kode er naturligvis velkjent innen faget. Det vil således være rutinemessig for en fagperson å danne slike degenererte nukleinsyrevarianter som koder for spesifikke anti-tnf-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Se f.eks. Ausubel et al., supra, og slike nukleinsyrevarianter omfattes av foreliggende oppfinnelse. Ikke-

26 2 begrensende eksempler på isolerte nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter SEKV. ID. NR.., 11, 12, 13, 14 og 1, som tilsvarer ikke-begrensende eksempler på en nukleinsyre som koder for hhv. HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC-variabelt område og LC-variabelt område. 1 2 I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen isolerte nukleinsyremolekyler som koder for et anti-tnf-antistoff med en aminosyresekvens som kodes av nukleinsyren som inngår i plasmidet som er deponert under klonnavnet (ikke angitt) og ATCCdeponeringsnr. (ikke angitt), deponert den (ikke angitt). Som antydet heri, kan nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter en nukleinsyre som koder for et anti-tnf-antistoff omfatte, men er ikke begrenset til, nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvensen til et antistoffragment i seg selv, den kodende sekvens for hele antistoffet eller en del av dette, den kodende sekvens for et antistoff, et fragment eller en del derav, så vel som tilleggssekvenser, f.eks. den kodende sekvens for minst en signalsekvens eller et fusjonspeptid, med eller uten de ovenfor nevnte kodende tilleggssekvenser, f.eks. minst et intron, sammen med ytterligere ikke-kodende sekvenser, innbefattet, men ikke begrenset til, ikke-kodende - og 3 -sekvenser, f.eks. de transkriberte, ikke-translaterte sekvenser som spiller en rolle i transkripsjonen, mrna-prosessering, innbefattet spleisesignaler og polyadenyleringssignaler (f.eks. ribosombinding og stabilitet av mrna); en kodende tilleggssekvens som koder for ekstra aminosyrer, f.eks. aminosyrer som gir ytterligere funksjonalitet. Sekvensen som koder for et antistoff kan således være fusjonert til en markørsekvens, f.eks. en sekvens som koder for et peptid som letter rensing av det fusjonerte antistoff som omfatter et antistoffragment eller en antistoffdel. 3 Polynukleotider som selektivt hybridiserer til et polynukleotid som beskrevet heri Det er tilveiebrakt isolerte nukleinsyrer som hybridiserer under selektive hybridiseringsbetingelser til et polynukleotid som beskrevet heri. Således kan polynukleotidene anvendes for isolering, påvisning og/eller kvantifisering av nukleinsyrer som omfatter slike polynukleotider. For eksempel kan polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for påvisning, isolering eller amplifisering av partielle kloner eller fullengdekloner i et deponert bibliotek. I noen utførelser er polynukleotidene genomiske eller cdna-sekvenser som er isolert fra eller som på annet vis, er komplementært til et cdna fra et nukleinsyrebibliotek fra et menneske eller pattedyr.

27 26 1 cdna-biblioteket omfatter fortrinnsvis minst 80% fullengdesekvenser, fortrinnsvis 8% eller 90% fullengdesekvenser, og mer foretrukket minst 9% fullengdesekvenser. cdna-bibliotekene kan være normaliserte for å øke representasjonen av sjeldne sekvenser. Hybridiseringsbetingelser med lav eller moderat stringens anvendes typisk, men ikke utelukkende, for sekvenser med redusert sekvensidentitet relativt til komplementære sekvenser. Betingelser med moderat og høy stringens kan om ønskelig benyttes for sekvenser med større grad av identitet. Betingelser med lav stringens tillater selektiv hybridisering av sekvenser med tilnærmet 70% sekvensidentitet og kan benyttes for å påvise ortologe eller paraloge sekvenser. Om ønskelig vil polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse kode for minst en del av et antistoff som kodes av polynukleotidene som beskrives heri. Polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter nukleinsyresekvenser som kan benyttes for selektiv hybridisering til et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Se f.eks. Ausubel, supra; Colligan, supra. Konstruksjon av nukleinsyrer De isolerte nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av (a) rekombinante fremgangsmåter, (b) synteseteknikker, (c) renseteknikker, eller kombinasjoner av disse, som er velkjent innen faget. 2 Nukleinsyrene kan med fordel omfatte sekvenser i tillegg til et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan et multi-kloningssete som omfatter et eller flere endonukleaserestriksjonsseter innsettes i nukleinsyren for å lette isolering av polynukleotidet. Videre kan translaterbare sekvenser innsettes for å lette isolering av det translaterte polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel gir en heksahistidinmarkør et hendig middel for rensing av proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse - untatt den kodende sekvens - er om ønskelig en vektor, en adapter eller en linker for kloning og/eller ekspresjon av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse. 3 Ytterligere sekvenser kan adderes til slike klonings- og/eller ekspresjonssekvenser for å optimalisere deres funksjon under kloning og/eller ekspresjon, som en hjelp for isolering av polynukleotidet eller for å forbedre innføringen av polynukleotidet i en celle. Anvendelse av kloningsvektorer, ekspresjonsvektorer, adaptere og linkere er vel kjent innen faget. (Se f.eks. Ausubel, supra; eller Sambrook, supra).

28 Rekombinante fremgangsmåter for konstruksjon av nukleinsyrer De isolerte nukleinsyresammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. RNA, cdna, genomisk DNA eller enhver kombinasjon derav, kan erholdes fra biologiske kilder ved anvendelse av en rekke kloningsmetodologier som er kjente blant fagfolk. I noen utførelser anvendes oligonukleotidprober som selektivt hybridiserer under stringente betingelser til polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse for påvisning av den ønskede sekvens i et cdna-bibliotek eller genomisk DNA-bibliotek. Isolering av RNA og konstruksjon av cdna-biblioteker og genomiske biblioteker er velkjent blant gjennomsnittsfagfolk. (Se f.eks. Ausubel, supra; eller Sambrook, supra). Fremgangsmåter for gjennomsøking og isolering av nukleinsyrer Et cdna-bibliotek eller et genomisk bibliotek kan gjennomsøkes ved anvendelse av en probe basert på sekvensen til et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. sekvensene som beskrives heri. Prober kan anvendes for hybridisering til genomiske DNA-sekvenser eller cdna-sekvenser for isolering av homologe gener fra den samme eller en annen organisme. Fagfolk vil forstå at forskjellige grader av stringens under hybridiseringen kan anvendes i analysen, og at enten hybridiseringsløsningen eller vaskeløsningen kan være stringent. Etter hvert som hybridiseringsbetingelsene blir mer stringente, må det være større grad av komplementaritet mellom probe og mål for at en dupleks skal dannes. Graden av stringens kan kontrolleres ut fra en eller flere av temperatur, ionestyrke, ph og nærvær av et delvis denaturerende løsemiddel, f.eks. formamid. For eksempel kan hybridiseringsstringensen varieres på en hendig måte ved å endre løsningens polaritet, f.eks. ved å manipulere konsentrasjonene av formamid innenfor området fra 0% til 0%. Graden av komplementaritet (sekvensidentitet) som nødvendig for påvisbar binding vil variere i samsvar med stringensen i hybridiseringsløsningen og/eller vaskeløsningen. Graden av komplementaritet vil optimalt være 0%, 70-0% eller et hvert område eller enhver verdi deri. Det bør imidlertid forstås at mindre sekvensvariasjoner i prober og primere kan kompenseres for ved å redusere stringensen i hybridiseringsløsningen og/eller vaskeløsningen. Fremgangsmåter for amplifisering av RNA eller DNA er velkjente innen faget og kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse uten omfattende eksperimentering, basert på den lære og de retningslinjer som presenteres heri. 3 Kjente fremgangsmåter for DNA- eller RNA-amplifisering omfatter, men er ikke begrenset til, polymerase-kjedereaksjonen (PCR) og beslektede amplifiseringsprosesser (se f.eks. U.S. patentskrifter nr. 4,683,19, 4,683,2, 4,800,19, 4,96,188 tildelt Mul-

29 28 lis et al.; 4,79,699 og 4,921,794 tildelt Tabor et al.;,142,033 tildelt Innis;,122,464 tildelt Wilson et al.;,091,3 tildelt Innis;,066,84 tildelt Gyllensten, et al.; 4,889,818 tildelt Gelfand et al.; 4,994,370 tildelt Silver et al.; 4,766,067 tildelt Biswas; 4,66,134 tildelt Ringold) og RNA-formidlet amplifisering, som benytter anti-sens - RNA til målsekvensen som templat for dobbelttrådet DNA-syntese (U.S. patentskrift nr.,1,238 tildelt Malek et al., med varemerket NASBA), (Se f.eks. Ausubel, supra, eller Sambrook, supra). 1 For eksempel, kan polymerase-kjedereaksjons (PCR)-teknologi anvendes for amplifisering av sekvensene til polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse og beslektede gener direkte fra genomisk DNA eller cdna-biblioteker. PCR og andre in vitro amplifiseringsfremgangsmåter kan også være anvendbare for f.eks. kloning av nukleinsyresekvenser som koder for proteiner som skal uttrykkes, for fremstilling av nukleinsyrer for anvendelse som prober for påvisning av nærvær av det ønskede mrna i prøver, for nukleinsyresekvensering og for andre formål. Eksempler på teknikker som er tilstrekkelige til å rettlede fagpersoner gjennom in vitro-amplifiseringsfremgangsmåter finnes i Berger, supra, Sambrook, supra og Ausubel, supra, så vel som i Mullis et al., U.S. patentskrift nr. 4,683,2 (1987); og Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, red., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kommersielt tilgjengelige sett for genomisk PCR-amplifisering er kjente innen faget. Se f.eks. Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). I tillegg kan f.eks. T4-gen 32-protein (Boehringer Mannheim) anvendes for å forbedre utbyttet av lange PCR-produkter. 2 Syntesefremgangsmåter for konstruksjon av nukleinsyrer De isolerte nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også fremstilles ved direkte kjemisk syntese ved kjente fremgangsmåter (se f.eks. Ausubel et al., supra). Kjemisk syntese gir generelt et enkelttrådet oligonukleotid, som kan overføres til dobbelttrådet DNA ved hybridisering med en komplementær sekvens eller ved polymerisering med en DNA-polymerase med enkelttråden som templat. En fagperson vil innse at selv om kjemisk syntese av DNA kan være begrenset til sekvenser på tilnærmet 0 eller flere baser, kan lengre sekvenser erholdes ved sammenligering av kortere sekvenser. 3 Rekombinante ekspresjonskassetter Det er videre mulig og tilveiebringe rekombinante ekspresjonskassetter som omfatter en nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse. En nukleinsyresekvens ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. en cdna-sekvens eller en genomisk sekvens som koder for et anti-

30 29 stoff ifølge foreliggende oppfinnelse, kan anvendes for konstruksjon av en rekombinant ekspresjonskassett som kan innføres i minst en ønsket vertscelle. En rekombinant ekspresjonskassett vil typisk omfatte et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse operativt koblet til sekvenser som regulerer transkripsjonsinitieringen og som vil styre transkripsjonen av polynukleotidet i den påtenkte vertscelle. Både heterologe og ikkeheterologe (dvs. endogene) promotere kan benyttes for å styre ekspresjonen av nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse. 1 I noen utførelser, kan isolerte nukleinsyrer som fungerer som promoter, enhancer eller andre elementer innføres i passende posisjoner (oppstrøms, nedstrøms eller i et intron) i en ikke-heterolog form av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse for oppeller nedregulering av ekspresjonen av et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan endogene promotere endres in vivo eller in vitro ved mutasjon, delesjon og/eller substitusjon. Vektorer og vertsceller Foreliggende oppfinnelse gjelder også vektorer som omfatter isolerte nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, vertsceller som er genetisk modifisert med de rekombinante vektorer og produksjon av minst ett anti-tnf-antistoff ved rekombinante teknikker, som velkjente innen faget. Se f.eks. Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra. 2 Polynukleotidene kan om ønskelig være koblet til en vektor som inneholder en seleksjonsmarkør for oppformering i en vert. Generelt, innføres en plasmidvektor i en utfelling, f.eks. en kalsiumutfelling, eller i et kompleks med et ladet lipid. Dersom vektoren er et virus, kan den pakkes in vitro ved anvendelse av en egnet pakkecellelinje, og så transduseres inn i vertsceller. 3 DNA-innskuddet bør være operativt koblet til en egnet promoter. Ekspresjonskonstruksjonene vil videre omfatte seter for transkripsjonsinitiering, transkripsjonsterminering og, i det transkriberte området, et ribosombindingssete for translasjon. Den kodende del av de modne transkripter som uttrykkes fra konstruksjonene vil fortrinnsvis omfatte et translasjonsinitieringskodon i begynnelsen og et termineringskodon (f.eks. UAA, UGA eller UAG) plassert på et egnet sted i enden av mrna som skal translateres, hvor UAA og UAG foretrekkes for ekspresjon i pattedyrceller eller eukaryote celler.

31 Ekspresjonsvektorer vil fortrinnsvis, men valgfritt, omfatte minst en seleksjonsmarkør. Slike markører omfatter, men er ikke begrenset til, metotreksat (MTX)-resistens, dihydrofolatreduktase (DHRF, U.S. patentskrifter nr. 4,399,216; 4,634,6; 4,66,134; 4,96,288;,149,636;,179,017, ampicillin, neomycin (G418), mykofenolsyreresistens eller glutaminsyntetase (GS, U.S. patentskrifter nr.,122,464;,770,39;,827,739) for eukaryot celledyrking, og tetracyklin- eller ampicillinresistensgener for dyrking i E. coli og andre bakterier eller prokaryoter. Egnede dyrkningsmedier og betingelser for de ovenfor beskrevne vertsceller er kjente innen faget. Egnede vektorer vil være åpenbare for fagfolk. Innføring av en vektorkonstruksjon i en vertscelle kan oppnås ved kalsiumfosfattransfeksjon, DEAE-dekstranformidlet transfeksjon, kationisk lipidformidlet transfeksjon, elektroporering, transduksjon, infeksjon eller andre kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter er beskrevet innen faget, f.eks. i Sambrook, supra, kapittel 1-4 og 16-18, og Ausubel, supra, kapittel 1, 9, 13, 1 og Minst et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan uttrykkes i modifisert form, f.eks. som et fusjonsprotein, og kan omfatte ikke bare sekresjonssignaler, men også ytterligere heterologe funksjonelle områder. For eksempel kan et område med ekstra aminosyrer, fortrinnsvis ladede aminosyrer, adderes til antistoffets N-ende for å forbedre stabiliteten og levetiden i vertscellen, under rensing eller under påfølgende håndtering og lagring. Videre kan peptidgrupper adderes til et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse for å lette rensingen. Slike områder kan fjernes før den endelige fremstilling av et antistoff eller minst et fragment derav. Slike fremgangsmåter beskrives i mange standard laboratoriehåndbøker, f.eks. Sambrook, supra, kapittel og , og Ausubel, supra, kapittel 16, 17 og 18. Gjennomsnittsfagfolk kjenner til de mange ekspresjonssystemer som er tilgjengelige for ekspresjon av en nukleinsyre som koder for et protein ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt, kan nukleinsyrer ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes i en vertscelle ved å skru dem på (ved manipulering) i en vertscelle som inneholder endogent DNA som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike fremgangsmåter er velkjente innen faget, f.eks. som beskrevet i U.S. patentskrifter nr.,80,734,,641,670,,733,746 og,733, Illustrerende for cellekulturer som er anvendbare for produksjon av antistoffene eller de spesifiserte deler eller varianter av disse, er pattedyrceller. Pattedyrcellesystemer vil ofte foreligge i form av encellelag, selv om pattedyrcellesuspensjoner eller bioreaktorer

32 31 også kan anvendes. En rekke vertscellelinjer som kan uttrykke intakte glykosylerte proteiner er utviklet innen faget og omfatter cellelinjene COS-1 (f.eks. ATCC CRL 160), COS-7 (f.eks. ATCC CRL 161), HEK293, BHK21 (f.eks. ATCC CRL-), CHO (f.eks. ATCC CRL 16) og BSC-1 (f.eks. ATCC CRL-26) cellelinjer, Cos-7-celler, CHO-celler, hep G2-celler, P3x63Ag8.63, SP2/0-Ag14, 293-celler, HeLa-celler og lignende, som er lett tilgjengelige fra f.eks. American Type Culture Collection, Manassas, Va ( Foretrukne vertsceller omfatter celler av lymfoid opphav, f.eks. myelomceller og lymfomceller. Spesielt foretrukne vertsceller er P3X63Ag8.63-celler (ATCC Aksesjonsbetegnelse CRL-180) og SP2/0-Ag14-celler (ATCC aksesjonsbetegnelse CRL-181). I en spesielt foretrukket utførelse er den rekombinante celle en P3X63Ab8.63- eller SP2/0-Ag14-celle. 1 2 Ekspresjonsvektorer for disse cellene kan omfatte en eller flere av følgende ekspresjonskontrollsekvenser, f.eks., men ikke begrenset til, et replikasjonsorigo, en promoter (f.eks. den sene eller tidlige SV40-promoter, CMV-promoter (U.S. patentskrifter nr.,168,062;,38,839), en HSV tk-promoter, en pgk (fosfoglyceratkinase)-promoter, en EF-1 alfa-promoter (U.S. patentskrift nr.,266,491), minst en promoter fra et humant immunglobulin, en enhancer og/eller prosesseringsinformasjonsseter, f.eks. ribosombindingsseter, RNA-spleiseseter, polyadenyleringsseter (f.eks. et poly A-adderingssete fra det store T-Ag fra SV40), og transkripsjonstermineringssekvenser. Se f.eks. Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra. Andre celler som er anvendbare for fremstilling av nukleinsyrer eller proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse er kjente og/eller tilgjengelige, f.eks. fra American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas ( eller andre kjente eller kommersielle kilder. Dersom eukaryote vertsceller benyttes, er polyadenyleringssekvenser eller transkripsjonstermineringssekvenser typisk innført i vektoren. Et eksempel på en termineringssekvens er polyadenyleringssekvensen fra veksthormongenet fra storfe. Sekvenser for nøyaktig spleising av transkriptet kan også inngå. Et eksempel på en spleisesekvens er VP1-intronet fra SV40 (Sprague et al., J. Virol. 4: (1983)). I tillegg, kan gensekvenser som kontrollerer replikasjonen i vertscellen inngå i vektoren, som kjent innen faget. 3 Rensing av et antistoff Et anti-tnf-antistoff kan gjenvinnes og renses fra rekombinante cellekulturer ved velkjente fremgangsmåter, innbefattet, men ikke begrenset til, protein A-rensing, ammoniumsulfat- eller etanolutfelling, syreekstraksjon, anion- eller kationbytterkromatografi,

33 32 fosfocellulosekromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi, hydroksylapatittkromatografi og lektinkromatografi. Høyytelses væskekromatografi ( HPLC ) kan også anvendes for rensingen. Se f.eks. Colligan, Current Protocols in Immunology, eller Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, ( ), f.eks. kapitlene 1, 4, 6, 8, 9,. Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter naturlige, rensede produkter, produkter fra kjemiske syntesefremgangsmåter og produkter fremstilt ved rekombinante teknikker fra en eukaryot vert, innbefattet f.eks. gjær, høyere planteceller, insektsceller og pattedyrceller. Avhengig av verten som benyttes i en rekombinant fremstillingsfremgangsmåte kan antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse være glykosylert eller ikke-glykosylert, hvor glykosylert foretrekkes. Slike fremgangsmåter beskrives i mange standard laboratoriehåndbøker, f.eks. Sambrook, supra, seksjon ; Ausubel, supra, kapittel, 12, 13, 16, 18 og, Colligan, Protein Science, supra, kapittel 12-14, Anti-TNF-antistoffer De isolerte antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter antistoffaminosyresekvenser som beskrives heri kodet av et hvert egnet polynukleotid, eller et hvert isolert eller fremstilt antistoff. Det humane antistoff eller antigenbindende fragment binder fortrinnsvis humant TNF og nøytraliserer derved delvis eller i vesentlig grad minst en biologisk aktivitet forbundet med proteinet. Et antistoff eller en spesifisert del eller variant derav som delvis eller fortrinnsvis i vesentlig grad nøytraliserer minst en biologisk aktivitet forbundet med minst et TNF-protein eller -fragment kan binde proteinet eller fragmentet og derved inhibere aktiviteter som formidles via binding av TNF til TNFreseptoren eller via andre TNF-avhengige eller -formidlede mekanismer. Som anvendt heri viser begrepet nøytraliserende antistoff til et antistoff som kan inhibere en TNFavhengig aktivitet med tilnærmet -1%, fortrinnsvis med minst tilnærmet,,, 40, 0,, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 91, 92, 93, 94, 9, 96, 97, 98, 99, 0% eller mer, avhengig av analysen. Et anti-tnf-antistoff evne til å inhibere en TNF-avhengig aktivitet anslås fortrinnsvis ved minst en egnet TNF-protein- eller -reseptoranalyse som beskrevet heri og/eller som kjent innen faget. Et humant antistoff ifølge oppfinnelsen kan være av enhver klasse (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, osv.) eller isotype og kan omfatte en kappa- eller lambda-lettkjede. I en utførelse omfatter det humane antistoff en IgGtungkjede eller et definert fragment derav, f.eks. minst en av isotypene, IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4. Antistoffer av denne type kan fremstilles ved å benytte en transgen mus eller et annet transgent, ikke-humant pattedyr som omfatter minst et transgen for en human lettkjede (f.eks. IgG, IgA og IgM (f.eks. 1, 2, 3, 4) som beskrevet heri

34 og/eller som kjent innen faget. I en annen uførelse omfatter det humane anti-human TNF-antistoff en IgG1-tungkjede og en IgG1-lettkjede. 33 Minst et antistoff ifølge oppfinnelsen bindes til minst en spesifisert epitop som er spesifikk for minst et TNF-protein, en subenhet, et fragment, en del eller enhver kombinasjon derav. Epitopen eller epitopene kan omfatte minst et antistoffbindende område som omfatter minst en del av proteinet, hvor epitopen fortrinnsvis består av minst en ekstracellulær, løselig, hydrofil, ekstern eller cytoplasmatisk del av proteinet. Epitopen eller epitopene kan omfatte enhver kombinasjon av minst en aminosyresekvens bestående av fra minst 1-3 aminosyrer til hele den spesifiserte del av på hverandre følgende aminosyrer i SEKV. ID. NR Generelt vil det humane antistoff eller det antigenbindende fragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte et antigenbindende område som omfatter minst et humant komplementaritetsbestemmende område (CDR1, CDR2 og CDR3) eller en variant derav fra minst et variabelt tungkjedeområde, og minst et humant komplementaritetsbestemmende område (CDR1, CDR2 og CDR3) eller en variant derav fra minst et variabelt lettkjedeområde. Som et ikke-begrensende eksempel kan antistoffet eller den antigenbindende del eller variant omfatte minst et av tungkjede-cdr3 med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 3 og/eller et lettkjede-cdr3 med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 6. Antistoffet eller de antigenbindende fragment kan ha et antigenbindende område som omfatter minst en del av minst et tungkjede-cdr (dvs. CDR1, CDR2 og/eller CDR3) med aminosyresekvensen til det tilsvarende CDR1, 2 og/eller 3 (f.eks. SEKV. ID. NR. 1, 2 og/eller 3). I en annen spesiell utførelse kan antistoffet eller den antigenbindende del eller variant ha et antigenbindende område som omfatter minst en del av minst et lettkjede-cdr (dvs. CDR1, CDR2 og/eller CDR3) med aminosyresekvensen til det tilsvarende CDR1, 2 og/eller 3 (f.eks. SEKV. ID. NR. 4, og/eller 6). Videre kan de tre tungkjede-cdr og de tre lettkjede-cdr i antitoffet eller det antigenbindende fragment ha aminosyresekvensen til det tilsvarende CDR i minst en av mab TNV148, TNV14, TNV1, TNV196, TNV1, TNV118, TNV32, TNV86, som beskrevet heri. Slike antistoffer kan fremstilles ved kjemisk sammenkobling av de forskjellige deler (f.eks. CDR, rammeverk) i antistoffet ved anvendelse av konvensjonelle teknikker, ved å fremstille og uttrykke et (dvs. et eller flere) nukleinsyremolekyler som koder for antistoffet ved anvendelse av konvensjonelle teknikker innen rekombinant DNA-teknologi, eller ved anvendelse av enhver annen egnet fremgangsmåte.

35 34 1 Anti-TNF-antistoffet kan omfatte minst ett variabelt område fra en tungkjede eller lettkjede med en definert aminosyresekvens. Anti-TNF-antistoffet kan for eksempel omfatte minst et variabelt område fra minst en tungkjede, om ønskelig med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 7, og/eller minst et varibelt område fra en lettkjede, om ønskelig med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 8. Antistoffer som bindes til human TNF og som omfatter et definert varibelt område fra tungkjede eller lettkjede kan fremstilles ved anvendelse av egnede fremgangsmåter, f.eks. bakteriofag fremvisning (Katsube, Y., et al., Int. J. Mol. Med., 1(): (1998)) eller fremgangsmåter som benytter transgene dyr, som kjent innen faget og/eller som beskrevet heri. For eksempel kan en transgen mus som omfatter et funksjonelt rearrangert humant trangen for immunglobulin-tungkjede og et transgen som omfatter DNA fra et humant immunglobulin-lettkjedelokus som kan gjennomgå funksjonell rearrangering immuniseres med humant TNF eller et fragment derav for å utløse dannelse av antistoffer. Om ønskelig kan de antistoffproduserende celler isoleres, og hybridomer eller andre immortaliserte antistoffproduserende celler kan fremstilles som beskrevet heri og/eller som kjent innen faget. Alternativt kan antistoffet eller den spesifiserte del eller variant uttrykkes ved anvendelse av den kodende nukleinsyre eller en del av denne i egnet vertscelle. 2 3 Oppfinnelsen gjelder også antistoffer, antigenbindende fragmenter, immunglobulinkjeder og CDR som omfatter aminosyrer i en sekvens som idet vesentlige er den samme som en aminosyresekvens som beskrevet heri. Fortrinnsvis kan slike antistoffer eller antigenbindende fragmenter og antistoffer som omfatter slike kjeder eller CDR binde human TNF med høy affinitet (f.eks. K D mindre enn eller lik tilnærmet -9 M). Aminosyresekvenser som er idet vesentlige de samme som sekvensene som beskrives heri omfatter sekvenser som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner så vel som aminosyredelesjoner og/eller insersjoner. En konservativ aminosyresubstitusjon viser til erstatning av en første aminosyre med en andre aminosyre som har kjemiske og/eller fysiske egenskaper (f.eks. ladning, struktur, polaritet, hydrofobisitet/hydrofilisitet) som ligner egenskapene til den første aminosyren. Konservative substitusjoner omfatter erstatning av en aminosyre med en annen innen følgende grupper: lysin (K), arginin (R) og histidin (H); aspartat (D) og glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tyrosin (Y), K, R, H, D og E; alanin (A), valin (V), leucin (L), isoleucin (I), prolin (P), fenylalanin (F), tryptofan (W), metionin (M), cystein (C) og glycin (G); F, W og Y; C, S og T. Aminosyrekoder

36 3 Aminosyrene som bygger opp anti-tnf-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse forkortes ofte. Aminosyrebetegnelsene kan angis ved å betegne aminosyren med dens enbokstavkode, dens trebokstavkode, dens navn eller dens trenukleotidkodon eller -kodoner, som godt forstått innen faget (se Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, 3. utgave, Garland Publishing, Inc., New York, 1994): ENBOKSTAV- KODE TREBOKSTA V-KODE NAVN TRENUKLEOTID- KODON(ER) A Ala Alanin GCA, GCC, GCG, GCU C Cys Cystein UGC, UGU D Asp Aspartinsyre GAC, GAU E Glu Glutaminsyre GAA, GAG F Phe Fenylalanin UUC, UUU G Gly Glycin GGA, GGC, GGG, GGU H His Histidin CAC, CAU I Ile Isoleucin AUA, AUC, AUU K Lys Lysin AAA, AAG L Leu Leucin UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M Met Metionin AUG N Asn Asparagin AAC, AAU P Pro Prolin CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamin CAA, CAG R Arg Arginin AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU T Thr Treonin ACA, ACC, ACG, ACU V Val Valin GUA, GUC, GUG, GUU W Trp Tryptofan UGG Y Tyr Tyrosin UAC, UAU Et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner, enten grunnet naturlige mutasjoner eller human manipulering, som spesifisert heri. Antall aminosyresubstitusjoner som en erfaren fagperson vil innføre vil naturligvis avhenge av en rekke faktorer, innbefattet faktorene beskrevet ovenfor. Generelt sett, vil

37 36 antall aminosyresubstitusjoner, -insersjoner eller -delesjoner for et gitt anti-tnfantistoff eller et fragment eller en variant derav ikke være mer enn 40,,, 19, 18, 17, 16, 1, 14, 13, 12, 11,, 9, 8, 7, 6,, 4, 3, 2, 1, f.eks. 1- eller et hvert område eller enhver verdi deri, som spesifisert heri. 1 Aminosyrer i et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som er avgjørende for funksjonen kan påvises ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alaninscannende mutagenese (se f.eks. Ausubel, supra, kapittel 23 8, 1; Cunningham og Wells, Science 244:81-8 (1989)). Denne siste fremgangsmåten innfører enkeltvise alaninmutasjoner for hver aminosyrerest i molekylet. De resulterende mutante molekyler analyseres så for biologisk aktivitet, f.eks. men ikke begrenset til, minst en TNF-nøytraliserende aktivitet. Seter som er avgjørende for antistoffbindingen kan også påvises ved strukturell analyse, f.eks. krystallisering, kjernemagnetisk resonans eller fotoaffinitetsmerking (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: (1992) og de Vos, et al., Science 2:6-312 (1992)). Anti-TNF-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte, men er ikke begrenset til, minst en del, sekvens eller kombinasjon utvalgt blant fra til alle de på hverandre følgende aminosyrer i mins en av SEKV. ID. NR. 1, 2, 3, 4, og 6. Et anti-tnf-antistoff kan videre om ønskelig omfatte et polynukleotid bestående av minst en av 70-0% av de på hverandre følgende aminosyrer i minst en av SEKV. ID. NR. 7 og Aminosyresekvensen til en immunglobulinkjede eller en del derav (f.eks. et variabelt område, CDR) kan ha tilnærmet 70-0% identitet (f.eks. 70, 71, 72, 73, 74, 7, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 8, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 9, 96, 97, 98, 99, 0 eller et hvert område eller enhver verdi deri) med aminosyresekvensen til den tilsvarende kjede i minst en av SEKV. ID. NR. 7 og 8. For eksempel kan aminosyresekvensen til et varibelt lettkjedeområde sammenlignes med sekvensen i SEKV. ID. NR. 8, eller aminosyresekvensen til et tungkjede-cdr3 kan sammenlignes med SEKV. ID. NR. 7. Fortrinnsvis bestemmes 70-0% aminosyreidentitet (dvs. 90, 91, 92, 93, 94, 9, 96, 97, 98, 99, 0 eller et hvert område eller enhver verdi deri) ved anvendelse av en egnet datamaskinalgoritme, som kjent innen faget. Eksempler på sekvenser for variable områder fra tungkjede og lettkjede gis i SEKV. ID. NR. 7 og 8. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse eller spesifiserte varianter av

38 37 disse kan omfatte et hvert antall på hverandre følgende aminosyrer fra et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori antallet er utvalgt fra gruppen av heltall som består av fra til 0% av antall på hverandre følgende aminosyrerester i et anti-tnf-antistoff. Om ønskelig er denne undersekvens av på hverandre følgende aminosyrer minst tilnærmet,,, 40, 0, 60, 70, 80, 90, 0, 1, 1, 1, 140,, 160, 170, 180, 190, 0, 2, 2, 2, 240, eller flere aminosyrer lang, eller et hvert område eller enhver verdi deri. Videre kan antallet av slike undersekvenser være et hvert heltall utvalgt fra gruppen som består av fra 1 til, f.eks. minst 2, 3, 4 eller. 1 Som fagfolk vil forstå omfatter foreliggende oppfinnelse minst et biologisk aktivt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Biologisk aktive antistoffer har en spesifikk aktivitet på minst %, % eller 40%, fortrinnsvis minst 0%, 60% eller 70%, og mest foretrukket minst 80%, 90% eller 9-00% av aktiviteten til det native (ikkesyntetiske), endogene eller beslektede og kjente antistoff. Fremgangsmåter for analyse og kvantifisering av mål på enzymaktivitet og substratspesifisitet er velkjente blant fagfolk. 2 I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen humane antistoffer og antigenbindende fragmenter som beskrevet heri, som kan være modifisert ved kovalent tilkobling av en organisk gruppe. Slik modifisering kan gi et antistoff eller antigenbindende fragment med forbedrede farmakokinetiske egenskaper (f.eks. forlenget halveringstid i serum in vivo). Den organiske gruppe kan være en uforgrenet eller forgrenet, hydrofil polymer gruppe, en fettsyregruppe eller en fettsyreestergruppe. I spesielle utførelser kan den hydrofile polymere gruppe ha en molekylvekt på fra tilnærmet 800 til tilnærmet Dalton, og kan være en polyalkanglykol (f.eks. polyetylenglykol (PEG), polypropylenglykol (PPG)), en karbohydratpolymer, en aminosyrepolymer eller polyvinylpyrrolidon, og fettsyregruppen eller fettsyreestergruppen kan omfatte fra tilnærmet 8 til tilnærmet 40 karbonatomer. 3 De modifiserte antistoffene og de antigenbindende fragmenter ifølge oppfinnelsen kan omfatte en eller flere organiske grupper som direkte eller indirekte er kovalent bundet til antistoffet. Hver av de organiske gruppene som er bundet til et antistoff eller et antigenbindende fragment ifølge oppfinnelsen kan uavhengig av hverandre være en hydrofil polymergruppe, en fettsyregruppe eller en fettsyreestergruppe. Som anvendt heri omfatter begrepet en fettsyre monokarboksylsyrer og dikarboksylsyrer. En hydrofil polymer gruppe som anvendt heri viser til en organisk polymer som er mer løselig i vann enn i oktan. For eksempel er polylysin mer løselig i vann enn i oktan. Således omfattes

39 38 1 et antistoff som er modifisert ved kovalent tilkobling av polylysin av oppfinnelsen. Hydrofile polymerer som er egnede for modifisering av antistoffer ifølge oppfinnelsen kan være uforgrenede eller forgrenede, og omfatter f.eks. polyalkanglykoler (f.eks. PEG, monometoksypolyetylenglykol (mpeg), PPG og lignende), karbohydrater (f.eks. dekstran, cellulose, oligosakkarider, polysakkarider og lignende), polymerer av hydrofile aminosyrer (f.eks. polylysin, polyarginin, polyaspartat og lignende), polyalkanoksider (f.eks. polyetylenoksid, polypropylenoksid og lignende) og polyvinylpyrrolidon. Den hydrofile polymer som modifiserer antistoffet ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en molekylvekt på fra tilnærmet 800 til tilnærmet 000 Dalton som en separat molekylærgruppe. For eksempel kan PEG 000 og PEG 000, hvori subskriptet angir den gjennomsnittlige molekylvekt av polymeren i Dalton, anvendes. Den hydrofile polymere gruppe kan være substituert med fra en til tilnærmet seks alkylgrupper, fettsyregrupper eller fettsyreestergrupper. Hydrofile polymerer som er substituert med en fettsyregruppe eller fettsyreestergruppe kan fremstilles ved anvendelse av egnede fremgangsmåter. For eksempel kan en polymer som omfatter en amingruppe kobles til et karboksylat av fettsyren eller fettsyreesteren, og et aktivert karboksylat (f.eks. aktivert med N,Nkarbonyldiimidazol) på en fettsyre eller fettsyreester kan kobles til en hydroksylgruppe i en polymer. 2 Fettsyrer og fettsyreestere som er egnede for modifisering av antistoffer ifølge oppfinnelsen kan være mettede eller inneholde en eller flere enheter med umettethet. Fettsyrer som er egnede for modifisering av antistoffer ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. n- dodekanoat (C 12, laurat), n-tetradekanoat (C 14, myristat), n-oktadekanoat (C 18, stearat), n-eikosanoat (C, arakidat), n-dokosanoat (C 22, behenat), n-trikontanoat (C ), n- tetrakontanoat (C 40 ), cis-#9-oktadekanoat (C 18, oleat), alle cis-#,8,11,14- ekosatetraenoat (C, arakidonat), oktandionsyre, tetradekandionsyre, oktadekandionsyre, dokosandionsyre og lignende. Egnede fettsyreestere omfatter monoestere av dikarboksylsyrer som omfatter en uforgrenet eller forgrenet lavere alkylgruppe. Den lavere alkylgruppen kan omfatte fra et til tilnærmet tolv, fortrinnsvis fra et til tilnærmet seks, karbonatomer. 3 De modifiserte humane antistoffene og de antigenbindende fragmentene kan fremstilles ved anvendelse av egnede fremgangsmåter, f.eks. ved reaksjon med et eller flere modifiserende midler. Et modifiserende middel som anvendt heri viser til en egnet organisk gruppe (f.eks. en hydrofil polymer, en fettsyre, en fettsyreester) som omfatter en aktiverende gruppe. En aktiverende gruppe er en kjemisk rest eller funksjonell gruppe som etter egnede betingelser kan reagere med en annen kjemisk gruppe, hvorved det

40 39 1 dannes en kovalent binding med det modifiserende middel og denne andre kjemiske gruppen. For eksempel omfatter aminreaktive aktiverende grupper elektrofile grupper som tosylat, mesylat, halo (klor, brom, fluor, jod), N-hydroksysuksinimidylestere (NHS) og lignende. Aktiverende grupper som kan reagere med tioler omfatter f.eks. maleimid, jodacetyl, akrylolyl, pyridyldisulfider, -tiol-2-nitrobenzosyretiol (TNB-tiol) og lignende. En funksjonell aldehydgruppe kan kobles til amin- eller hydrazidholdige molekyler, og en azidgruppe kan reagere med en trivalent fosforgruppe for dannelse av fosforamidat- eller fosforimidbindinger. Egnede fremgangsmåter for innføring av aktiverende grupper i molekyler er kjente innen faget (se f.eks. Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. Academic Press: San Diege, CA (1996)). En aktiverende gruppe kan bindes direkte til den organiske gruppen (f.eks. den hydrofile polymer, fettsyre, fettsyreesteren), eller via en linkergruppe, f.eks. en divalent C 1 -C 12 -gruppe hvori et eller flere karbonatomer kan være erstattet med et heteroatom som oksygen, nitrogen eller svovel. Egnede linkergrupper omfatter f.eks. tetraetylenglykol -(CH 2 ) 3 -, -NH-(CH 2 ) 6 -NH-, -(CH 2 ) 2 -NH- og -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -O-CH-NH-. Modifiserende midler som omfatter en linkergruppe kan f.eks. fremstilles ved å la et mono-boc-alkyldiamin (se f.eks. mono-boc-etylendiamin, mono-boc-diaminoheksan) reagere med en fettsyre i nænrvær av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) for dannelse av en amidbinding mellom det frie amin og fettsyrekarboksylatet. Boc-beskyttelsesgruppen kan fjernes fra produktet ved behandling med trifluoreddiksyre (TFA) for eksponering av et primært amin som kan kobles til et annet karboksylat som beskrevet, eller reagere med maleinsyreanhydrid hvoretter det resulterende produkt cykliseres for dannelse av et aktivert maleimidoderivat av fettsyren. (Se f.eks. Thompson, et al., WO 92/16221). 2 3 De modifiserte antistoffene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å la et humant antistoff eller antigenbindende fragment reagere med et modifiserende middel. For eksempel kan de organiske gruppene bindes til antistoffet på en ikke-setespesifikk måte ved å benytte et aminreaktivt modifiserende middel, f.eks. en NHS-ester av PEG. Modifiserte humane antistoffer eller antigenbindende fragmenter kan også fremstilles ved å redusere disulfidbindinger (f.eks. intrakjede-disulfidbindinger) i et antistoff eller antigenbindende fragment. Det reduserte antistoff eller antigenbindende fragment kan så reagere med et tiolreaktivt modifiserende middel for dannelse av det modifiserte antistoff ifølge oppfinnelsen. Modifiserte humane antistoffer og antigenbindende fragmenter som omfatter en organisk gruppe som er bundet til spesifikke seter i et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av egnede fremgangsmåter, f.eks. revers proteolyse (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., : (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(): (1997);

41 40 Itoh et al., Bioorg.Chem., 24(1):9-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 6(4): (1997)), og fremgangsmåtene som beskrives i Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996). 1 ANTI-IDIOTYPEANTISTOFFER MOT ANTI-TNF-ANTISTOFFSAMMENSETNINGER I tillegg til monoklonale eller chimere anti-tnf-antistoffer, er det også mulig å tilveibringe anti-idiotype (anti-id)-antistoff som er spesifikt for slike antistoffer. Et anti- Id-antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter som generelt er forbundet med det antigenbindende området i et annet antistoff. Anti-Id kan fremstilles ved å immunisere et dyr av samme art og genetiske type (f.eks. musestamme) som kilden for Id-antistoffet med antistoffet eller et CDR-holdig område fra dette. Det immuniserte dyr vil gjenkjenne og respondere på de idiotypiske determinanter i det immuniserende antistoff og danne et anti-id-antistoff. Anti-Id-antistoffet kan også anvendes som et immunogen for induksjon av en immunrespons i nok et dyr, slik at det dannes et såkalt antianti-id-antistoff. 2 3 ANTI-TNF-ANTISTOFFSAMMENSETNINGER Det kan også tilveiebringes minst en anti-tnf-antistoffsammensetning som omfatter minst ett, minst to, minst tre, minst fire, minst fem, minst seks eller flere anti-tnfantistoffer som beskrevet heri og/eller som kjent innen faget, som tilveiebringes i en ikke naturlig forekommende sammensetning, blanding eller form, slike sammensetninger omfatter ikke naturlig forekommende sammensetninger som omfatter minst en eller to fullengde, C- og/eller N-terminalt delerte varianter, domener, fragmenter eller spesifiserte varianter av anti-tnf-antistoffaminosyresekvensen utvalgt fra gruppen som består av 70-0% av de på hverandre følgende aminosyrer i SEKV. ID. NR. 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, eller spesifiserte fragmenter, domener eller varianter derav. Anti-TNFantistoffsammensetninger kan omfatte minst en eller to fullengde-antistoffer, fragmenter, domener eller varianter samt minst en CDR- eller LBR-holdig del av anti-tnfantistoffsekvensen som omfatter 70-0% av SEKV. ID. NR. 1, 2, 3, 4, eller 6, eller spesifiserte fragmenter, domenter eller varianter derav. Videre kan sammensetningene omfatte 40-99% av minst en av 70-0% av SEKV. ID. NR. 1, 2, 3, 4, eller 6, eller spesifiserte fragmenter, domener eller varianter derav. Slike prosentandeler av sammensetningen gjelde vekt, volum, konsentrasjon, molaritet eller molalitet som flytende eller faste løsninger, blandinger, suspensjoner, emulsjoner eller kolloider, som kjent innen faget eller som beskrevet heri.

42 Anti-TNF-antistoffsammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatter tilførsel av enhver egnet og effektiv mengde av minst en sammensetning eller et farmasøytisk preparat som omfatter minst et anti-tnf-antistoff til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling eller terapi, om ønskelig videre omfattende minst en komponent utvalgt blant en TNF-antagonist (f.eks., men ikke begrenset til, et TNF-antistoff eller et fragment derav, en løselig TNF-reseptor eller et fragment derav, fusjonsproteiner derava eller en lavmolekylær TNF-antagonist), et anti-reumatisk middel (f.eks. metotreksat, auranofin, aurotioglukose, azatioprin, etanercept, gull-natriumtiomalat, hydroksykloroquinsulfat, leflunomid, sulfasalzin), et muskelrelakserende middel, et narkotisk middel, et ikke-steroid anti-inflammatiske medikament (NSAID), et analgetisk middel, et anestetisk middel, et beroligende middel, et lokalbedøvende middel, et neuromuskulært blokkerende middel, et anti-mikrobielt middel (f.eks. aminoglykosid, et antifungalt middel, et antiparasittmiddel, et antiviralt middel, et karbapenem, cefalosporin, et fluorquinolon, et makrolid, et penecillin, et sulfonamid, et tetracyklin, et annet antimikrobielt middel), et antipsoriasismiddle, et kortikosteroid, et anabolsk steroid, et dibetesforbundet middel, et mineral, et næringsstoff, et tyroidmiddel, et vitamin, et kalsiumforbundet hormon, et antidiarretisk middel, et hostemiddel, et antiemetisk middel, et antiulcermiddel, et avføringsmiddel, et antikoagulasjonsmiddel, et erytropoietin (f.eks. epoetin alfa), et filgrastim (f.eks. G-CSF, Neupogen), en sargramostim (GM-CSF, leukin), en immunisering, et immunglobulin, et immunsupprimerende middel (f.eks. basiliksimab, cyklosporin, daklizumab), et veksthormon, et hormonerstatningsmedikament, en østrogenreseptormodulator, et mydriatisk middel, et cykloplegisk middel, et alkylerende middel, en antimetabolitt, en mitoseinhibitor, et radioaktivt merket farmasøytisk middel, et anti-depressjonsmiddel, et antimanisk middel, et anti-psykotisk middel, et anksiolyttisk middel, et hypnotisk middel, et sympatomimetisk middel, et stimulerende middel, donepezil, takrin, et astmamedikament, en beta-agonist, et inhallert steroid, en leukotrieninhibitor, et metylxantin, et kromolyn, et epinefrin eller en epinefrinanalog, dornase alfa (Pulmozym), et cytokin eller en cytokinantagonist. Ikke-begrensende eksempler på slike cytokiner omfatter, men er ikke begrenset til, et hvert av IL-1 til IL-23. Egnede doser er velkjente innen faget. Se f.eks. Wells et al., red., Pharmacotherapy Handbook, 2. utgave, Appleton and Lange, Stamford, CT (00); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 00, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (00). 3 Slike anti-cancermidler eller anti-infeksjonsmidler kan også omfatte toksinmolekyler som er assosiert med, bundet til, utformet sammen med eller tilnærmet sammen med minst et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Toksinet kan om ønskelig virke slik at

43 det selektivt dreper den patologiske celle eller vevet. Den patologiske celle kan være en kreftcelle eller en annen celle. Slike toksiner kan være, men er ikke begrenset til, rensede eller rekombinante toksiner eller toksinfragmenter som omfatter minst et funksjonelt, cytotoksisk toksindomene, f.eks. utvalgt blant minst en av ricin, difteritoksin, en slangegift eller et bakterietoksin. Begrepet toksin omfatter også både endotoksiner og eksotoksiner som dannes av enhver naturlig forekommende, mutant eller rekombinant bakterie eller et hvert virus som kan forårsake enhver patologisk tilstand i mennesker eller andre pattedyr, innbefattet toksinsjokk, som kan føre til døden. Slike toksiner kan omfatte, men er ikke begrenset til, varmelabilt enterotoksin (LT) fra enterotoksigene E. coli, varmesabilt enterotoksin (ST), Shigella-cytotoksin, Aeromonas-enterotoksiner, toksisk sjokksyndrom-toksin 1 (TSST-1), stafylokokkenterotoksin A (SEA), B (SEB) eller C (SEC), streptokokkenterotoksiner og lignende. Slike bakterier omfatter, men er ikke begrenset til, stammer av en art av enterotoksigen E. coli (ETEC), enterohemorragisk E. coli (f.eks. stammer av serotype 017:H7), Staphylococcus-arter (f.eks. Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), Shigella-arter (f.eks. Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, og Shigella sonnei), Salmonella-arter (f.eks. Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium-arter (f.eks. Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacterarter (f.eks. Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter-arter (f.eks. Heliobacter pylori), Aeromonas-arter (f.eks. Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios-arter (f.eks. Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella-arter, Pseudomonas aeruginosa, og Streptococci. Se f.eks. Stein, red., INTERNAL MEDICINE, 3. utgave, s. 1-13, Little, Brown and Co., Boston (1990); Evans et al., red., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2. utgave, s , Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3. utgave, Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al., red., The Merck Manual, 16. utgave, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76: (1991); Marrack et al., Science, 248: (1990). Anti-TNF-antistofforbindelser, -sammensetninger eller kombinasjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte minst et egnet tilleggstoff, f.eks., men ikke begrenset til, et fortynningsmiddel, et bindemiddel, en stabilisator, buffere, salter, lipofile løsemidler, et konserveringsmiddel, en adjuvans eller lignende. Farmasøytisk aksepterbare tilleggsstoffer foretrekkes. Ikke-begrensende eksempler på og fremgangsmåter for fremstilling av slike sterile løsninger er velkjente innen faget, f.eks., men ikke begrenset til, Gennaro, red., Remington s Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, Mack Publishing

44 43 Co. (Easton, PA), Det kan rutinemessig utvelges farmasøytisk aksepterbare bærestoffer som er egnede for tilførselsmåte, løselighet og/eller stabilitet av anti-tnfantistoffsammensetningen, fragmentsammensetningen eller variantsammensetningen, som velkjent innen faget eller som beskrevet heri. 1 Farmasøytiske eksipienser og tilsetningsstoffer som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, proteiner, peptider, aminosyrer, lipider og karbohydrater (f.eks. sukkere, innbefattet monosakkarider, di-, tri-, tetra- og oligosakkarider, derivatiserte sukkere som alditoler, aldonsyrer, forestrede sukkere og lignende, og polysakkarider eller sukkerpolymerer) som kan foreliggen enkeltvis eller i kombinasjon og som alene eller i kombinasjon utgjør 1-99,99% (vekt/vekt eller vol./vol.). Eksempler på proteineksipienser omfatter serumalbumin, f.eks. humant serumalbumin (HSA), rekombinant humant albumin (rha), gelatin, kasein, og lignende. Representative aminosyre/antistoffbestanddeler som også kan fungere som buffere omfatter alanin, glycin, arginin, betain, histidin, glutaminsyre, aspartinsyre, cystein, lysin, leucin, isoleucin, valin, metionin, fenylalanin, aspartam og lignende. En foretrukket aminosyre er glycin. 2 Karbohydrateksipienser som er egnede for anvendelse i oppfinnelsen omfatter f.eks. monosakkarider som fruktose, maltose, galaktose, glukose, D-mannose, sorbose og lignende; disakkarider som laktose, sukrose, trehalose, cellobiose, og lignende; polysakkarider som raffinose, melezitose, maltodekstriner, dekstraner, stivelser, og lignende; og alditoler, som mannitol, xylitol, maltitol, laktitol, xylitol, sorbitol (glucitol), myoinositol og lignende. Foretrukne karbohydrateksipienser for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er mannitol, trehalose og raffinose. Anti-TNF-antistoffsammensetninger kan også omfatte en buffer eller et ph-justerende middel, bufferen er typisk et salt fremstilt fra en organisk syre eller base. Representative buffere omfatter salter av organiske syrer, f.eks. salter av sitronsyre, askorbinsyre, glukonsyre, karbonsyre, vinsyre, ravsyre, eddiksyre eller ftalsyre; Tris, trometaminhydroklorid eller fosfatbuffere. Foretrukne buffere for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er salter av organiske syrer, f.eks. sitrat. 3 I tillegg kan anti-tnf-antistoffsammensetninger ifølge oppfinnelse omfatte polymere eksipienser/tilsetningsstoffer som polyvinylpyrrolidoner, fikoller (et polymert sukker), dekstrater (f.eks. cyklodekstriner, som 2-hydroksypropyl- -cyklodekstrin), polyetylenglykoler, smaksmidler, antimikrobielle midler, søtemidler, antioksidanter, antistatiske midler, detergenter (f.eks. polysorbaner som TWEEN og TWEEN 80 ), lipider

45 44 (f.eks. fosfolipider, fettsyrer), steroider (f.eks. kolesterol) og chelateringsmidler (f.eks. EDTA). Disse og andre kjente farmasøytiske ekspienser og/eller tilsetningsstoffer som er egnede for anvendelse i anti-tnf-antistoffsammensetningen, delsammensetningen eller variantsammensetningen ifølge oppfinnelsen er kjente innen faget, f.eks. som opplistet i Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19. utgave, Williams & Williams (199), og i Physician s Desk Reference, 2. utgave, Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Foretrukne bærer- eller eksipiensmaterialer er karbohydrater (f.eks. sakkarider og alditoler) og buffere (f.eks. sitrat) eller polymere midler Utforminger Som bemerket ovenfor, tilveiebringes stabile utforminger, som fortrinnsvis er en fosfatbuffer med natriumklorid eller et utvalgt salt, så vel som konserverte løsninger og utforminger som inneholder et konserveringsmiddel, så vel som konserverte utforminger for flergangsbruk egnede for farmasøytisk eller veterinærmedisinsk anvendelse, som omfatter minst et anti-tnf-antistoff i en farmasøytisk aksepterbar utforming. Konserverte utforminger inneholder minst et kjent konserveringsmiddel, om ønskelig utvalgt fra gruppen som består av minst en fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, klorkresol, benzylalkohol, fenylkvikksølvnitritt, fenoksyetanol, formaldehyd, klorbutanol, magnesiumklorid (f.eks. heksahydrat), alkylparaben (metyl, etyl, propyl, butyl og lignende), benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, natriumdehydroacetat og timerosal, eller blandinger av disse i et vandig fortynningsmiddel. Enhver egnet konsentrasjon eller blanding kan anvendes som kjent innen faget, f.eks. 0,001-%, eller et hvert område eller enhver verdi deri, f.eks., men ikke begrenset til, 0,001, 0,003, 0,00, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,0, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, eller et hvert område eller enhver verdi deri. Ikke-begrensende eksempler omfatter intet konserveringsmiddel, 0,1-2% m-kresol (f.eks. 0,2, 0,3, 0,4, 0,, 0,9, 1,0%), 0,1-3% benzylalkohol (f.eks. 0,, 0,9, 1,1, 1,, 1,9, 2,0, 2,%), 0,001-0,% timerosal (f.eks. 0,00, 0,01), 0,001-2,0% fenol (f.eks. 0,0, 0,2, 0,28, 0,, 0,8, 1,0%), 0,000-1,0% alkylparaben(er) (f.eks. 0,0007, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,00, 0,007, 0,009, 0,01, 0,02, 0,0, 0,07, 0,09, 0,1, 0,2 0,3, 0,, 0,7, 0,9, 1,0%) og lignende. Som bemerket ovenfor, kan det tilveiebringes en fremstilt gjenstand som omfatter innpakningsmateriale og minst en ampulle som omfatter en løsning av minst et anti-tnf-

46 4 antistoff med de foreskrevne buffere og/eller konserveringsmiddel, om ønskelig i et vandig fortynningsmiddel, hvori innpakningsmaterialet omfatter en merkelapp som angir at løsningen kan lagres over et tidsrom på 1, 2, 3, 4,, 6, 9, 12, 18,, 24,, 36, 40, 48, 4, 60, 66, 71 timer eller mer. Videre kan det skaffes tilveie en fremstilt gjenstand som omfatter innpakningsmateriale, en første ampulle som omfatter minst et frysetørket anti-tnf-antistoff og en andre ampulle som omfatter et vandig fortynningsmiddel eller en foreskrevet buffer eller et konserveringsmiddel, hvori innpakningsmaterialet omfatter en merkelapp som instruerer pasienten vedrørende rekonstituering av anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene i det vandige fortynningsmiddel, slik at det dannes en løsning som kan lagres over et tidsrom på 24 timer eller mer. 1 Anti-TNF-antistoffet eller -antistoffene som anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være fremstilt ved rekombinante midler, innbefattet fra pattedyrcellepreparater eller transgene preparater, eller de kan være renset fra andre biologiske kilder som beskrevet heri eller som kjent innen faget. Mengden av anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene i produktet omfatter mengder som etter rekonstituering gir konsentrasjoner på fra tilnærmet 1,0 μg/ml til tilnærmet 00 mg/ml, dersom det foreligger i et flytende/fast system, selv om lavere og høyere konsentrasjoner fungerer, og avhenger av den påtenkte tilførselsbærer, f.eks. vil flytende utforminger variere fra transdermale plastere og fremgangsmåter for pulmonar tilførsel, transmukosal tilførsel eller tilførsel via osmotiske pumper eller mikropumper. 2 Det vandige fortynningsmiddel omfatter fortrinnsvis videre et farmsøytisk aksepterbart konserveringsmiddel. Foretrukne konserveringsmidler omfatter konserveringsmidler utvalgt fra gruppen som består av fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, klorkresol, benzylalkohol, alkylparaben (metyl, etyl, propyl, butyl og lignende), benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, natriumdehydroacetat og timerosal, eller blandinger av disse. Konsentrasjonen av konserveringsmiddel som anvendes i utformingen er en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å gi en antimikrobiell virkning. Denne konsentrasjonen avhenger av det valgte konserveringsmiddel og kan lett fastsettes av den erfarne fagperson. 3 Andre eksipienser, f.eks. isotonisitetsmidler, buffere, antioksidanter og konserveringsfremmende midler, kan om ønskelig og fortrinnsvis tilsettes til fortynningsmidlet. Et isotonisitetsmiddel, f.eks. glyserin, anvendes vanligvis i kjente konsentrasjoner. En fysiologisk tolererbar buffer tilsettes fortrinnsvis for å gi forbedret ph-kontroll. Utformingene kan dekke et bredt ph-område, f.eks. fra tilnærmet ph 4 til tilnærmet ph,

47 46 med et foretrukket område fra tilnærmet ph til tilnærmet ph 9 og et mest foretrukket område fra tilnærmet 6,0 til tilnærmet 8,0. Fortrinnsvis har utformingene en ph på mellom tilnærmet 6,8 og tilnærmet 7,8. Foretrukne buffere omfatter fosfatbuffere, mest foretrukket natriumfosfat, spesielt foretrukket fosfatbufret saltvann (PBS). 1 Andre tilsetningsstoffer, f.eks. farmasøytisk aksepterbare solubiliseringsmidler som Tween (polyoksyetylen () sorbitan-monolaurat), Tween 40 (polyoksyetylen () sorbitan-monopalmitat), Tween 80 (polyoksyetylen () sorbitan-monooleat), Pluronic F68 (polyoksyetylen-polyoksypropylen-blokk-kopolymerer), og PEG (polyetylenglykol) eller ikke-ioniske detergenter som polysorbat eller 80 eller poloksamer 184 eller 188, Pluronic polyoler, andre blokk-kopolymerer og chelatorer som EDTA og EGTA, kan om ønskelig tilsettes til utformingene eller sammensetningene for å redusere aggregering. Disse tilsetningsstoffene er spesielt anvendbare dersom en pumpe eller en plastbeholder anvendes for tilførsel av sammensetningen. Nærvær av en farmasøytisk aksepterbar detergent reduserer proteinets tendens til å aggregere. 2 Utformingene kan fremstilles ved en prosess som omfatter sammenblanding av minst et anti-tnf-antistoff og et konserveringsmiddel utvalgt fra gruppen som består av fenol, m-kresol, p-kresol, o-kresol, klorkresol, benzylalkohol, alkylparaben, (metyl, etyl, propyl, butyl og lignende), benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, natriumdehydroacetat og timerosal, eller blandinger av disse i et vandig fortynningsmiddel. Sammenblandingen av anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene og konserveringsmiddel i et vandig fortynningsmiddel utføres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter for oppløsning og sammenblanding. For fremstilling av en egnet sammensetning, blandes f.eks. en utmålt mengde av minst et anti-tnf-antistoff i en bufret løsning med det ønskede konserveringsmiddel i en bufret løsning i mengde som er tilstrekkelige til å gi den ønskede konsentrasjon av protein og konserveringsmiddel. Variasjoner av denne prosessen vil være åpenbare for gjennomsnittsfagfolk. For eksempel er rekkefølgen som bestanddelene tilsettes i, hvorvidt ytterligere tilsetningsstoffer anvendes og ph og temperatur som utformingen fremstilles ved alle faktorer som kan optimaliseres for den anvendte konsentrasjon og tilførselsmåte. 3 Utformingene ifølge kravene kan gis til pasienter som klare løsninger eller som to ampuller som omfatter en ampulle med minst et frysetørket anti-tnf-antistoff, som rekonstitueres med en andre ampulle som inneholder vann, et konserveringsmiddel og/eller eksipienser, fortrinnsvis en fosfatbuffer og/eller natriumklorid og et utvalgt salt i et vandig fortynningsmiddel. Denne ene ampulle med løsningen eller de to ampullene

48 47 som krever rekonstituering kan gjenbrukes flere ganger og kan være tilstrekkelig for en enkelt eller flere sykluser med pasientbehandling, og kan således gi et mer hendig behandlingsskjema enn hva som nå er tilgjengelig. De fremstilte gjenstander er anvendbare for tilførsel over et tidsrom på fra umiddelbart til 24 timer eller mer. Følgelig, byr de fremstilte gjenstander ifølge kravene på vesentlige fordeler for pasienten. Utforminger ifølge oppfinnelsen kan om ønskelig lagres trygt ved temperaturer på fra tilnærmet 2 til tilnærmet 40ºC og bibeholde proteinets biologiske aktivitet over lengre tidsrom, noe som tillater en merkelapp som angir at løsningen kan lagres og/eller anvendes over et tidsrom på 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 eller 96 timer eller mer. Dersom et fortynningsmiddel med konserveringsmiddel anvendes, kan merkelappen angi bruk opptil 1-12 måneder, et halvt år, et og et halvt år og/eller to år. 1 2 Løsningene av minst et anti-tnf-antistoff i oppfinnelsen kan fremstilles ved en prosess som omfatter sammenblanding av minst et antistoff i et vandig fortynningsmiddel. Sammenblandingen utføres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter for oppløsning og sammenblanding. For fremstilling av et egnet fortynningsmiddel blandes f.eks. en utmålt mengde av minst et antistoff i vann eller buffer i mengder som er tilstrekkelige til at proteinet og, om ønskelig, konserveringsmidlet eller bufferen erholdes i de ønskede konsentrasjoner. Variasjoner av denne prosessen vil være åpenbare for gjennomsnittsfagfolk. For eksempel er rekkefølgen som bestanddelene tilsettes i, hvorvidt ytterligere tilsetningsstoffer anvendes og temperatur og ph som sammensetningen fremstilles ved, alle faktorer som kan optimaliseres for den anvendte konsentrasjon og tilførselsmåte. Produktene kan tilføres pasienter som klare løsninger eller som to ampuller som omfatter en ampulle med minst et frysetørket anti-tnf-antistoff som rekonstitueres med en andre ampulle som inneholder det vandige fortynningsmiddel. Den ene ampulle med løsningen eller de to ampullene som krever rekonstituering kan gjenbrukes flere ganger og kan være tilstrekkelig for en enkelt eller flere sykluser med pasientbehandling, og byr således på et mer hendig behandlingsskjema enn hva som i dag er tilgjengelig. 3 Produktene ifølge kravene kan tilføres pasientene indirekte ved at man leverer til apoteker, klinikker eller andre tilsvarende institusjoner og fasiliteter, klare løsninger eller to ampuller som omfatter en ampulle med minst et frysetørket anti-tnf-antistoff som rekonstitueres med en andre ampulle som inneholder det vandige fortynningsmiddel. Den klare løsning kan i dette tilfellet utgjøre opptil 1 liter eller mer, slik at det tilveiebringes

49 48 et stort reservoar som mindre porsjoner av løsningen av antistoffet eller antistoffene kan tas ut fra en eller flere ganger for overføring til mindre ampuller, og videreføres fra apoteket eller klinikken til kundene og/eller pasientene. 1 Anerkjente innretninger som omfatter slike enampullesystemer omfatter penninjeksjonsinnretninger for tilførsel av en løsning som BD Pens, BD Autinjector, Humaject. NovoPen, B-D Pen, AutoPen og OptiPen, GenotropinPen, Genotronorm Pen, Humatro Pen, Reco-Pen, Referon Pen, Biojector, iject, J-tip Needle-Free Injector, Intraject, Medi-Ject, f.eks. som fremstilt eller utviklet av Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, Disetronic (Burgdorf, Sveits, Bioject, Portland, Oregon ( National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, Anerkjente innretninger som omfatter et toampullesystem omfatter penninjeksjonssystemer for rekonstituering av et frysetørket medikament i en patron for tilførsel av den rekonstituerte løsning, f.eks. HumatroPen. 2 Produktene omfatter innpakningsmateriale. Innpakningsmaterialet gir i tillegg til den informasjon som kreves av de regulerende myndigheter betingelsene som produktet kan anvendes under. Innpakningsmaterialet ifølge foreliggende oppfinnelse gir pasienten instruksjoner vedrørende rekonstituering av anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene i det vandige fortynningsmiddel slik at det dannes en løsning, og vedrørende anvendelse av løsningen over et tidsrom på 2-24 timer eller mer for det flytende/faste toampulleprodukt. For det oppløste produkt i en ampulle angir merkelappen at løsningen kan anvendes over et tidsrom på 2-24 timer eller mer. Produktene er anvendbare for human farmasøytisk produktanvendelse. 3 Utformingene kan fremstilles ved en prosess som omfatter sammenblanding av minst et anti-tnf-antistoff og en uvalgt buffer, fortrinnsvis en fosfatbuffer, som inneholder natriumklorid eller et utvalgt salt. Sammenblandingen av minst et antistoff og buffer i et vandig fortynningsmiddel utføres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter for oppløsning og sammenblanding. For fremstilling av en egnet sammensetning blandes f.eks. en utmålt mengde av minst et antistoff i vann eller buffer med det ønskede bufringsmiddel i vann i mengder som er tilstrekkelige til å tilveiebringe proteinet og bufferen i den ønskede konsentrasjon. Variasjoner av denne prosessen vil være åpenbare for gjennomsnittsfagfolk. For eksempel er rekkefølgen som bestanddelen tilsettes i, hvorvidt ytterligere tilsetningsstoffer anvendes og temperatur og ph som sammenset-

50 49 ningen fremstilles ved, alle faktorer som kan optimaliseres for den anvendte konsentrasjon og tilførselsmåte. De stabile eller konserverte sammensetningene ifølge kravene kan gis til pasienter som klare løsninger eller som to ampuller som omfatter en ampulle med minst et frysetørket anti-tnf-antistoff som rekonstitueres med en andre ampulle som inneholder et konserveringsmiddel eller en buffer og eksipienser i et vandig fortynningsmiddel. Denne ene ampulle med løsningen eller de to ampullene som krever rekonstituering kan gjenbrukes flere ganger og kan være tilstrekkelig for en enkelt eller flere sykluser med pasientbehandling, og byr således på et mer hendig behandlingsskjema enn hva som i dag er tilgjengelig. 1 Anti-TNF-antistoffet eller -antistoffene i enten den stabile eller den konserverte utforming eller løsning som beskrives heri, kan tilføres til en pasient via en rekke tilførselsfremgangsmåter, innbefattet subkutan eller intramuskulær injeksjon, transdermal, pulmonar, transmukosal tilførsel, ved implantering, via en osmotisk pumpe, en patron eller mikropumpe, eller ved andre midler som er anerkjente blant erfarne fagfolk, som velkjent innen faget. 2 Terapeutiske anvendelser Det er også mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en TNF-forbundet sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient som kjent innen faget eller som beskrevet heri, ved anvendelse av minst et dualt integrinantistoff. Det er også mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en TNF-forbundet sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, innbefattet, men ikke begrenset til, minst en av fedme, en immunforbundet sykdom, en kardiovaskulær sykdom, en infeksiøs sykdom, en ondartet sykdom eller en neurologisk sykdom. 3 Videre er det mulig å tilveibringe en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en immunforbundet sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, innbefattet, men ikke begrenset til, minst en av reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt, juvenil reumatoid artritt med systemisk start, psoriatisk artritt, ankyloserende spondilitt, magesår, seronegative artropatier, osteoartritt, inflammatorisk tarmsykdom, ulcerøs kolitt, systemisk lupus erytematosis, antifosfolipidsyndrom, iridocyklitt/uveitt/optisk

51 neuritt, idiopatisk pulmonar fibrose, systemisk vaskulitt/wegener s granulomatose, sarkoidose, orchitt/vasektomireverseringsfremgangsmåter, allergiske/atopiske sykdommer, astma, allergisk rinitt, eksem, allergisk kontraktdermatitt, allergisk konjunktivitt, hypersensitivitetspneumonitt, transplantasjoner, organtransplantatrejeksjon, graft-versushost -sykdom, systemisk inflammatorisk responssyndrom, sepsissyndrom, gram-positiv sepsis, gram-negativ sepsis, dyrkningsnegativ sepsis, fungal sepsis, neutropen feber, urosepsis, meningokokkemi, traume/blødning, brannsår, eksponering overfor ioniserende stråling, akutt pankreatitt, adult respiratory distress syndrom, reumatoid artritt, alkoholindusert hepatitt, kroniske inflammatoriske sykdomstilstander, sarkoidose, Crohn s sykdom, sigdcelleanemi, diabetes, nefrose, atopiske sykdommer, hypersensitivitetsreaksjoner, allergisk rinitt, høyfeber, helårsrinitt, konjunktivitt, endometriose, astma, urtikaria, systemisk anafalakse, dermatitt, pernisiøs anemi, hemolyttisk sykdom, trombocytopeni, transplantatrejeksjon av et hvert organ eller vev, nyretransplantatrejeksjon, hjertetransplantatrejeksjon, levertransplantatrejeksjon, bukspyttkjerteltransplantatrejeksjon, lungetransplantatrejeksjon, benmargstranplantat (BMT)-rejeksjon, hudallotransplantatrejeksjon, brusktransplantatrejeksjon, bentransplantatrejeksjon, tynntarmstransplantatrejeksjon, rejeksjon av transplantert føtal brisel, paratyroid transplantatrejeksjon, xenotransplantatrejeksjon av et hvert organ eller vev, allotransplantatrejeksjon, anti-reseptorhypersensitivitetsreaksjoner, Graves sykdom, Raynoud s sykdom, type B insulinresistent diabetes, astma, myastenia gravis, antistofformidlet cytotoksisitet, type III hypersensitivitetsreaksjoner, systemisk lupus erytematosus, POEMS syndrom (polyneuropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, og hudendringssyndrom), polyneuropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, hudendringssyndrom, antifosfolipidsyndrom, pemfigus, skleroderm, blandet bindevevssykdom, idiopatisk Addison s sykdom, diabetes mellitus, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, vitiligo, vaskulitt, post-mi-kardiotomisyndrom, type IV hypersensitivitet, kontaktdermatitt, hypersensitivitetspneumonitt, allotransplantatrejeksjon, granulomer grunnet intracellulære organismer, medikamentsensitivitet, metabolsk/idiopatisk, Wilson s sykdom, hemakromatose, alfa-1-antitrypsindefisiens, diabetisk retinopati, Hashimoto s tyroiditt, osteoporose, hyptalamus-hypofyse-binyreakseevaluering, primær gallecirrhose, tyroiditt, encefalomyelitt, kakeksi, cystisk fibrose, neonatal kronisk lungesykdom, kronisk obstruktiv pulmonar sykdom (COPD), familiær hematofagocyttisk lymfohistiocytose, dermatologiske tilstander, psoriasis, alopecia, nefrotisk syndrom, nefritt, glomerulær nefritt, akutt nyresvikt, hemodialyse, uremi, toksisitet, preeklampsi, okt3-behandling, anti-cd3-behandling, cytokinbehandling, kjemoterapi, strålebehandling (f.eks., men ikke begrenset til, asteni, anemi, kakeksi, og lignende), kronisk salicylatintoksikasjon og lignende. Se f.eks. Merck Manual, utgave, Merck & Compa-

52 ni, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., red. 2. utgave, Appleton and Lange, Samford, Conn. (1998, 00) En mulig fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en kardiovaskulær sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr, eller en pasient, innbefatter, men er ikke begrenset til, minst en av hjertelammelsessyndrom, myokardinfarkt, kongestiv hjertesvikt, slag, ischemisk slag, blødning, arteriosklerose, aterosklerose, restenose, diabetisk ateriosklerotisk sykdom, hypertensjon, arteriell hypertensjon, renovaskulære hypertensjon, synkope, sjokk, syfilis i hjerte-karsystemet, hjertesvikt, cor pulmonale, primær pulmonar hypertensjon, hjertearrytmi, ektopiske atriumslag, atriumflimmer, atriumfibrillasjon (vedvarende eller paryksysmal), postperfusjonssyndrom, kardiopulmonar bypassinflammasjonsrespons, katotisk eller multifokal atriumtakykardi, regulær smal QRStakykardi, spesifikke arrytmier, ventrikkelfibrillasjon, His-bundet arytmier, atrioventrikulær blokkering, buntforgreningsblokkering, myokardiale ischemiske forstyrrelser, kransarteriesykdom, angina pectoris, myokard infarkt, kardiomyopati, dilatert kongestiv kardiomyopati, restriktiv kardiomyopati, hjerteklaffsykdommer, endiokarditt, perikardial sykdom, hjertetumorer, aortiske og perifere aneurismer, aortadisseksjon, inflammasjon i aorta, okkulsjon av bukaorta og dens forgreninger, perifere vaskulære forstyrrelser, okklusive arterielle forstyrrelser, perifer aterosklerotisk sykdom, tromboangitis obliterans, funksjonelle perifere arterielle forstyrrelser, Raynaud s fenomen og sykdom, akrocyanose, erytromegali, venesykdommer, venetromboser, åreknuter, arteriovenøs fistel, lymfoderm, lipodem, ustabil angina, reperfusjonsskader, post-pumpesyndrom, ischemi-reperfusjonsskade og lignende. En slik fremgangsmåte kan om ønskelig omfatte tilførsel av en effektiv mengde av en sammensetning eller et farmsøytisk preparat som omfatter minst et anti-tnf-antistoff til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling eller terapi. 3 Videre er det mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en infeksiøs sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, innbefattet, men ikke begrenset til, minst en av: akutt eller kronisk bakterieinfeksjon, akutte og kroniske parasittprosesser eller infeksiøse prosesser, innbefattet bakterieinfeksjoner, virusinfeksjoner og soppinfeksjoner, HIV-infeksjon/HIV-neuropati, meningitt, hepatitt (A, B eller C, eller lignende), septisk artritt, peritonitt, pneumoni, epiglotitt, e. coli 017:h7, hemolyttisk uremisk syndrom/trombolyttisk trombocytopenisk purpura, malaria, dengue-blødningsfeber, leishmaniasis, lepra, toksisk sjokksyndrom, streptokokkmyositt, gasgangrene, mycobacterium tuberculosis, mycobacterium avium intracellulare, pneumocystis carinii pneumonia, inflammatorisk hoftesykdom, orchitt/epidydimitt,

53 2 legionella, lyme-sykdom, influensa A, epstein-barr-virus, vitalforbundet hemafagocyttisk syndrom, vital encefalitt/aseptisk meningitt og lignende Det kan også tilveiebringes en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en ondartet sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, innbefattet, men ikke begrenset til, minst en av: leukemi, akutt leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), B-celle-, T-celle- eller FAB-ALL, akutt myeloid leukemi (AML), kronisk myelocyttisk leukemi (CML), kronisk lymfocyttisk leukemi (CLL), hårcelleleukemi, myelodyplastisk syndrom (MDS), en lymfom, Hodgkin s sykdom, en ondartet lymfom, nonhodgkin s lymfom, Burkitt s lymfom, multippel myelom, Kaposi s sarkom, kolorektal karcinom, pankreatisk karcinom, nasofaryngeal karcinom, ondartet histiocytose, paraneoplastisk syndrom/hyperkalsemi forbundet med ondartede tilstander, faste tumorer, adenokarcinomer, sarkomer, ondartet melanom, hemangiom, metastatisk sykdom, kreftforbundet benresorpsjon, kreftforbundet bensmerte og lignende. Videre er det mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for modulering eller behandling av minst en neurologisk sykdom i en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient, innbefattet, men ikke begrenset til, minst en av: neurodegenerative sykdommer, multippel sklerose, migrenehodepine, AIDS-dementia kompleks, demyelinerende sykdommer som multippel sklerose og akutt transvers myelitt; ekstrapyramidale og cerebellare forstyrrelser, f.eks. lesjoner i kortokospinalsystemet; forstyrrelser i basalganglier eller i cerebellum, hyperkinetiske bevegelsesforstyrrelser som Huntington s Chorea og senile chorea; medikamentinduserte bevegelsesforstyrrelser, f.eks. forstyrrelser indusert av medikamenter som blokkerer CNS-dopaminreseptorer; hypokinetiske bevegelsesforstyrrelser, f.eks. Parkinson s sykdom; progressiv supranukleær lammelse; strukturelle lesjoner i cerebellum; spinocerebellar degenerering, f.eks. spinal ataksi, Friedreich s ataksi, degenerasjoner i cerebellumkorteks, degenerasjon i multiple systemer (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager og Machado-Joseph); systemiske forstyrrelser (Refsum s sykdom, abetalipoprotemi, ataksi, telangiektasia, og mitokondriell flersystemsforstyrrelse); demyelinerende forstyrrelser som multippel sklerose, akutt transvars myelitt; og forstyrrelser i de motoriske enheter, f.eks. neurogene muskulære artrofier (degenerasjon av fremre hornceller, f.eks. amyotrofisk lateral sklerose, infantil spinal muskelatrofi og juvenil spinal muskelatrofi); Alzheimer s sykdom; Down s syndrom som middelaldrende; diffus Lewy-klumpsykkdom; senil dementia av Lewy-klumptype; Wernicke- Korsakoff-syndrom; kronisk alkoholisme; Creutzfeldt-Jakob-sykdom; subakutt skleroserende panencefalitt; Hallerrorden-Spatz-sykdom; og Dementia publistica og lignende. En slik fremgangsmåte kan om ønskelige omfatte tilførsel av en effektiv mengde av en

54 3 sammensetning eller et farmasøytisk preparat som omfatter minst et TNV-antistoff eller en spesifisert del eller variant derav til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling eller terapi. Se f.eks. the Merck Manual, 16. utgave, Merck & Company, Rahway, NJ (1992) Enhver fremgangsmåte som beskrevet kan omfatte tilførsel av en effektiv mengde av en sammensetning eller et farmasøytisk preparat som omfatter minst et anti-tnf-antistoff til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling eller terapi. En slik fremgangsmåte kan om ønskelig videre omfatte samtidig tilførsel eller kombinasjonsterapi for behandling av slike immunsykdommer, hvori tilførselen av et eller flere anti-tnf-antistoffer eller spesifiserte deler eller varianter av disse videre omfatter forutgående, samtidig og/eller etterfølgende tilførsel av minst en forbindelse utvalgt blant en TNF-antagonist (f.eks., men ikke begrenset til, et TNFantistoff eller et fragment derav, en løselig TNF-reseptor eller et fragment derav, fusjonsproteiner derav eller en lavmolekylær TNF-antagonist), et antireumatisk middel (f.eks. metotreksat, auranofin, eurotioglukose, azatioprin, etanercept, gullnatriumtiomalat, hydroksykloroquinsulfat, leflunomid, sulfasalzin), et muskelrelakserende middel, et narkotisk middel, et ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID), et analgetisk middel, et anestetisk middel, et beroligende middel, et lokalbedøvende middel, et neuromuskulært blokkerende middel, et anti-mikrobielt middel (f.eks. aminoglykosid, et antifungalt middel, et antiparasittmiddel, et antiviralt middel, et karbapenem, cefalosporin, et fluorquinolon, et makrolid, et penicillin, et sulfonamid, et tetracyklin, et annet antimikrobielt middel), et antipsoriasismiddel, et kortikosteroid, et anabolsk steroid, et diabetesforbundet middel, et mineral, et næringsstoff, et tyroidmiddel, et vitamin, et kalsiumforbundet hormon, et antidiarretisk middel, et hostemiddel, et antiemetisk middel, et antiulcermiddel, et avføringsmiddel, et antikoagulasjonsmiddel, et erytropoietin (f.eks. epoetin alfa), et filgrastim (f.eks. G-CSF, Neupogen), et sargramostim (GM-CSF, leukin), en immunisering, et immunglobulin, et immunsupprimerende middel (f.eks. basiliksimab, cyklosporin, deklizumab), et veksthormon, et hormonerstatningsmedikament, en østrogenreseptormodulator, et mydriatisk middel, et cykloplegisk middel, et alkylerende middel, en antimetabolitt, en mitoseinhibitor, et radioaktivt merket farmasøytisk middel, et antidepressjonsmiddel, et antimanisk middel, et antipsykotisk middel, et anxiolyttisk middel, et hypnotisk middel, et sympatomimetisk middel, et stimulerende middel, dodepezil, takrin, et astmamedikament, en betaagonist, et inhallert steroid, en leukotrieninhibitor, et metylxantin, et kromolyn, et epinefrin eller en epinefrinanalog, dornase alfa (Polmozyme), et cytokin eller en cytokinantagonist. Egnede doser er velkjente innen faget. Se f.eks. Wells et al., red., Pharma-

55 4 1 cotherapy Handbook, 2. utgave, Appleton og Lange, Stamford, CT (00); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 00, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (00). TNF-antagonister som er egnede for sammensetninger, kombinasjonsbehandling, samtidig tilførsel, innretninger og/eller fremgangsmåter (som videre kan omfatte minst et antistoff eller en spesifisert del eller variant derav ifølge foreliggende oppfinnelse) kan omfatte, men er ikke begrenset til, anti-tnfantistoffer, antigenbindende fragmenter av disse, og reseptormolekyler som bindes spesifikt til TNF; forbindelser som forhindrer og/eller inhiberer TNF-syntese, TNFfrigivning eller virkningen av TNF på målceller, f.eks. thalidomid, tenidap, fosfodiesteraseinhibitorer (f.eks. penntoksifyllin og rolipram), A2b-adenosinreseptoragonister og A2b-adenosinreseptorforsterkere; forbindelser som forhindrer og/eller inhiberer TNFreseptorsignallisering, f.eks. mitogenaktivert protein (MAP) kinaseinhibitorer; forbindelser som blokkerer og/eller inhiberer spalting av TNF i membranen, f.eks. metalloproteinaseinhibitorer; forbindelser som blokkerer og/eller inhiberer TNF-aktivitet, f.eks. angiotensinkonverterende enzym (ACE) inhibitorer (f.eks. kaptopril); og forbindelser som blokkerer og/eller inhiberer TNF-produksjon og/eller syntese, f.eks. MAPkinaseinhibitorer. 2 Som anvendt heri, vil et tumornekrosefaktorantistoff, TNF-antistoff, TNF!- antistoff eller et fragment derav og lignende, redusere, blokkere, inhibere, hindre eller interferere med TNF!-aktivitet in vitro, in situ og/eller, fortrinnsvis, in vivo. For eksempel, kan et egnet humant TNF-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse binde TNF!, og omfatter anti-tnf-antistoffer, antigenbindende fragmenter av disse og spesifiserte mutanter eller domener fra disse som bindes spesifikt til TNF!. Et egnet TNFantistoff eller et fragment derav, kan også redusere, blokkere, hindre, interferere med, forhindre og/eller inhibere syntese av TNF-RNA, -DNA eller -protein, TNF-frigivning, TNF-reseptorsignallisering, spalting av TNF i membranen, TNF-aktivitet, TNFproduksjon og/eller TNF-syntese. 3 Det chimere antistoff ca2 består av det antigenbindende variable domenet fra det nøytraliserende anti-human TNF!-IgG1-antistoff med høy affinitet fra mus som betegnes A2, og de konstante områder fra et humant IgG1 kappa-immunglobulin. Det humane IgG1 Fc-området forbedrer allogenisk antistoffeffektorfunksjon, forlenger halveringstiden i sirkulasjonen og reduserer antistoffets immunogenisitet. Aviditet og epitopspesifisitet for det chimere antistoff ca2 er avledet fra det variable området i museantistoffet A2. I en spesiell utførelse, er en foretrukket kilde for nukleinsyrer som koder for det variable området i museantistoff A2 hybridomcellelinjen A2.

56 Chimert A2 (ca2) nøytraliserer den cytotoksiske virkning av både naturlig og rekombinant human TNF! på en doseavhengig måte. Ut fra bindingsanalyser av det chimere antistoff ca2 og rekombinant human TNF! ble affinitetskonstanten for det chimere antistoff ca2 beregnet til 1,04x M -1. Fremgangsmåter for bestemmelse av monoklonale antistoffers spesifisitet og affinitet ved konkurrerende inhibering kan finnes i Harlow et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al., red., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. og Wiley Interscience, New York, ( ); Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al., red., Curent Protocols in Molecular Biology,,Wiley Interscience, New York ( ); og Muller, Meth. Enzymol., 92: (1983). 1 Det monoklonale museantistoff A2 kan dannes av en cellelinje som betegnes c134a. Det chimere antistoff ca2 produseres av en cellelinje som betegnes c168a. 2 Ytterligere eksempler på monoklonale anti-tnf-antistoffer som kan anvendes er beskrevet innen faget (se f.eks. U.S. patentskrift nr.,231,024; Möller, A. et al., Cytokine 2(3): (1990); U.S. patentsøknad nr. 07/943,82 (innlevert 11. september 1992); Rathjen et at., Internasjonal patentskrift WO 91/078 (publisert 21. februar 1991); Rubin et al., EPO patentskrift nr (publisert 22. april 1987); Yone et al., EPO patentskrift nr (26. oktober 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137: (1986); Meager et al., Hybridoma 6:-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6: (1987); og Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96:7-62 (1987). 3 TNF-reseptormolekyler Foretrukne TNF-reseptormolekyler som er anvendbare er reseptormolekyler som binder TNF! med høy affinitet (se f.eks. Feldmann et al., Internasjonalt patentskrift WO 92/ (publisert. april 1992); Schall et al., Cell 61: (1990); og Loetscher et al., Cell 61:31-39 (1990), og besitter om ønskelig lav immunogenisitet. Nærmere bestemt er TNF-celleoverflatereseptorene på kda (p TNF-R) og 7 kda (p7 TNF-R) anvendbare. Avkortede former av disse reseptorene som omfatter de ekstracellulære domener (ECD) fra reseptorene eller funksjonelle deler av disse (se f.eks. Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223: (1994)), er også anvendbare. Avkortede former av TNF-reseptorene som omfatter ECD har blitt påvist i urin og serum som TNF!- inhiberende og -bindende proteiner på kda og 40 kda (Engelmann, H. et al., J. Biol.

57 6 Chem. 26: (1990)). Multimere TNF-reseptormolekyler og TNFimmunreseptorfusjonsmolekyler samt derivater, fragmenter eller deler av disse er ytterligere eksempler på TNF-reseptormolekyler som er anvendbare i fremgangsmåtene og sammensetningene som beskrevet her. TNF-reseptormolekylene som kan anvendes i oppfinnelsen særpreges ved deres evne til å behandle pasienter over lengre tidsrom med god til utmerket lindring av symptomer og lav toksisitet. Lav immunogenisitet og/eller høy affinitet, så vel som andre ikke-definerte egenskaper, kan bidra til de oppnådde terapeutiske resultater. 1 Multimere TNF-reseptormolekyler som er anvendbare omfatter hele eller en funksjonell del av ECD fra to eller flere TNF-reseptorer, sammenkoblet via en eller flere polypeptidlinkere eller andre ikke-peptidlinkere, f.eks. polyetylenglykol (PEG). De multimere molekylene kan videre omfatte et signalpeptid fra et utskilt protein for styring av ekspresjonen av det multimere molekyl. Disse multimere molekylene og fremgangsmåter for fremstilling av dem er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 08/437,33 (innlevert 9. mai 199), 2 TNF-immunreseptorfusjonsmolekyler som er anvendbare i fremgangsmåtene og sammensetningene beskrevet her omfatter minst en del av et eller flere immunglobulinmolekyler og hele eller en funksjonell del av en eller flere TNF-reseptor. Disse immunreseptorfusjonsmolekylene kan være oppbygget som monomerer eller hetero- eller homomultimerer. Immunreseptorfusjonsmolekylene kan også være monovalente eller multivalente. Et eksempel på et slikt TNF-immunreseptorfusjonsmolekyl er TNFreseptor/IgG-fusjonsprotein. TNF-immunreseptorfusjonsmolekyler og fremgangsmåter for fremstilling av disse er beskrevet innen faget (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21: (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3-39 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174: (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: (1994); Butler et al., Cytokine 6(6): (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:40-48 (1994); Beutler et al., U.S. patentskrift nr.,447,81; og U.S. patentsøknad nr. 08/442,133 (innlevert 16. mai 199). Fremgangsmåter for fremstilling av immunreseptorfusjonsmolekyler kan også finnes i Capon et al., U.S. patentskrift nr.,116,964; Capon et al., U.S. patentskrift nr.,22,38; og Capon et al., Nature 337:2-31 (1989). 3 En funksjonell ekvivalent, et derivat, et fragment eller et område fra et TNFreseptormolekyl viser til den del av TNF-reseptormolekylet eller den del av TNFreseptormolekylsekvensen som koder for TNF-reseptormolekylet, som er av tilstrekke-

58 7 lig størrelse og omfatter tilstrekkelig sekvens til at den funksjonelt ligner TNFreseptormolekyler som kan anvendes (f.eks. binder TNF med høy affinitet og besitter lav immunogenisitet). En funksjonell ekvivalent av et TNF-reseptormolekyl omfatter også modifiserte TNF-reseptormolekyler som funksjonelt ligner TNF-reseptormolekyler som kan anvendes (som f.eks. binder TNF med høy affinitet og besitter lav immunogenisitet). For eksempel, kan en funksjonell ekvivalent av et TNF-reseptormolekyl inneholde et TAUST kodon eller en eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller - addisjoner (f.eks. erstatning av en sur aminosyre med en annen sur aminosyre, eller erstatning av et kodon som koder for en hydrofob aminosyre ved et annet kodon som koder for den samme eller en annen hydrofob aminosyre). Se Ausubel et al., Current Procotols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. og Wiley-Interscience, New York ( ). 1 Cytokiner omfatter et hvert kjent cytokin. Se f.eks. CopewithCytokines.com. Cytokinantagonister omfatter, men er ikke begrenset til, et hvert antistoff, antistoffragment eller antistoffetterlignende molekyl, enhver løselig reseptor, reseptorfragment eller reseptoretterlignende molekyl, enhver lavmolekylær antagonist eller enhver kombinasjon av disse. 2 3 Terapeutisk behandling Enhver fremgangsmåte beskrevet heri kan omfatte en fremgangsmåte for behandling av en TNF-formidlet forstyrrelse, som omfatter tilførsel av en effektiv mengde av en sammensetning eller farmasøytisk preparat som omfatter minst et anti-tnf-antistoff til en celle, et vev, et organ, et dyr eller en pasient med behov for slik modulering, behandling eller terapi. En slik fremgangsmåte kan om ønskelig videre omfatter samtidig tilførsel eller kombinasjonsbehandling for behandling av slike immunsykdommer, hvori tilførselen av et eller flere anti-tnf-antistoffer eller spesifisierte deler eller varianter av disse videre omfatter forutgående, samtidig og/eller påfølgende tilførsel av minst en forbindelse utvalgt blant en TNF-antagonist (f.eks., men ikke begrenset til, et TNF-antistoff eller et fragment derav, en løselig TNF-reseptor eller et fragment derav, fusjonsproteiner derav eller en lavmolekylær TNF-antagonist), et antireumatisk middel (f.eks. metotreksat, auranofin, aurotioglukose, azatioprin, etanercept, gullnatriumtiomalat, hydroksykloroquinsulfat, leflunomid, sulfasalzin), et muskelrelakserende middel, et narkotisk middel, et ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID), et analgetisk middel, et anestetisk middel, et beroligende middel, et lokalbedøvende middel, et neuromuskulært blokkerende middel, et antimikrobielt middel (f.eks. aminoglykosid, et antifungalt middel, et antiparasittmiddel, et antiviralt middel, et karbapenem, cefalospo-

59 8 1 rin, et fluorquinolon, et makrolid, et penicillin, et sulfonamid, et tetracyklin, et annet antimikrobielt middel), et antipsoriasismiddel, et kortikosteroid, et anabolsk steroid, et diabetesforbundet middel, et mineral, et næringsstoff, et tyroidmiddel, et vitamin, et kalsiumforbundet hormon, et antidiarretisk middel, et hostemiddel, et antiemetisk middel, et antiulcermiddel, et avføringsmiddel, et antikoagulasjonsmiddel, et erytropoietin (f.eks. epoetin alfa), et filgrastim (f.eks. G-CSF, Neupogen), et sargramostim (GM-CSF, leukin), en immunisering, et immunglobulin, et immunsupprimerende middel (f.eks. basiliksimab, cyklosporin, daklizumab), et veksthormon, et hormonerstatningsmedikament, en østrogenreseptormodulator, et medriatisk middel, et cykloplegisk middel, et alkylerende middel, en antimetabolitt, en mitoseinhibitor, et radioaktivt merket farmasøytisk middel, et antidepressjonsmiddel, et antimanisk middel, et antipsykotisk middel, et anksiolyttisk middel, et hypnotisk middel, et sympatomimetisk middel, et stimulerende middel, donepezil, takrin, et astmamedikament, en beta-agonist, et inhallert steroid, en leukotrieninhibitor, et meylxantin, et kromolyn, et epinefrin eller en epinefrinanalog, dornase alfa (Pulmozym), et cytokin eller en cytokinantagonist. 2 3 Behandling av patologiske tilstander oppnås typisk ved tilførsel av en effektiv mengde eller dose av en sammensetning med minst et anti-tnf-antistoff som i alt utgjør gjennomsnittlig et område fra minst tilnærmet 0,01 til 00 mg av minst et anti-tnf-antistoff pr. kg kroppsvekt pr. dose, og fortrinnsvis fra minst tilnærmet 0,1 til 0 mg antistoff/kg kroppsvekt pr. enkeltvise eller multiple tilførsel, avhengig av den spesifikke aktivitet av antistoffet som foreligger i sammensetningen. Alternativt kan den effektive serumkonsentrasjon omfatte fra 0,1 til 000 μg/ml serum pr. enkeltvise eller multiple tilførsel. Egnede doser er kjente blant medisinske utøvere og vil naturligvis avhenge av den gitte sykdomstilstand, den spesifikke aktivitet av sammensetningen som tilførsel og pasienten som behandles. I noen tilfeller kan det for å oppnå den ønskede terapeutiske mengde være nødvendig å foreta gjentatte tilførseler, dvs. gjentatt enkeltvis tilførsel av en gitt målt dose, hvor de enkeltvise tilførseler gjentas inntil den ønskede daglige dose eller virkning oppnås. Foretrukne doser kan om ønskelig omfatte 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49, 0, 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9, 60, 62, 63, 64, 6, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 7, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 8, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 9, 96, 97, 98, 99 og/eller 0-00 mg/kg tilførsel eller et hvert område, enhver verdi eller enhver fraksjon deri, eller for oppnåelse av en serumkonsentrasjon på 0,1, 0,, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2,

60 9 1 1,, 1,9, 2,0, 2,, 2,9, 3,0, 3,, 3,9, 4,0, 4,, 4,9,,0,,,,9, 6,0, 6,, 6,9, 7,0, 7,, 7,9, 8,0, 8,, 8,9, 9,0, 9,, 9,9,,,,,9, 11, 11,, 11,9, 12,0, 12,, 12,9, 13,0, 13,, 13,9, 14,0, 14,, 4,9,,0,,,,9, 6,0, 6,, 6,9, 7,0, 7,, 7,9, 8,0, 8,, 8,9, 9,0, 9,, 9,9,,,,,9, 11, 11,, 11,9, 12, 12,, 12,9, 13,0, 13,, 13,9, 14, 14,, 1, 1,, 1,9, 16, 16,, 16,9, 17, 17,, 17,9, 18, 18,, 18,9, 19, 19,, 19,9,,,,,9, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 3, 40, 4, 0,, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 96, 0, 0, 0, 400, 00, 600, 700, 800, 900, 00, 0, 00, 0, 00, 0, 4000, 400 og/eller 000 μg/ml serum pr. enkeltvise eller multiple tilførsel, eller ethvert område, enhver verdi eller enhver fraksjon deri. Alternativt, kan den tilførte dose variere avhengig av kjente faktorer, f.eks. det gitte middels farmakodynamiske egenskaper, tilførselsmåte og tilførselsvei; pasientens alder, helsetilstand og vekt; symptomens natur og omfang, hva slags type samtidig behandling som gis, behandlingens hyppighet og den ønskede virkning. Vanligvis kan en dose av aktiv bestanddel være fra tilnærmet 0,1 til 0 mg pr. kg kroppsvekt. Vanligvis vil 0,1 til 0, og fortrinnsvis 0,1 til mg pr. kg pr. tilførsel eller i en form for vedvarende frigivelse effektivt gi de ønskede resultater. 2 Som et ikke-begrensende eksempel kan behandling av mennesker eller dyr gis som en engangsdose eller periodevis tilført dose av minst et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse på fra 0,1 til 0 mg/kg, f.eks. 0,, 0,9, 1,0, 1,1, 1,, 2, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 40, 4, 0, 60, 70, 80, 90 eller 0 mg/kg pr. dag på minst en av dagene 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39 eller 40, eller alternativt eller i tillegg, minst en av ukene 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49, 0, 1 eller 2, eller alternativt eller i tillegg, minst en av årene 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19 eller, eller enhver kombinasjon derav, ved anvendelse av enkeltvise doser, gjentatte doser eller infuserte doser. 3 Doseringsformer (sammensetninger) som er egnede for intern tilførsel inneholder generelt fra tilnærmet 0,1 mg til tilnærmet 00 mg aktiv bestanddel pr. enhet eller beholder. I disse farmasøytiske sammensetningene vil den aktive bestanddel normalt foreligge i en mengde på fra tilnærmet 0, til 99,999% (vekt/vekt) basert på sammensetningens totalvekt.

61 60 For parenteral tilførsel kan antistoffet utformes som en løsning, suspensjon, emulsjon eller et frysetørket pulver i assosiasjon med eller tilveiebragt separat fra et farmasøytisk aksepterbart parenteralt bærestoff. Eksempler på slike bærestoffer er vann, saltvann, Ringer s løsning, dekstroseløsning og 1-% humant serumalbumin. Liposomer og ikke-vandige bærere, f.eks. ikke-flyktige oljer, kan også anvendes. Bærestoffet eller frysetørket pulver kan inneholde tilsetningsstoffer som opprettholder isotonisiteten (f.eks. natriumklorid, mannitol) og den kjemiske stabilitet (f.eks. buffere og konserveringsmidler). Preparatet steriliseres ved kjente eller egnede teknikker. Egnede farmasøytiske bærestoffer beskrives i den siste utgave av Remington s Pharmaceutical Sciences, A. Osol, et standardreferanseverk innen feltet. 1 Alternativ tilførsel Mange kjente og utviklede tilførselsmåter kan anvendes, for tilførsel av farmasøytisk effektive mengder av minst et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Selv om pulmonar tilførsel anvendes i den påfølgende beskrivelse, kan andre tilførselsmåter anvendes med egnede resultater. TNF-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres i et bærestoff, som en løsning, en emulsjon, en kolloidal løsning eller en suspensjon, eller som et tørt pulver ved anvendelse av en rekke innretninger og fremgangsmåter som er egnede for tilførsel ved inhallering eller andre måter som beskrives heri eller som er kjente innen faget. 2 3 Parenterale utforminger og tilførsel av disse Utforminger for parenteral tilførsel kan som vanlige eksipienser inneholde sterilt vann eller saltvann, polyalkylenglykoler som polyetylenglykol, vegetabilske oljer, hydrogenerte naftalener og lignende. Suspensjoner i vann eller olje for injeksjon kan fremstilles ved å benytte et egnet emuleringsmiddel eller fuktningsmiddel og et suspensjonsmiddel ifølge kjente fremgangmåter. Injeksjonsmidler kan være ikke-toksiske, ikke oralt tilførbare fortynningsmidler, f.eks. vandige løsninger, sterile injiserbare løsninger, eller suspensjoner i et løsemiddel. Som egnet bærestoff eller løsemiddel tillates vann, Ringer s løsning, isotont saltvann osv., som et ordinært løsemiddel eller suspensjonsløsemiddel kan en steril ikke-flyktig olje anvendes. For disse formål kan enhver type ikke-flyktig olje og fettsyre anvendes, innbefattet naturlige, syntetiske eller semisyntetiske fettoljer eller fettsyrer, naturlige, syntetiske eller semisyntetiske mono-, di- eller triglyserider. Parenteral tilførsel er kjent innen faget og omfatter, men er ikke begrenset til, konvensjonelle injeksjonsmidler, en gassdrevet injeksjonsinnretning uten kanyle som beskrevet

62 61 i U.S. patentskrift nr.,81,198, og en laserbasert perforeringsinnretning som beskrevet i U.S. patentskriftn r.,839, Alternativ tilførsel Det er videre mulig å tilføre minst et anti-tnf-antistoff ved parenterale, subkutane, intramuskulære, intravenøse, intraartikulære, intrabronkiale, intraabdominale, intrakapsulære, intrakartlaginøse, intrakavitære, intraceliale, intracelebellare, intracerebroventrikulære, intrakoliske, intracervikale, intragastriske, intrahepatiske, intramyokardiale, intraosteale, intrapeliske, intraperikardiale, intraperitoneale, intrapleurale, intraprostatiske, intrapulmonare, intrarektale, intrarenaole, intraretinale, intraspinale, intrasynovilae, intratorasiske, intrauterine, intravesikale, bolus, vaginale, rektale, bukkale, sublinguale, intranasale eller transdermale midler. En sammensetning med minst et anti- TNF-antistoff kan fremstilles for anvendelse for parenteral (subkutan, intramuskulær eller intravenøs) eller enhver annen type tilførsel, fortrinnsvis i form av flytende løsninger eller suspensjoner, for anvendelse ved vaginal eller rektal tilførsel, fortrinnsvis i halvfaste former, f.eks., men ikke begrenset til, kremer og stikkpiller; for bukkal eller sublingual tilførsel, f.eks., men ikke begrenset til, i form av tabletter eller kapsler; eller intranasalt, f.eks., men ikke begrenset til, i form av pulvere, nesedråper, aerosoler eller visse midler; eller transdermalt, f.eks., men ikke begrenset til, som en gel, salve, lotion, suspensjon eller et plastertilførselssystem med kjemiske forsterkere, f.eks. dimetylsulfoksid, enten for modifisering av hudstrukturen eller for å øke medikamentkonsentrasjonen i det transdermale plaster (Junginger, et al., i Drug Permeation Enhancement ; Hsieh, D.S., red., s (Marcel Dekker, Inc., Newy York, 1994), eller med oksidasjonsmidler som tillater påføring av sammensetninger som inneholder proteiner og peptider på huden (WO 98/3847) eller påføring av et elektrisk felt som danner kortlivede transportveier, f.eks. elektroporering, eller for å øke mobiliteten av ladede medikamenter gjennom huden, f.eks. iontoforese, eller påføring av ultralyd, f.eks. sonoforese (U.S. patentskrifter nr. 4,9,989 og 4,767,402). 3 Pulmonar/nasal tilførsel For pulmonar tilførsel, tilføres fortrinnsvis sammensetningen med minst et anti-tnfantistoff i en partikkelstørrelse som effektivt når de nedre luftveier i lunge- eller bihuler. Et eller flere anti-tnf-antistoffer kan tilføres via en rekke inhalleringsinnretninger eller nasale innretninger som er kjente innen faget for tilførsel av et terapeutisk middel ved inhallering. Disse innretningene, som kan deponere aerosolsammensetninger i bihuler eller alveoler hos en pasient, omfatter inhallatorer for utmålte doser, nebulisatorer, tørrpulvergeneratorer, sprayinnretninger og lignende. Andre innretninger som er egnede for

63 62 1 å styre pulmonar eller nasal tilførsel av antistoffer er også kjente innen faget. Alle slike innretninger kan benytte sammensetninger som er egnede for tilførsel av et dispergert antistoff i en aerosol. Slike aerosoler kan bestå av enten løsninger (både vandige og ikke-vandige) eller faste partikler. Inhallatorer for utmålte doser, f.eks. inhallatoren Ventolin, benytter typisk en drivgass og krever aktivering under innånding (se f.eks. WO 94/16970, WO 98/3888). Tørrpulverinhallatorer som Turbuhaler (Astra), Rotahaler (Glaxo), Diskus (Glaxo), Spiros (Dura), innretninger som markedsføres av Inhale Therapeutics, og pulverinhallatoren Spinhaler (Fisons), benytter åndeaktivering av et blandet pulver (US Astra, EP Astra, WO 97/86 Glaxo, WO 94/082 Dura, US 4813 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Nebulisatorer som AERx Aradigm, Ultravent -nebulisatoren (Mallinckrodt), og Acorn II nabulisatoren (Marquest Medical Products) (US Aradigm, WO 97/22376), danner aerosoler fra løsninger, mens inhallatorer for utmålte doser, tørrpulverinhallatorer osv., danner aerosoler av små partikler. Disse spesifikke eksemplene på kommersielt tilgjengelige inhalleringsinnretninger er ment å være representative for spesifikke innretninger som er egnede for utførelse. Fortrinnsvis tilførsel en sammensetning som omfatter minst et anti-tnf-antistoff ved hjelp av en tørrpulverinhallator eller en sprayinnretning. Det finnes flere ønskede egenskaper for en inhalleringsinnretning for tilførsel av minst et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel, er det fordelaktig at tilførselen fra inhalleringsinnretningen er pålitelig, reproduserbar og nøyaktig. Inhalleringsinnretningen kan om ønskelig tilføre, små, faste partikler, f.eks. mindre enn tilnærmet μm, fortrinnsvis tilnærmet 1- μm, for god respirerbarhet. 2 Tilførsel av TNF-antistoffsammensetninger som en spray En spray som omfatter en TNF-antistoffproteinsammensetning kan dannes ved å presse en suspensjon eller løsning av minst et anti-tnf-antistoff gjennom en dyse under trykk. Dysens størrelse og konfigurasjon, det påførte trykk og væsketilførselshastigheten kan velges slik at man oppnår den ønskede tilførsel og partikkelstørrelse. En elektrospray kan f.eks. dannes med et elektrisk felt forbundet med kapillær- eller dysetilførsel. Partiklene av sammensetningen med minst et anti-tnf-antistoffprotein som tilføres med en sprayinnretning har fortrinnsvis en partikkelstørrelse på mindre enn tilnærmet μm, fortrinnsvis i området fra tilnærmet 1 μg til tilnærmet μm, og mest foretrukket fra tilnærmet 2 μm til tilnærmet 3 μm. 3 Utforminger av sammensetninger med minst et anti-tnf-antistoffprotein som er egnede for anvendelse med en sprayinnretning omfatter typisk antistoffproteinsammensetning i en vandig løsning i en konsentrasjon på fra tilnærmet 0,1 mg til tilnærmet 0 mg av

64 63 1 minst et anti-tnf-antistoffprotein pr. ml løsning eller mg/g, eller ethvert område eller enhver verdi deri, f.eks., men ikke begrenset til,.1,.2,.3,.4,.,.6,.7,.8,,0, 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 40, 4, 0, 60, 70, 80, 90 eller 0 mg/ml eller mg/g. Sammensetningen kan omfatte midler som eksipienser, buffere, isotonisitetsmidler, konserveringsmidler, detergenter og, fortrinnsvis sink. Utformingen kan også omfatte en eksipiens eller et middel for stabilisering av antistoffproteinet, f.eks. en buffer, et reduksjonsmiddel, et massegivende protein eller et karbohydrat. Massegivende proteiner som er anvendbare for utforming av antistoffproteinsammensetninger omfatter albumin, protamin og lignende. Typiske karbohydrater som er anvendbare ved utforming av antistoffproteinsammensetninger omfatter sukrose, mannitol, laktose, trehalose, glukose, eller lignende. Antistoffproteinsammensetningen kan også omfatte et detergent, som kan redusere eller forhindre overflateindusert aggregering av antistoffproteinet grunnet atomisering av løsningen ved dannelse av en aerosol. Forskjellige konvensjonelle detergenter kan benyttes, f.eks. polyoksyetylen-fettsyreestere og alkoholer, og polyoksyetylensorbitol-fettsyreestere. Mengden vil generelt variere mellom 0,001 og 14% (vekt/vekt) av sammensetningen. Spesielt foretrukne detergenter er polyoksyetylensorbitan-monooleat, polysorbat 80, polysorbat og lignende. Ytterligere midler som er kjente innen faget for utforming av et protein, f.eks. TNF-antistoff eller en spesifisert del eller variant derav, kan også inngå i sammensetningen. 2 3 Tilførsel av TNF-antistoffsammensetninger med en nebulisator Antistoffproteinsammensetninger kan tilføres via en nebulisator, f.eks. en jetnebulisator eller en ultralydnebulisator. I en jetnebulisator benyttes typisk en kilde for komprimert luft for dannelse av en luftstrøm med høy hastighet gjennom en åpning. Når gassen ekspanderer bak åpningen, dannes et område med lavt trykk som trekker en løsning av antistoffproteinsammensetning gjennom et kapillærrør som er koblet til et væskereservoar. Væskestrømmen fra kapillærrøret oppbrytes til ustabile filamenter og smådråper når den forlater røret, slik at aerosolen dannes. Et utvalg av konfigurasjoner, gjennomstrømmingshastigheter og dysetyper kan benyttes for å oppnå de ønskede ytelsesegenskaper fra en gitt jetnebulisator. I en ultralydnebulisator benyttes elektrisk energi med høy frekvens for dannelse av mekanisk vibrasjonsenergi, typisk ved benyttelse av en piezoelektrisk overfører. Energien overføres til utformingen av antistoffproteinsammensetning enten direkte eller via en koblingsvæske slik at det dannes en aerosol som omfatter antistoffproteinsammensetningen. Partikler av antistoffproteinsammensetning som tilføres fra en nebulisator har fortrinnsvis en partikkelstørrelse på mindre enn tilnærmet μm,

65 fortrinnsvis i området fra tilnærmet 1 μm til tilnærmet μm og mest foretrukket fra tilnærmet 2 μm til tilnærmet 3 μm Utforminger av minst et anti-tnf-antistoff som er egnende for bruk med en nebulisator, enten av jettype eller ultralydbasert, omfatter typisk en konsentrasjon på fra tilnærmet 0,1 mg til tilnærmet 0 mg av minst et anti-tnf-antistoffprotein pr. ml løsning. Utformingen kan omfatte midler som eksipienser, buffere, isotonisitetsmidler, konserveringsmidler, detergenter, og fortrinnsvis, sink. Utformingen kan også omfatte en eksipiens eller et middel for stabilisering av anti-tnf-antistoffproteinet eller -proteinene, f.eks. en buffer, et reduksjonsmiddel, et massegivende protein eller et karbohydrat. Massegivende proteiner som er anvendbare for utforming av sammensetninger med et eller flere anti-tnf-antistoffproteiner omfatter albumin, protamin og lignende. Typiske karbohydrater som er anvendbare for utforming av minst et anti-tnf-antistoff omfatter sukrose, mannitol, laktose, trehalose, glukose og lignende. Sammensetningen med minst et anti-tnf-antistoff kan også omfatte en detergent som kan redusere eller forhindre overflateindusert aggregering av anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene grunnet atomisering av løsningen ved dannelse av en aerosol. Forskjellige konvensjonelle detergenter kan benyttes, f.eks. polyoksyetylen-fettsyreestere og alkoholer og polyoksyetylensorbital-fettsyreestere. Mengden vil generelt ligge mellom 0,001 og 4% (vekt/vekt) av preparatet. Spesielt foretrukne detergenter er polyoksyetylensorbitan-monooleat, polysorbat 80, polysorbat eller lignende. Ytterligere midler som er kjente innen faget for utforming av et protein, f.eks. et antistoffprotein, kan også inngå i sammensetningen. 2 3 Tilførsel av TNF-antistoffsammensetninger med en inhalator for utmålte doser I en inhalator for utmålte doser (MDI), inngår et drivmiddel, minst et anti-tnf-antistoff og eventuelle eksipienser eller andre tilsetningsstoffer i en beholder som en blanding som omfatter en flytende, komprimert gass. Aktivering av måleventilen frigjør blandingen som en aerosol som fortrinnsvis inneholder partikler i størrelsesområdet mindre enn tilnærmet μm, fortrinnsvis fra tilnærmet 1 μm til tilnærmet μm, og mest foretrukket fra tilnærmet 2 μm til tilnærmet 3 μm. Den ønskede aereosolpartikkelstørrelse, oppnås ved å benytte en utforming av antistoffproteinsammensetning dannet ved forskjellige fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk, innbefattet jetmaling, sprøytetørking, kondensering ved det kritiske punkt eller lignende. Foretrukne inhalatorer for utmålte doser omfatter inhalatorene som produseres av 3M eller Glaxo og som benytter et hydrofluorkarbon som drivmiddel.

66 6 1 Utforminger av minst et anti-tnf-antistoff for anvendelse med en inhalator for utmålte doser vil generelt omfatte et finfordelt pulver som inneholder minst et anti-tnfantistoff som en suspensjon i et ikke-vandig medium, f.eks. suspendert i et drivmiddel ved hjelp av en detergent. Drivmidlet kan være et hvert konvensjonelt materiale som benyttes for dette formål, f.eks. et klorfluorkarbon, et hydroklorfluorkarbon, et hydrofluorkarbon eller et hydrokarbon, innbefattet triklorfluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluoretanol og 1,1,1,2-tetrafluoretan, HFA-134a (hydrofluoralkan-134a), HFA-227 (hydrofluoralkan-227) og lignende. Drivmidlet er fortrinnsvis et hydrofluorkarbon. Detergenten kan utvelges slik at den stabiliserer anti-tnf-antistoffet eller -antistoffene som en suspensjon i drivmidlet, beskytter de aktive middel mot kjemisk degradering og lignende. Egnede detergenter omfatter sorbitan-trioleat, soyalecitin, oljesyre og lignende. I noen tilfeller foretrekkes aerosoler av løsninger ved anvendelse av løsemidler som etanol. Ytterligere midler som er kjente innen faget for utforming av et protein, f.eks. et antistoffprotein, kan også inngå i sammensetningen. En gjennomsnittsfagperson vil innse at fremgangsmåtene beskrevet her kan oppnås ved pulmonar tilførsel av sammensetninger med minst et anti-tnf-antistoff via innretninger som ikke er beskrevet heri. 2 3 Orale sammensetninger og tilførsel av disse Utforminger for oral tilførsel bygger på samtidig tilførsel av adjuvanser (f.eks. resorcinoler og ikke-ioniske detergenter som polyoksyetylen-oleyleter og n- heksedecylpolyetyleneter) for på kunstig vis å øke tarmveggenes permeabilitet, så vel som samtidig tilførsel av enzyminhibitorer (f.eks. inhibitorer av pankreatisk trypsin, diisopropylfluorfosfat (DFF) og trasylol) for å inhibere enzymatisk degradering. Den aktive bestanddel av en doseringsform av fast type for oral tilførsel kan være sammenblandet med minst et tilsetningsstoff, innbefattet sukrose, laktose, cellulose, mannitol, trehalose, raffinose, maltitol, dekstran, stivelser, agar, arginater, chitiner, chitosaner, pektiner, tragakantgummi, gummiarabikum, gelatin, kollagen, casein, albumin, syntetiske eller semi-syntetiske polymerer og glyserid. Disse doseringsformene kan også inneholde andre typer tilsetningsstoffer, f.eks. inaktivt fortynningsmiddel, smøremiddel som magnesiumstearat, paraben, konserveringsmiddel som sorbinsyre, askorbinsyre, alfa-tokoferol, antioksidanter som cystein, disintegrasjonsmiddel, bindemiddel, tykningsmiddel, bufringsmiddel, søtemidler, smaksmidler, duftmidler osv. Tabletter og piller kan videre prosesseres til enterisk belagte preparater. De flytende preparater for oral tilførsel omfatter emulsjoner, siruper, eliksirer, suspensjoner og løs-

67 66 ninger som er tillatte for medisinsk bruk. Disse preparatene kan inneholde inaktive fortynningsmidler som vanligvis anvendes innen feltet, f.eks. vann. Lipsomer har også blitt beskrevet som medikamenttilførselssystemer for insulin og heparin (U.S. patentskrift nr. 4,239,74). Mer nylig har mikrokuler av kunstige polymerer av blandede aminosyrer (proteinoider) blitt benyttet for tilførsel av farmasøytiske midler (U.S. patentskrift nr. 4,92,673). Videre, er bærerforbindelser beskrevet i U.S. patentskrift nr.,879,681 og U.S. patentskrift nr.,871,73 som benyttes for tilførsel av biologisk aktive midler oralt, kjente innen faget. 1 Mukosale utforminger og tilførsel av disse For absorpsjon gjennom slimhinner omfatter sammensetninger og tilførselsfremgangsmåter for minst et anti-tnf-antistoff en emulsjon som omfatter et stort antall submikrometerpartikler, et mukoadhesivt makromolekyl, et bioaktivt peptid og en vandig kontinuerlig fase som fremmer absorpsjon gjennom slimhinner ved at det oppnås mukoadhesjon av emulsjonspartiklene (U.S. patentskrift nr.,14,670). Slimhinner som er egnede for tilførsel av emulsjonene kan omfatte korneal, konjuktival, bukkal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonær, magebasert, intestinal og rektal tilførsel. Utforminger for vaginal eller rektal tilførsel, f.eks. stikkpiller, kan som eksipienser f.eks. inneholde polyalkylenglykoler, vaselin, kakaosmør og lignende. Utforminger for intranasal tilførsel kan være faste og som eksipienser f.eks. inneholde laktose, eller de kan være suspensjoner i vann eller olje som nesedråper. For bukkal tilførsel omfatter eksipiensene sukkere, kalsiumstearat, magnesiumstearat, pregelatinisert stivelse og lignende (U.S. patentskrift nr.,849,69). 2 Transdermale utforminger og tilførsel av disse For transdermal tilførsel er et eller flere anti-tnf-antistoffer innkapslet i en tilførselsinnretning, f.eks. liposomer eller polymere nanopartikler, mikropartikler, mikrokapsler eller mikrokuler (under ett betegnet mikropartikler dersom ikke annet er angitt). Et stort antall egnede innretninger er kjente, innbefattet mikropartikler fremstilt av syntetiske polymerer, f.eks. polyhydroksysyrer som polymelkesyre, polyglykolsyre og kopolymerer av disse, polyortoestere, polyanhydrider og polyfosfasener, og naturlige polymerer som kollagen, polyaminosyrer, albumin og andre proteiner, alginat og andre polysakkarider, og kombinasjoner av disse (U.S. patentskrift nr.,814,99). 3 Vedvarende tilførsel og utforminger for dette Det kan noen ganger være fordelaktig å tilføre forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse til pasienten over lengre tidsrom, f.eks. over et tidsrom på fra 1 uke til 1 år, ved

68 67 1 en enkelt tilførsel. Forskjellige doseringsformer for langsom frigivelse, deponering eller implantering kan benyttes. En doseringsform kan f.eks. inneholde et farmasøytisk aksepterbart, ikke-toksisk salt av forbindelsene med lav løselighet i kroppsvæsker, f.eks. (a) et syreaddisjonssalt med en polybasisk syre som fosforsyre, svovelsyre, sitronsyre, vinsyre, garvesyre, pamoinsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalen-mono- eller - disulfonsyrer, polygalakturonsyre og lignende, (b) et salt med et polyvalent metallkation som sink, kalsium, bismut, barium, magnesium, aluminium, kopper, kobolt, nikkel, kadmium og lignende, eller med et organisk kation dannet fra f.eks. N,N - dibenzyletylendiamin eller etylendiamin, eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt. I tillegg, kan fortrinnsvis, et relativt uløselig salt som dem nettopp beskrevet, utformes i en gel, f.eks. en aluminiummonostearatgel med f.eks. sesamolje, egnet for injeksjon. Spesielt foretrukne salter er sinksalter, sinktannatsalter, pamoatsalter og lignende. En annen type utforming for depotinjeksjon for langsom frigivelse vil inneholde forbindelsen eller saltet dispergert eller innkapslet i en langsomt degraderbar, ikke-toksisk, ikke-antigen polymer, f.eks. en polymelkesyre/polyglykolsyrepolymer, f.eks. som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 3,773,919. Forbindelsene, eller fortrinnsvis relativt uløselige salter av disse, f.eks. saltene beskrevet ovenfor, kan også være utformet i silastiske partikler med kolesterolmatriks, fortrinnsvis for bruk i dyr. Ytterligere utforminger for langsom frigivelse, deponering eller implantering, f.eks. gass eller flytende liposomer, er kjente fra litteraturen (U.S. patentskrift nr.,770,222 og Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson red., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978). 2 Når nå oppfinnelsen er beskrevet i generelle vendinger vil den kunne forstås bedre ved henvisning til de påfølgende eksempler, som gis for å illustrere oppfinnelsen og som ikke er ment å begrense den. 3 Eksempel 1: Kloning og ekspresjon av TNF-antistoff i pattedyrceller En typisk pattedyrekspresjonsvektor inneholder minst et promoterelement som formidler initiering av transkripsjon av mrna, den antistoffkodende sekvens og signaler som er nødvendige for transkripsjonsterminering og polyadenylering av transkriptet. Ytterligere elementer omfatter enhancere, Kozak-sekvenser og intronsekvenser flankert av donor- og akseptorseter for RNA-spleising. Svært effektiv transkripsjon kan oppnås med den tidlige og sene promoter fra SV40, de lange enderepetisjoner (LTR) fra Retrovirus, f.eks. RSV, HTLVI, HIVI og den tidlige promoter fra cytomegalovirus (CMV). Imidlertid kan cellulære elementer også anvendes (f.eks. den humane aktinpromoter). Egnede ekspresjonsvektorer for anvendelse omfatter f.eks. vektorer som pires1neo,

69 68 pretro-off, pretro-on, PLXSN eller plncx (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcdna3.1 (+/-), pcdna/zeo (+/-) eller pcdna3.1/hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL og PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sverige), prsvcat (ATCC 3712), psv2dhfr (ATCC 37146) og pbc12mi (ATCC 679). Pattedyrvertsceller som kan anvendes omfatter humane Hela 293-celler, H9-celler og Jurkat-celler, NIH3T3-celler og C127-celler fra mus, Cos 1, Cos 7 og CV 1, QC1-3-celler, fra vaktel, muse-l-celler og Kina-hamsterovarieceller (CHO-celler). Alternativt kan genet uttrykkes i stabile cellelinjer som inneholder genet integrert i et kromosom. Kotransfeksjon med en seleksjonsmarkør som dhfr, gpt, neomycin eller hygromycin tillater påvisning og isolering av de transfekterte celler. 1 Det transfekterte gen kan også amplifiseres for ekspresjon av store mengder av det kodede antistoff. DHFR (dihydrofolatreduktase)-markøren er anvendbar for utvikling av cellelinjer som bærer fra flere hundre til flere tusen kopier av genet av interesse. En annen anvendbar seleksjonsmarkør er enzymet glutaminsyntase (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227: (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology : (1992)). Ved anvendelse av disse markører dyrkes pattedyrcellene i selektivt medium, og cellene med høyest resistens utvelges. Disse cellelinjene inneholder det eller de amplifiserte genene integrert i et kromosom. Kina-hamster-ovarieceller (CHO-celler) og NSO-celler anvendes ofte for fremstilling av antistoffer. 2 Ekspresjonsvektorene pc1 og pc4 inneholder den kraftige promoter (LTR) fra Rous Sarcom-virus (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. : (198)) pluss et fragment av CMV-enhanceren (Boshart, et al., Cell 41:21- (198)). Multiple kloningsseter, f.eks. med kutteseter for restriksjonsenzymene BamHI, XbaI og Asp718, letter kloning av genet av interesse. Vektorene inneholder i tillegg 3 -intronet og polyadenylerings- og termineringssignalet fra preproinsulingenet fra rotte. 3 Kloning og ekspresjon i CHO-celler Vektoren pc4 anvendes for ekspresjon av TNF-antistoff. Plasmid pc4 er et derivat av plasmid psv2-dhfr (ATCC aksesjonsnr ). Plasmidet inneholder DHFR-genet fra mus under kontroll av den tidlige SV40-promoteren. Kina-hamster-ovarieceller eller andre celler som mangler dihydrofolataktivitet som er transfektert med disse plasmider kan selekteres ved å dyrke cellene i et selektivt medium (f.eks. alfa minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MED) tilsatt det kjemoterapeutiske middel metotreksat. Amplifisering av DHFR-genene i celler som er resistente overfor metotreksat (MTX) er

70 69 godt dokumentert (se f.eks. F.W. Alt, et al., J. Biol.Chem. 23: (1978); J.L. Hamlin og C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 97:7-143 (1990); og M.J. Page og M.A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Celler dyrket i økende konsentrasjoner av MTX utvikler resistens overfor medikamentet ved å overprodusere målenzymet, DHFR, som en følge av amplifisering av DHFR-genet. Dersom et annet gen er koblet til DHFR-genet vil dette vanligvis amplifiseres samtidig og overuttrykkes. Det er kjent innen faget at denne tilnærming kan anvendes for utvikling av cellelinjer som bærer mer enn kopier av det eller de amplifiserte genene. Når metotreksat fjernes er holdes cellelinjer som inneholder det amplifiserte gen integrert i ett eller flere kromosomer i vertscellen. 1 2 For ekspresjon av genet av interesse inneholder plasmid pc4 den kraftig promoter fra den lange enderepetisjonen (LTR) fra Rous sarkomvirus (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. : (198)) pluss et fragment isolert fra enhanceren fra det umiddelbart tidlige gen fra humant cytomegalovirus (CMV) (Boshart, et al., Cell 41:21- (198)). Nedstrøms for promoteren ligger kutteseter for restriksjonsenzymene BamHI, XbaI og Asp718 som tillater integrasjon av genene. Bak disse kloningssetene inneholder plasmidet det 3 intron og polyadenyleringssetet fra preproinsulingenet fra rotte. Andre promotere med høy aktivitet kan også anvendes for ekspresjonen, f.eks. den humane -aktinpromoter, den tidlige eller sene promoter fra SV40 eller de lange enderepetisjoner fra andre retrovirus, f.eks. HIV og HTLV1. Clontech s Tet-Off- og Tet-Ongenekspresjonssystemer og lignende systemer kan anvendes for ekspresjon av TNF på en regulert måte i pattedyrceller (M. Gossen og H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:47-1 (1992)). For polyadenylering av mrna kan andre signaler, f.eks. fra det humane veksthormon eller globingenene, også anvendes. Stabile cellelinjer som bærer et gen av interesse integrert i kromosomene kan også selekteres ved kotransfeksjon med en seleksjonsmarkør som gpt, G418 eller hygromycin. Det er fordelaktig å benytte mer enn en seleksjonsmarkør i begynnelsen, f.eks. G418 pluss metotreksat. Plasmid pc4 kuttes med restriksjonsenzymer og defosforyleres så ved anvendelse av fosfatase fra kalvetarm ved fremgangsmåter som er kjente innen faget. Vektoren isoleres så fra en 1% agarosegel. 3 Det isolerte DNA som koder for variabelt og konstant område og den defosforylerte vektor ligeres så sammen med T4 DNA-ligase. E. coli HB1- eller XL-1 Blue-celler transformeres så, og det påvises bakterier som inneholder fragmentet innsatt i plasmid pc4 ved anvendelse av f.eks. restriksjonsenzymanalyse.

71 70 1 Kina-hamster-ovarieceller (CHO-celler) som mangler et aktivt DHFR-gen benyttes for transfeksjonen. μg av ekspresjonsplasmidet pc4 kotransfekteres med 0, μg av plasmid psv2-neo ved anvendelse av lipofektin. Plasmid psv2neo inneholder en dominant seleksjonsmarkør, neo-genet fra Tn som koder for et enzym som gir resistens overfor en gruppe antibiotika som omfatter G418. Cellene utsås i alfa-minus-mem tilsatt 1 μg/ml G418. Etter 2 dager trypsinbehandles cellene og utsås i hybridomkloningsplater (Greiner, Tyskland) i alfa-minus-mem tilsatt, 2 eller 0 ng/ml metotreksat pluss 1 μg/ml G418. Etter tilnærmet -14 dager trypsinbehandlet enkeltkolonier og utsås i 6- brønners petriskåler eller ml flasker ved anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av metotreksat (0 nm, 0 nm, 0 nm, 400 nm, 800 nm). Klonene som vokser ved de høyeste metotreksatkonsentrasjonene overføres så til ny 6-brønners plater som inneholder enda høyere metotreksatkonsentrasjoner (1 mm, 2 mm, mm, mm, mm). Den samme fremgangsmåte gjentas inntil det erholdes kloner som vokser ved en konsentrasjon på 0-0 mm. Ekspresjon av det ønskede genprodukt analyseres f.eks. ved SDS-PAGE og Wester-blotting, eller ved revers fase-hplc-analyse. Eksempel 2: Dannelse av humane monoklonale IgG-antistoffer som reagerer med human TNF med høy affinitet ved anvendelse av transgene mus 2 3 Oppsummering Transgene mus som inneholder humane tungkjede- og lettkjede-immunglobulingener har blitt anvendt for frembringelse av fullstendig humane monoklonale antistoffer med høy affinitet, som kan anvendes terapeutisk for inhibering av virkningen av TNF for behandling av en eller flere TNF-formidlede sykdommer. (CBA/J x C7/BL6/J) F 2 - hybridmus som inneholder antistofftransgener for humant variabelt og konstant område fra både tungkjede og lettkjede immuniseres med human rekombinant TNF (Taylor et al., Intl. Immunol. 6:79-91 (1993); Lonberg, et al., Nature 368:86-89 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996); Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:84-81 (1996)). Flere fusjoner ga et eller flere sett med fullstendig humane TNFreaktive monoklonale IgG-antistoffer. De fullt ut humane anti-tnf-antistoffene karakteriseres videre. Alle er IgG1. Slike antistoffer finnes å ha affinitetskonstanter på mellom 1x 9 og 9x 12. Den uventede høye affinitet av disse fullt ut humane monoklonale antistoffene gjør dem til egnede kandidater for terapeutisk anvendelse ved TNFforbundne sykdommer, sykdomstilstander eller forstyrrelser.

72 71 1 Forkortelser BSA - bovint serumalbumin CO 2 - karbondioksid DMSO - dimetylsulfoksid EIA - enzymimmunanalyse FBS - føtalt bovint serum H 2 O 2 - hydrogenperoksid HRP - pepperrotperoksidase ID - intradermal Ig - immunglobulin TNF - vevsnekrosefaktor alfa IP - intraperitoneal IV - intravenøs Mab - monoklonalt antistoff OD - optisk tetthet OPD - o-fenylendiamin-dihydroklorid PEG - polyeteylenglykol PSA - penicillin, streptomycin, amfotericin RT - romtemperatur SQ - subkutan vol/vol - volum pr. volum vekt/vol - vekt pr. volum Materialer og fremgangsmåter 2 3 Dyr Transgene mus som kan uttrykke humane antistoffer er kjente innen faget (og er kommersielt tilgjengelige (f.eks. fra GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA og andre), og uttrykker humane immunglobuliner, men ikke muse-igm eller Igκ. Slike transgene mus inneholder f.eks. transgener med human sekvens som gjennomgår V(D)J-kobling, tungkjedeklassebytte og somatisk mutasjon for frembringelse av et repertoar av immunglobuliner med human sekvens (Lonberg, et al., Nature 368:86-89 (1994)). Lettkjedegenet kan f.eks. delvis være avledet fra en kunstig gjærkromosomklon som omfatter nesten halvparten av det humane Vκ-området fra kimcellelinjen. I tillegg kan tungkjedetransgenet kodet for både human μ og human 1 (Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:84-81 (1996)) og/eller 3 konstante områder.

73 72 Mus avledet fra egnede genotopiske linjer kan anvendes i immuniserings- og fusjonsprosesser for frembringelse av fullt ut humane monoklonale antistoffer mot TNF. 1 2 Immunisering Et eller flere immuniseringsskjemaer kan anvendes for frembringelse av humane anti- TNF-hybridomer. De første fusjonene kan utføres etter den påfølgende eksemplariske immuniseringsprotokoll, men andre tilsvarende, kjente protokoller kan anvendes. Flere 14- uker gamle transgene hunnmus og/eller kirurgisk kastrerte transgene hannmus immuniseres intraperitonealt og/eller intradermalt med 1-00 μg rekombinant humant TNF emulgert med et likt volum TITERMAX eller komplett Freund s adjuvans i et endelig volum på μl (f.eks. 0). Hver mus kan om ønskelig også gis 1- μg i 0 μl fysiologisk saltvann i 2 subkutane seter. Musene kan så immuniseres 1-7, -12, -18, 17-2 og/eller dager senere intraperitonealt (1-400 μg) og subkutant (1-400 μg x 2) med TNF emulgert med et likt volum TITERMAX eller ufullstendig Freund s adjuvans. Blod kan tappes 12-2 og 2-40 dager senere ved retroorbital funksjon uten anti-koagulasjonsmiddel. Blodet får så koagulere ved romtemperatur i 1 time, og serum oppsamles og titreres ved anvendelse av en TNF-EIA-analyse ifølge kjente fremgangsmåter. Fusjoner utføres når gjentatte injeksjoner ikke gir økt titer. På dette tidspunkt kan musene gis en endelig intravenøs forsterkerinjeksjon med μg TNF fortynnet med 0 μl fysiologisk saltvann. 3 dager senere kan musene avlives ved nakkeforskyvning, og milten tas ut aseptisk og neddyppes i ml kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) tilsatt 0 U/ml penicillin, 0 μg/ml streptomycin og 0,2 μg/ml amfotericin B (PSA). Spenocyttene høstes ved steril perfusjon av milten med PSA-PBS. Cellene vaskes en gang med kald PSA-PBS, telles ved anvendelse av Trypan blått-eksklusjon og resuspenderes i RPMI 1640-medium tilsatt 2 mm Hepes. 3 Cellefusjon Fusjonen kan utføres ved et forhold på 1:1 til 1: mellom musemyelomceller og levedyktige miltceller ifølge kjente fremgangsmåter, f.eks. som kjent innen faget. Som et ikke-begrensende eksempel kan miltceller og myelomceller nedsentrifugeres sammen. De nedsentrifugerte cellene kan så langsomt resuspenderes over et tidsrom på sekunder i 1 ml 0% (vekt/vol.) PEG/PBS-løsning (PEG med molekylvekt 1 40, Sigma) ved 37ºC. Fusjonen kan så stanses ved langsom tilsetning av, ml RPMI 1640-medium tilsatt 2 mm Hepes (37ºC) over et tidsrom på 1 minutt. De fusjonerte celler nedsentrifugeres i minutter ved 00-0 rpm. Cellene resuspenderes så i HAT-medium (RPMI 1640-medium tilsatt 2 mm Hepes, % føtalt klon I-serum (Hyclone), 1 mm natriumpyruvat, 4 mm L-glutamin, μg/ml gentamicin, 2,% Origen dyrkningssup-

74 73 plement (Fisher), % 63-kondisjonert RPMI 1640/Hepes-medium, 0 μm 2- merkaptoetanol, 0 μm hypoksantin, 0,4 μm aminoipterin, og 16 μm tymidin) og utsås så med 0 μl/brønn i femten 96-brønners vevsdyrkningsplater med flat bunn. Platene plasseres så i en fuktiggjort 37ºC-inkubator inneholdende % CO 2 og 9% luft i 7- dager Påvisning av humane anti-tnf-igg-antistoffer i museserum EIA i fast fase kan anvendes for analyse av museserum for humane IgG-antistoffer spesifikke for human TNF. Kort beskrevet kan plater belegges med TNF ved 2 μg/ml i PBS over natten. Etter vask med 0,1M saltvann tilsatt 0,02% (vol/vol) Tween, kan brønnene blokkeres med 1% (vekt/vol) BSA i PBS, 0 μl/brønn i 1 time ved romtemperatur. Platene anvendes umiddelbart eller nedfryses ved -ºC for fremtidig bruk. Fortynninger av museserum inkuberes på de TNF-belagte platene med 0 μl/brønn ved romtemperatur i 1 time. Platene vaskes og analyseres så med 0 μl/brønn HRP-merket antihuman IgG, Fc-spesifikt fra geit, fortynnet 1: 000 i 1% BSA-PBS i 1 time ved romtemperatur. Platene kan igjen vaskes, og 0 μl/brønn av sitrat-fosfatsubstratløsning (0,1M sitronsyre og 0,2M natriumfosfat, 0,01% H 2 O 2 og 1 mg/ml OPD) tilsettes i 1 minutter ved romtemperatur. Stoppløsning (4N svovelsyre) tilsettes så med 2 μl/brønn og OD avleses ved 490 nm ved hjelp av et automatisk platespektrofotometer. Påvisning av fullt ut humane immunglobuliner i hybridomsupernatanter Vekstpositive hybridomer som utskiller fullt ut humane immunglobuliner kan påvises ved anvendelse av en egnet EIA. Kort beskrevet kan 96-brønners utpresningsplater (VWR, 6744) belegges med μg/ml anti-human IgG Fc fra geit i natriumkarbonatbuffer over natten ved 4ºC. Platene vaskes og blokkeres med 1% BSA-PBS i 1 time ved 37ºC og benyttes umiddelbart eller nedfryses ved -ºC. Ufortynnede hybridomsupernatanter inkuberes på platene i 1 time ved 37ºC. Platene vaskes og analyseres med HRPmerket anti-human kappa fra geit fortynnet 1: 000 i 1% BSA-PBS i 1 time ved 37ºC. Platene inkuberes så med substratløsning som beskrevet ovenfor. Bestemmelse av reaktiviteten av fullt ut humane anti-tnf Hybridomer som ovenfor kan samtidig analyseres for reaktivitet overfor TNF ved anvendelse av en egnet RIA eller en annen analyse. For eksempel inkuberes supernatanter på plater belagt med anti-human IgG Fc fra geit som ovenfor, vaskes og analyseres så med radioaktivt merket TNF med et passende antall tellinger pr. brønn i 1 time ved romtemperatur. Brønnene vaskes to ganger med PBS, og bundet, radioaktivt merket TNF kvantifiseres ved anvendelse av en egnet teller.

75 74 Hybridomer som utskiller humant anti-tnf-igg1 kan ekspanderes i cellekultur og subklones serielt ved begrensende fortynning. De resulterende klonale populasjoner kan ekspanderes og frysekonserveres i frysemedium (9% FBS, % DMSO) og lagres i flytende nitrogen. 1 Isotyping Isotypebestemmelse av antistoffene kan oppnås ved anvendelse av en EIA i et format som tilsvarer det som benyttes for analyse av museimmunserum for spesifikke titere. TNF kan belegges på 96-brønners plater som beskrevet ovenfor, og renset antistoff ved 2 μg/ml kan inkuberes på platen i 1 time ved romtemperatur. Platen vaskes og analyseres med HRP-merket anti-human IgG1 fra geit eller HRP-merket anti-human IgG 3 fra geit, fortynnet 1:4 000 i 1% BSA-PBS i 1 time ved romtemperatur. Platen vaskes igjen og inkuberes med substratløsning som beskrevet ovenfor. Kinetikk for binding av humane anti-human-tnf-antistoffer til human TNF. Antistoffenes bindingsegenskaper kan på egnet vis anslås ved anvendelse av en TNFinnfangings-EIA og BIAcore-teknologi. Graderte konsentrasjoner av rensede humane TNF-antistoffer kan analyseres for binding til EIA-plater belagt med 2 μg/ml TNF i analyser som beskrevet ovenfor. Optisk tetthet kan så presenteres i halvlogaritmiske fremstillinger som viser relativ bindingseffektivitet. 2 3 Kvantitative bindingskonstanter kan f.eks. erholdes som følger, eller ved enhver annen kjent, egnet fremgangsmåte. En BIAcore CM- (karboksymetyl)-brikke plasseres i en BIAcore 00-enhet. HBS-buffer (0,01M HEPES, 0,1M NaCl, 3 mm EDTA, 0,00% v/v P-detergent, ph 7,4) får strømme over en gjennomstrømningscelle i brikken ved μl/minutt inntil en stabil grunnlinje oppnås. En løsning (0 μl) av 1 mg EDC (N-etyl- N -(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid hydroklorid) i 0 μl vann tilsettes til 0 μl av en løsning av 2,3 mg NHS (N-hydroksysuksinimid) i 0 μl vann. 40 μl av den resulterende løsning injiseres på brikken. 6 μl av en løsning av human TNF (1 μg/ml i mm natriumacetat, ph 4,8) injiseres på brikken, noe som fører til en økning på tilnærmet 00 RU. Bufferen byttes til TBS/Ca/Mg/BSA-analysebuffer ( mm Tris, 0,1M natriumklorid, 2 mm kalsiumklorid, 2 mm magnesiumacetat, 0,% Triton X-0, 2 μg/ml BSA, ph 7,4) og får strømme over brikken over natten for ekvilibrering av den og for hydrolysering eller blokkering av eventuelle ikke-reagerte suksinimidestere.

76 7 1 Antistoffer oppløses i analysebufferen ved 33,33, 16,67, 8,33 og 4,17 nm. Gjennomstrømningshastigheten justeres til μl/min. og instrumentets temperatur til 2ºC. To gjennomstrømningsceller benyttes for de kinetiske analyser, en i hvilken TNF er immobilisert (prøve) og en annen, ikke-derivatisert gjennomstrømningscelle (blindprøve). 1 μl av hver antistoffkonsentrasjon injiseres over gjennomstrømningscellene ved μl/min. (assosiasjonsfase), fulgt av 360 uavbrudte sekunder med buffergjennomstrømning (dissosiasjonsfase). Brikkens overflate regenereres (vevsnekrosefaktor alfa/antistoffkompleks dissosieres) ved to på hverandre følgende injeksjoner, hver på μl, av 2M guanidintiocyanat. Analysen av resultatene utføres ved anvendelse av BIA evaluation 3,0 eller CLAMP 2.0, som kjent innen faget. For hver antistoffkonsentrasjon subtraheres blindprøvesensogrammet fra prøvesensogrammet. En global tilpasning utføres for både dissosiasjon (k d, sek. -1 ) og assosiasjon (k a, mol -1 sek. -1 ), og dissosiasjonskonstanten (K D, mol) beregnes (k d /k a ). Dersom antistoffaffiniteten er tilstrekkelig høy til at RU for innfanget antistoff er >0, analyseres ytterligere fortynninger av antistoffet. Resultater og diskusjon 2 Dannelse av monoklonale anti-human TNF-antistoffer Flere fusjoner utføres, og hver fusjon utsås i 1 plater (1440 brønner/fusjon) som gir flere dusin antistoffer som er spesifikke for human TNF. Av disse, finnes noen å bestå av en kombinasjon av Ig-kjeder fra menneske og mus. De gjenværende hybridomer utskiller anti-tnf-antistoffer som kun består av humane tungkjeder og lettkjeder. Av de humane hybridomene forventes alle å være IgG1. Bindingskinetikk for humane anti-human-tnf-antistoffer ELISA-analyse bekrefter at renset antistoff fra de fleste eller alle hybridomer binder TNF på en konsentrasjonsavhengig måte. Figur 1-2 viser resultatene for antistoffenes relative bindingseffektivitet. I dette tilfellet måles aviditeten av antistoffet for det tilhørende antigen (epitopen). Det bør bemerkes at binding av TNF direkte til EIA-platen kan føre til denaturering av proteinet, og den tilsynelatende bindingsaffinitet vil ikke gjenspeile binding til ikke-denaturert protein. 0% binding finnes over et område av konsentrasjoner. 3

77 76 Kvantitative bindingskonstanter erholdes ved anvendelse av BIAcore-analyse av de humane antistoffene og viser at flere av de humane monoklonale antistoffene har svært høy affinitet, med K D i området 1x -9 til 7x -12. Konklusjoner Flere fusjoner utføres ved benyttelse av splenocytter fra hybridmus som inneholder antistofftransgener for humant variabelt og konstant område, immunisert med human TNF. Et sett av flere fullt ut humane TNF-reaktive monoklonale IgG-antistoffer av IgG1-isotype dannes. De fullt ut humane anti-tnf-antistoffene karakteriseres videre. Flere av de dannede antistoffer har affinitetskonstanter på mellom 1x 9 og 9x 12. Den utventet høye affinitet av disse fullt ut humane monoklonale antistoffene gjør dem egnede for terapeutisk anvendelse ved TNF-avhengige sykdommer, sykdomstilstander eller TNF-forbundne tilstander. 1 Eksempel 2: Dannelse av humane monoklonale IgG-antistoffer som reagerer med human TNF! 2 Summering (CBA/JxC7BL/6J) F 2 -hybridmus (1-4) som inneholder antistofftransgener for humant variabelt og konstant område fra både tungkjede og lettkjede ble immunisert med rekombinant human TNF!. En fusjon, betegnet GenTNV, ga åtte fullt ut humane monoklonale IgG1κ-antistoffer som bindes til immobilisert rekombinant human TNF!. Kort tid etter påvisningen ble de åtte cellelinjene overført til Molecular Biology for videre karakterisering. Siden disse Mab har en fullt ut human sekvens, forventes de å være mindre immunogene enn ca2 (Remicade) i mennesker. 3 Forkortelser BSA - bovint serumalbumin CO 2 - karbondioksid DMSO - dimetylsulfoksid EIA - enzymimmunanalyse FBS - føtalt bovint serum H 2 O 2 - hydrogenperoksid HC - tungkjede HRP - pepperrotperoksidase Ig - immunglobulin IP - intraperitoneal

78 77 IV - intravenøs Mab - monoklonalt antistoff OD - optisk tetthet OPD - o-fenylendiamin-dihydroklorid PEG - polyetylenglykol PSA - penicillin, streptomycin, amfotericin RT - romtemperatur SQ - subkutan TNF! - tumor nekrosefaktor alfa vol/vol - volum pr. volum vekt/vol - vekt pr. volum 1 Innledning Transgene mus som inneholder humane tungkjede- og lettkjede-immunglobumingener ble benyttet for frembringelse av fullt ut humane monoklonale antistoffer som er spesifikke for rekombinant human TNF!. Man håper at disse unike antistoffene kan benyttes, på samme måte som ca2 (Remicade), for terapeutisk inhibering av inflammasjonsprosessene som inngår i TNF!-formidlet sykdom, med fordelen av forhøyet halveringstid i serum og reduserte bivirkninger forbundet med immunogenisitet. Materialer og fremgangsmåter 2 Dyr Transgene mus som uttrykker humane immunglobuliner, men ikke muse-igm eller -Igκ, har blitt utviklet av GenPharm International. Disse musene inneholder funksjonelle humane antistofftransgener som gjennomgår V(D)J-kobling, tungkjedeklassebytte og somatisk mutasjon for frembringelse av et repertoar av antigenspesifikke humane immunglobuliner (I). Lettkjedetransgenene er delvis avledet fra en kunstig gjærkromosomklon som omfatter nesten halvparten av kimcellelinjens humane Vκ-lokus. I tillegg til flere VH-gener, koder tungkjede (HC)-transgenet for både humane μ og humane 1 (2) og/eller 3-konstantområder. En mus avledet fra den genotypiske linje HCO12/KCo ble anvendt i immuniserings- og fusjonsprosessen for frembringelse av de monoklonale antistoffene som beskrives her. 3 Rensing av human TNF! Human TNF! ble renset fra vevsdyrkningssupernatant fra C237A-celler ved affinitetskromatografi og benyttelse av en kolonne pakket med TNF!-reseptor-Fc-fusjonsprotein

79 78 (p-sf2) () koblet til Sepharose 4B (Pharmacia). Cellesupernatanten ble blandet med et niendels volum av x Dulbecco s PBS (D-PBS) og fikk passere gjennom kolonnen ved 4ºC og med 4 ml/min. Kolonnen ble så vasket med PBS, og TNF! ble eluert med 0,1M natriumsitrat, ph 3, og nøytralisert med 2M Tris-HCl ph 8,. Den rensede TNF! ble overført til mm Tris, 0,12M natriumklorid ph 7, og filtrert gjennom et 0,2 μm sprøytefiler. 1 Immuniseringer En GenPharm-hunnmus på tilnærmet 16 uker ble immunisert intraperitonealt (0 μl) og intradermalt (0 μl ved haleroten) med i alt 0 μg TNF! (porsjon JG2298 eller JG98) emulgert med et likt volum Titermax-adjuvans på dag 0, 12 og 28. Blod ble tappet fra musen på dag 21 og 3 ved retro-orbital punksjon uten antikoagulasjonsmiddel. Blodet fikk koagulere ved romtemperatur i 1 time, og serum ble oppsamlet og titrert ved anvendelse av en TNF!-EIA-analyse i fast fase. Fusjonen, som ble betegnet GenTNV, ble utført etter at musen hadde fått hvile i 7 uker etter injeksjonen på dag 28. Musen, som hadde et spesifikt humant IgG-titer på 1:160 mot TNF! ble så gitt en avsluttende intravenøs forsterkerinjeksjon med 0 μg TNF! fortynnet i 0 μl fysiologisk saltvann. 3 dager senere ble musen avlivet ved nakkeforskyvning, og milten ble tatt ut aseptisk og neddyppet i ml kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) tilsatt 0 U/ml penicillin, 0 μg/ml streptomycin, og 0,2 μg/ml amfotericin B (PSA). Splenocyttene ble høstet ved steril perfusjon av milten med PSA-PBS. Cellene ble vasket en gang i kald PSA-PBS, talt ved anvendelse av en Coulter-teller og resuspendert i RPMI 1640-medium tilsatt 2 mm Hepes. 2 3 Cellelinjer Den ikke-sekreterende musemyelomfusjonspartner 63 ble mottatt av Cell Biology Services (CBS)-gruppen den 14. mai 1997 fra Centocor s Product Development group. Cellelinjen ble ekspandert i RPMI-medium (JRH Biosciences) tilsatt % (vol/vol) FBS (Cell Culture Labs), 1 mm natirumpyruvat, 0,1 mm NEAA, 2 mm L-glutamin (alle fra JRH Biosciences) og fryselagret i 9% FBS og % DMSO (Sigma), og så lagret i dampfasen i en flytende nitrogenfryser i CBS. Cellebanken var steril (Quality Control Centocor, Malvern) og fri for mykoplasma (Bionique Laboratories). Cellene ble holdt i logaritmisk fase i kultur inntil fusjonen. De ble vasket med PBS og talt, og viabiliteten ble bestemt (>9%) ved trypanblåtteksklusjon før fusjonen. Human TNF! ble fremstilt fra en rekombinant cellelinje betegnet C237A, frembragt hos Molecular Biology at Centocor. Cellelinjen ble ekspandert i IMDM-medium (JRH

80 79 Biosciences) tilsatt % (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 2 mm L-glutamin (alle fra JRH Biosciences) og 0, μg/ml mykofenolsyre og fryselagret i 9% FBS og % DMSO (Sigma), og så lagret i dampfasen i en flytende nitrogenfryser i CBS (13). Cellebanken var steril (Quality Control Centocor, Malvern) og fri for mykoplasma (Bionique Laboratories). 1 Cellefusjon Cellefusjonen ble utført ved anvendelse av et forhold på 1:1 mellom musemyelomcellene 63 og viable musemiltceller. Kort beskrevet ble miltcellene og myelomcellene nedsentrifugert sammen. De nedsentrifugerte cellene ble langsomt resuspendert over et tidsrom på sekunder i 1 ml 0% (vekt/vol) PEG/PBS-løsning (PEG med molekylvekt 1,40 g/mol, Sigma) ved 37ºC. Fusjonen ble stanset ved langsom tilsetning av, ml RPMI-medium (uten tilsetningsstoffer) (JRH) (37ºC) over et tidsrom på 1 minutt. De fusjonerte cellene ble nedsentrifugert i minutter ved 70 rpm. Cellene ble så resuspendert i HAT-medium (RPMI/HEPES-medium tilsatt % føtalt bovint serum (JRH), 1 mm natriumpyruvat, 2 mm L-glutamin, μg/ml gentamicin, 2,% Origen dyrkingssupplement (Fisher), 0 μm 2-merkaptoetanol, 1% 63-kondisjonert RPMI-medium, 0 μm hypoksantin, 0,4 μm aminopterin og 16 μm tymidin) og så utsådd med 0 μl/brønn i fem 96-brønners vevsdyrkningsplater med flat bunn. Platene ble så plassert i en fuktiggjort 37ºC inkubator med % CO 2 og 9% luft i 7- dager. 2 3 Påvisning av humane anti-tnf!-igg-antistoffer i museserum EIA i fast fase ble anvendt for analyse av museserum for humane IgG-antistoffer spesifikke for human TNF!. Kort beskrevet ble plater belagt med TNF! ved 1 μg/ml i PBS over natten. Etter vask med 0,1 M saltvann tilsatt 0,02% (vol/vol) Tween, ble brønnene blokkert med 1% (vekt/vol) BSA i PBS, 0 μl/brønn i 1 time ved romtemperatur. Platene ble enten benyttet umiddelbart eller nedfrosset ved -ºC for fremtidig bruk. Museserum ble inkubert i to gangers seriefortynninger på platene belagt med human TNF! med 0 μl/brønn ved romtemperatur i 1 time. Platene ble vasket og så analysert med 0 μl/brønn HRP-merket anti-human IgG, Fc-spesifikk fra geit (Accurate) fortynnet 1: 000 i 1% BSA-PBS i 1 time ved romtemperatur. Platene ble igjen vasket, og 0 μl/brønn av sitrat-fosfatsubstratløsningen (0,1M sitronsyre og 0,2M natriumfosfat, 0,01% H 2 O 2 og 1 mg/ml OPD) ble tilsatt i 1 minutter ved romtemperatur. Stoppløsning (4N svovelsyre) ble så tilsatt med 2 μl/brønn, og optisk tetthet ble avlest ved 490 nm ved anvendelse av et automatisk platespektrofotometer.

81 80 Påvisning av fullt humane immunglobuliner i hybridomsupernatanter Siden GenPharm-musen kan danne immunglobulinkjeder fra både mus og menneske, ble to separate EIA-analyser anvendt for å analysere vekstpositive hybridomkloner for nærvær av både humane lettkjeder og humane tungkjeder. Plater ble belagt som beskrevet ovenfor, og ufortynnede hybridomsupernatanter ble inkubert på platene i 1 time ved 37ºC. Platene ble vasket og analysert med enten HRP-konjugert anti-human kappaantistoff fra geit (Southern Biotech) fortynnet 1: 000 i 1% BSA-HBSS eller HRPkonjugert anti-human IgG Fc-spesifikt antistoff fra geit fortynnet 1: 000 i 1% BSA- HBSS i 1 time ved 37ºC. Platene ble så inkubert med substratløsning som beskrevet ovenfor. Hybridomkloner som ikke ga positivt signal i både anti-human kappa- og antihuman IgG Fc-EIA-format ble forkastet. 1 Isotyping Isotypebestemmelse av antistoffene ble oppnådd ved anvendelse av EIA i et format som tilsvarer det anvendt for analyse av museimmunserum for spesifikt titer. EIA-plater ble belagt med anti-human IgG (H+L) fra geit ved μg/ml i natriumkarbonatbuffer over natten ved 4ºC og blokkert som beskrevet ovenfor. Rene supernatanter fra 24-brønners kulturer ble inkubert på platen i 1 time ved romtemperatur. Platen ble vasket og analysert med HRP-merket geite-anti-human IgG 1, IgG 2, IgG 3 eller IgG 4 (Binding Site) fortynnet 1:4 000 i 1% BSA-PBS i 1 time ved romtemperatur. Platen ble igjen vasket og inkubert med substratløsning som beskrevet ovenfor. Resultater og diskusjon 2 Dannelse av fullt ut humane monoklonale anti-human TNF!-antistoffer En fusjon, betegnet GenTNV, ble uført fra en GenPharm-mus immunisert med rekombinant humant TNF!-protein. Fra denne fusjonen ble 196 vekstpositive hybrider analysert. Det ble påvist åtte hybridomcellelinjer som utskilte fullt ut humane IgG-antistoffer som reagerte med human TNF!. Disse åtte cellelinjene utskilte alle immunglobuliner av human IgG1κ-isotype og alle ble subklonet to ganger ved begrensende fortynning for erholdelse av stabile cellelinjer (>90% homogene). Cellelinjenavn og de tilhørende C- kodebetegnelser er opplistet i tabell 1. Alle cellelinjer ble nedfrosset i 12-ampullers forskningscellebanker lagret i flytende nitrogen. 3 Parenterale celler oppsamlet fra brønner fra en 24-brønners dyrkningsplate for hver av de åtte cellelinjene ble levert over til Molecular Biology-gruppen 18. februar 1999 for transfeksjon og videre karakterisering.

82 81 Tabell 1: GenTNV-cellelinjebetegnelser Navn GenTNV GenTNV GenTNV GenTNV GenTNV GenTNV GenTNV GenTNV C-kodebetegnelse C414A C41A C416A C417A C418A C419A C4A C421A Konklusjon GenTNV-fusjonen ble utført ved benyttelse av splenocytter fra en hybrid mus som inneholdt antistofftransgener for humant variabelt og konstant område som var immunisert med rekombinant human TNF! fremstilt hos Centocor. Åtte fullt ut humane monoklonale TNF!-reaktive IgG-antistoffer av IgG1κ-isotype ble fremstilt. Cellelinjene ble overført til Molecular Biology-gruppen for videre karakterisering og utvikling. Et av disse nye humane antistoffene kan vise seg anvendbart ved anti-inflammatorisk behandling, med mulige fordeler når det gjelder redusert immunogenisitet og komplikasjoner av allergitype, sammenlignet med Remicade. 1 Referanser: 1. Tayloer et al., International Immunology 6:79-91 (1993). 2. Lonberg et al., Nature 368:86-89 (1994). 3. Neuberger, M., Nature Biotechnology 14:826 (1996). 4. Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:84-81 (1996).. Scallon et al., Cytokine 7: (199). Eksempel 3: Kloning og fremstilling av cellelinjer som uttrykker humant anti- TNF!-antistoff 2 Oppsummering Et sett med åtte humane monoklonale antistoffer (mab) med TNV-betegnelse ble funnet å binde immobilisert human TNF med tilsynelatende høy aviditet. Syv av de åtte mab ble vist å effektivt blokkere hutnf!-binding til en rekombinant TNF-reseptor.

83 82 Sekvensanalyse av DNA som koder for de syv mab bekreftet at alle mab hadde humane V-områder. DNA-sekvensene viste også at tre par av disse mab var identiske, slik at det opprinnelige sett med åtte mab kun inneholdt fire adskilte mab, representert ved TNV14, TNV1, TNV148 og TNV196. Basert på analyser av den utledede aminosyresekvens til disse mab og resultater fra in vitro TNF!-nøytraliseringsverdier ble de monoklonale antistoffene TNV148 og TNV14 utvalgt for videre undersøkelser. 1 Siden prolinresten i posisjone 7 (rammeverk 3) i TNV148-tungkjeden ikke ble funnet i samme posisjon i andre humane antistoffer fra samme undergruppe under et databasesøk, ble setestyrt DNA-mutagenese utført for å innføre en serinrest i denne posisjonen, slik at sekvensen var tilpasset til kjente rammeverk e-sekvenser fra kimcellelinjer. Det serinmodifiserte mab ble betegnet TNV148B. PCR-amplifisert DNA som kodet for variable områder fra tungkjede og lettkjede fra TNV148B og TNV14 ble klonet inn i nyfremstilte ekspresjonsvektorer som var basert på de nylig klonede tungkjede- og lettkjedegenene fra et annet humant mab (12B7), beskrevet i U.S. patentsøknad nr. (ikke angitt) innlevert 7. oktober 00, med tittelen IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses. 2 P3X63Ag8.63 (63)-celler eller Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) musemyelomceller ble transfektert med disse tungkjede- og lettekjedeekspresjonsplasmidene og analysert gjennom to subkloningsrunder for cellelinjer som dannet rekombinant TNV148B og TNV14 (rtnv148b og rtnv14) mab i høyt nivå. Evaluering av vekstkurver og stabilitet av mab-produksjonen over tid tydet på av 63-transfektantklonene C466D og C466C stabilt dannet tilnærmet 12 μg/ml rtnv148b mab i utvokste kulturer, mens Sp2/0- transfektant (C467A) stabilt dannet tilnærmet 2 μg/ml rtnv148b mab i utvokste kulturer. Tilsvarende analyser tydet på at Sp2/0-transfektantklon C476A dannet 18 μg/ml rtnv14 i utvokste kulturer. 3 Innledning Et sett med åtte mab avledet fra human TNV!-immuniserte GenPharm/Medarex-mus (HCo12/KCo-genotype) ble tidligere vist å binde human TNF! og ha en fullt ut human IgG1 kappa-isotype. En enkel bindingsanalyse ble anvendt for å fastslå hvorvidt det var sansynlig at de eksemplariske mab ifølge oppfinnelsen hadde TNF!-nøytraliserende aktivitet ved å evaluere deres evne til å blokkere binding av TNF! til rekombinant TNF-reseptor. Basert på disse resultater, DNA-sekvensresultater og in vitrokarakterisering av flere av disse mab ble TNV148 utvalgt som det mab som skulle karakteriseres videre.

84 83 DNA-sekvenser som kodet for TNV148 mab ble klonet, modifisert til å passe inn i genekspresjonsvektorer som koder for egnede konstante områder, innført i de velkarakteriserte musemyelomcellelinjene 63 og Sp2/0, og resulterende transfekterte cellelinjer analysert inntil det ble påvist subkloner som dannet 40 ganger mer mab enn den opprinnelige hybridomcellelinje. Materialer og fremgangsmåter 1 Reagenser og celler TRIZOL-reagens ble erholdt fra Gibco BRL. Proteinase K ble erholdt fra Sigma Chemical Company. Revers transkriptase ble erholdt fra Life Sciences, Inc. Taq DNA Polymerase ble erholdt fra enten Perkin Elimer Cetus eller Gibco BRL. Restriksjonsenzymer ble erholdt fra New England Biolabs. QIAquick PCR Purification Kit var fra Qiagen. Et QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit ble erholdt fra Stratagene. Wizrd plasmidminiprepsett og RNasin var fra Promega. Optiplater ble erholdt fra Packard. 12 jod ble erholdt fra Amersham. Skreddersydde oligonukleotider ble erholdt fra Keystone/Biosource International. Navn, identifikasjonsnummer og sekvens for oligonukleotidene som ble anvendt i dette arbeid er vist i tabell 1. 2 Tabell 1. Oligonukleotider anvendt for kloning, modifisering eller sekvensering av TNV mab-gener Aminosyrene som kodes av oligonukleotid 14s og HuH-J6 er vist ovenfor sekvensen. M -aminosyreresten representerer translasjonsstartkodonet. De understrekede sekvenser i oligonukleotid 14s og HuH-J6 angir BsiWI hhv. HstBI-restriksjonssetet. Streken i HuH-J6 tilsvarer ekson/intron-grensen. Bemerk at oligonukleotider hvis sekvens tilsvarer minus-tråden er skrevet i 3 - retning.

85 84 Navn I.D. Sekvens HG1-4b TTGGTCCAGTCGGACTGG- HG1-b CACCTGCACTCGGTGCTT- HG1hg CACTGTTTTGAGTGTGTACGGGCTTAAGTT- HG GCCGCACGTGTGGAAGGG- HCK1-3E AGTCAAGGTCGGACTGGCTTAAGTT- HuK-3 Hd 8 3 -GTTGTCCCCTCTCACAATCTTCGAATTT- HVKRNAseq GGCGGTAGACTACTCGTC- BstWI M D W T W S I 14s 366 -TTTCGTACGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATC-3 46s 367 -TTTCGTACGCCACCATGGGGTTTGGGCTGAGCTG-3 47s 368 -TTTCGTACGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCATG s 369 -TTTCGTACGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTC-3 73s 370 -TTTCGTACGCCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTC-3 T V T V S S BstBI HuH-J GTGCCAGTGGCAGAGGAGTC/CATTCAAGCTTAAGTT- SalI M D M R V LK7s 362 -TTTGTCGACACCATGGACATGAGGGTCC(TC)C-3 LVgs 363 -TTTGTCGACACCATGGAAGCCCCAGCTC-3 2 T K V D I K Afl2 HuL-J CTGGTTTCACCTATAGTTTG/CATTCAGAATTCGGCGCCTTT V148-QC CATCTCCAGAGACAATtCCAAGAACACGCTGTATC-3 V148-QC GTAGAGGTCTCTGTTAaGGTTCTTGTGCGACATAG - 3 En enkelt nedfrosset ampulle av 63-musemyelomceller ble erholdt. Ampullen ble opptint samme dag og ekspandert i T-flasker i IMDM, % FBS, 2 mm Glutamin (medium). Disse cellene ble holdt i kontinuerlig kultur inntil de ble transfektert 2 til 3 uker senere med anti-tnf-dna som beskrives her. Noen av kulturene ble høstet dager etter opptiningsdatoen, nedsentrifugert ved sentrifugering og resuspendert i 9% FBS, % DMSO, fordelt på ampuller, frosset ned og lagret for fremtidig bruk. På tilsvarende måte ble en enkelt nedfrosset ampulle med Sp2/0-musemyelomceller erholdt. Ampullen

86 8 ble opptint, nye ampuller for nedfrysning fremstilt som beskrevet ovenfor, og de nedfrosne ampuller lagret i CBC-frysebokser AA og AB. Disse cellene ble opptint og anvendt for alle Sp2/0-transfeksjoner som beskrives her. 1 Analyse for inhibering av TNF-bindingn til reseptor Hybridomcellesupernatanter som inneholdt TNV-mAb ble anvendt for analyse av de monoklonale antistoffers evne til å blokkere binding av 12 I-merket TNF! til de rekombinante TNF-reseptorfusjonsprotein, p-sf2 (Scallon et al. (199) Cytokine 7:79-770). 0:1 av p-sf2 ved 0, μg/ml i PBS ble tilsatt til optiplater for å belegge brønnene i løpet av 1 times inkubering ved 37ºC. Seriefortynninger av de åtte TNVcellesupernatanter ble fremstilt i 96-brønners plater med rund bunn ved anvendelse av PBS/0,1% BSA som fortynningsmiddel. Cellesupernatant som inneholdt anti-il-18- mab inngikk som negativ kontroll, likeså den samme anti-il-18-supernatant tilsatt ca2 (chimert anti-tnf-antistoff, Remicade, U.S. patentskrift nr.,770,198) inngikk som positiv kontroll. 12 I-merket TNF! (8 μci/μg, D. Shealy) ble tilsatt til 0 μl cellesupernatanter til en sluttkonsentrasjon av TNF! på ng/ml. Blandingen ble preinkubert i 1 time ved romtemperatur. De belagte optiplatene ble vasket for fjerning av ubundet p-sf2 og 0 μl 12 I-TNF!/cellesupernatantblanding ble overført til optiplatene. Etter 2 timer ved romtemperatur ble optiplatene vasket tre ganger med PBS-Tween. 0 μl Microscint- ble tilsatt og cpm bundet bestemt ved anvendelse av en TopCountgammateller. 2 Amplifisering av V-gener og DNA-sekvensanalyse Hybridomceller ble vasket en gang med PBS før tilsetning av TRIZOL-reagens for RNA-fremstilling. Mellom 7x 6 og 1,7x 7 celler ble resuspendert i 1 ml TRIZOL. Rørene ble rystet kraftig etter tilsetning av 0 μl kloroform. Prøvene ble sentrifugert ved 4ºC i minutter. Vannfasen ble overført til et nytt mikrosentrifugerør, og et likt volum isopropanol ble tilsatt. Rørene ble rystet kraftig og inkubert ved romtemperatur i minutter. Prøvene ble så sentrifugert ved 4ºC i minutter. Nedsentrifugert materiale ble vasket en gang med 1 ml 70% etanol og tørket i kort tid i en vakuumtørker. Nedsentrifugert RNA ble resuspendert i 40 μl DEPC-behandlet vann. Kvaliteten av RNApreparatene ble bestemt ved å fraksjonere 0, μl i en 1% agarosegel. RNA ble lagret i en -80ºC fryser inntil bruk. 3 For fremstilling av tungkjede- og lettkjede-cdna ble det fremstilt blandinger som omfattet 3 μl RNA og 1 μg av enten oligonukleotid 119 (tungkjede) eller oligonukleotid 117 (lettkjede) (se tabell 1) i et volum på 11, μl. Blandingen ble inkubert ved 70ºC i

87 86 minutter i et vannbad og så avkjølt på is i minutter. Det ble fremstilt en separat blanding som besto av 2, μl X revers transkriptasebuffer, μl 2, mm dntp, 1 μl revers transkriptase ( enheter) og 0,4 μl ribonukleaseinhibitor RNasin (1 enhet). 13, μl av denne blandingen ble tilsatt til de 11, μl avkjølt RNA/oligonukleotidblanding og reaksjonsblandingen ble inkubert i 40 minutter ved 42ºC. cdna-syntesereaksjonen ble så lagret i en -ºC fryser til den skulle brukes Urenset tungkjede- og lettkjede-cdna ble anvendt som templat for PCR-amplifisering av de kodende sekvenser fra det variable området. Fem oligonukleotidpar (366/34, 367/34, 368/34, 369/34 og 370/34, tabell 1) ble samtidig analysert for evne til å prime amplifisering av tungkjede-dna. To oligonukleotidpar (362/8 og 363/8) ble samtidig analysert for evne til å prime amplifisering av lettkjede-dna. PCRreaksjonene ble utført ved anvendelse av to enheter PLATINUM high fidelity (HIFI) Taq DNA-polymerase i et totalvolum på 0 μl. Hver reaksjon omfattet 2 μl fra en cdna-reaksjon, pmol av hvert oligonukleotid, 0,2 mm dntp, μl xhifi-buffer, og 2 mm magnesiumsulfat. Programmet i den programmerbare varmeblokken var 9ºC i minutter, fulgt av sykluser bestående av (94ºC i sekunder, 62ºC i sekunder og 68ºC i 1, minutter). Det ble så utført en avsluttende inkubering ved 68ºC i minutter. For å forberede PCR-produktene for direkte DNA-sekvensering ble de renset ved anvendelse av QIAquick PCR Purification Kit ifølge produsentens fremgangsmåter. DNA ble eluert fra sentrifugeringskolonnen ved anvendelse av 0 μl sterilt vann og så tørket til et volum på μl ved anvendelse av en vakuumtørker. DNAsekvenseringsreaksjoner ble så satt opp med 1 μl renset PCR-produkt, μm oligonukleotidprimer, 4 μl BigDye Terminator ferdiglaget reaksjonsblanding og 14 μl sterilt vann til et totalvolum på μl. Tungkjede-PCR-produkter fremstilt med oligonukleotidparet 367/34 ble sekvensert med oligonukleotidprimerene 19 og 360. Lettkjede-PCR-produkter fremstilt med oligonukleotidparet 363/8 ble sekvensert med oligonukleotidene 34 og 163. Sekvenseringsprogrammet i den programmerbare varmeblokken var 2 sykluser bestående av (96ºC i sekunder, 0ºC i 1 sekunder, 60ºC i 4 minutter), fulgt av inkubering over natten ved 4ºC. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert gjennom en polyakrylamidgel og påvist ved anvendelse av et ABI 377 DNAsekvenseringsinstrument. Setestyrt mutagenese for endring av en aminosyre Et enkelt nukleotid i DNA-sekvensen for det variable tungkjedeområdet i TNV148 ble

88 87 1 endret for å erstatte Pro 7 med en serinrest i TNV148-mAb. Komplementære oligonukleotider, 399 og 400 (tabell 1), ble utformet og bestilt for å innføre denne endringen ved benyttelse av det unike BsiWI-kloningssetet like oppstrøms for translasjonsinitieringssetet, ifølge produsentens fremgangsmåter. Det resulterende plasmid ble betegnet p1747. For innføring av et BstBI-sete i den 3 -enden av det variable området ble en oligonukleotidprimer utformet med SalI- og BstBI-seter. Denne primeren ble anvendt sammen med puc-revers primer for amplifisering av et fragment på 2,7 kb fra p1747. Dette fragment ble så klonet tilbake i det naturlig foreliggende SalI-setet i det variable området i 12B7 og et HindIII-sete, hvorved det ble innført et unikt BstBI-sete. Den resulterende intermediære vektor, betegnet p170, kunne akseptere fragmenter av variabelt område med BsiWI- og BstBI-ender. For fremstilling av en versjon av tungkjedevektor hvori det konstante omådet også var avledet fra 12B7-genet, ble BamHI- HindIII-innskuddet i p170 overført til pbr322 for å få et EcoRI-sete plassert nedstrøms for HindIII-setet. Det resulterende plasmid, p1768, ble så kuttet med HindIII og EcoRI og ligert til et HindIII-EcoRI-fragment på,7 kb fra p1744, en subklon avledet ved å klone det store BamHI-BamHI-fragment fra p160 inn i pbc. Det resulterende plasmid, p1784, ble så anvendt som vektor for TNV ab-cdna-fragmentene med Bsi- WI- og BstBI-ender. Ytterligere arbeid ble utført for fremstilling av ekspresjonsvektorene p1788 og p1798, som omfatter det konstante IgG1-området fra 12B7-genet og som er forskjellige fra hverandre når det gjelder hvor mye av 12B7-tungkjede-J-Cintronet de inneholder. 2 3 For modifisering av en 12B7-lettkjedegenet i plasmid p188, ble et SalI/AflIIfragment på,7 kb som inneholdt 12B7-promoteren og det variable området overført fra p18 til XhoI/AflII-setene i plasmid L28. Dette nye plasmid, p174, ga en mindre templat for mutagenesetrinnet. Oligonukleotidene (C340salI og C340sal2) ble anvendt for innføring av et unikt SalI-restriksjonssete i den ende av det variable området ved QuickChange -mutagenese. Den resulterende intermediære vektor, p1746 hadde unike restriksjonsseter for SalI og AflII i hvilke fragmenter av variabelt område kunne klones. Et hvert fragment fra variabelt område klonet i p1746 vil fortrinnsvis kobles til den 3 halvdel av lettkjedegenet. For fremstilling av et restriksjonsfragment fra den 3 halvpart av 12B7-lettkjedegenet som kunne anvendes for dette formål ble oligonukleotidene BAHN-1 og BAHN-2 hybridisert sammen for dannelse av en dobbelttrådet linker som inneholdt restriksjonssetene BsiW1, AflII, HindII og NotI, og som inneholdt ender som kunne ligeres inn i KpnI- og SacI-seter. Denne linkeren ble klonet mellom KpnIsetet og SacI-setet i pbc for erholdelse av plasmid p177. Et fragment på 7,1 kb som inneholdt det konstante området fra 12B7-lettkjeden, dannet ved å kunne en p18

89 88 med AflII og så partiell kutting med HindIII, ble klonet mellom AflII-setet og HindIIsetet i p177 for erholdelse av p1762. Dette nye plasmid inneholdt unike seter for Bsi- WI og AflII, til hvilke BsiWI/AflII-fragmentet som inneholdt promoteren og de variable områder kunne overføres slik at de to halvparter av genet ble slått sammen. 1 2 cdna-kloning og oppbygging av ekspresjonsplasmider Alle RT-PCR-reaksjoner (se ovenfor) ble behandlet med Klenow-enzym for innfylling av DNA-endene. Tungkjede-PCR-fragmenter ble kuttet med restriksjonsenzymene BsiWI og BstBI og så klonet mellom BsiWI-setet og BstBI-setet i plasmid L28 (L28 ble anvendt siden den 12B7-baserte intermediære vektor p170 ennå ikke var fremstilt. DNA-sekvensanalyse av de klonede innskudd viste at de resulterende konstruksjoner var korrekte og at ingen feil var innført under PCR-amplifiseringen. Identifikasjonsnummerene som er gitt disse L28-plasmidkonstruksjonene (for TNV14, TNV1, TNV148, TNV148B og TNV196) er vist i tabell 2. BsiWI/BstBI-innskuddene for TNV14-, TNV148- og TNV148B-tungkjeder ble overført fra L28-vektoren til den nylig fremstilt intermediære vektor p170. Identifikasjonsnummerene som er tildelt disse intermediære plasmidene er vist i tabell 2. Dette kloningstrinn og påfølgende trinn ble ikke utført for TNV1 og TNV196. De variable områdene ble så overført til to forskjellige humane IgG1-ekspresjonsvektorer. Restriksjonsenzymene EcoRI og HindIII ble anvendt for å overføre de variable områdene til den IgG1-vektor som Centocor tidligere hadde anvendt, p4. De resulterende ekspresjonsplasmidene, som koder for et IgG1 av Gm(f+)-allotype, ble betegnet p1781 (TNV14), p1782 (TNV148), og p1783 (TNV148B) (se tabell 2). De variable områdene ble også klonet oppstrøms for IgG1 konstant område avledet fra 12B7-genet (Gen- Pharm). Disse ekspresjonsplasmidene, som koder for et IgG1 av G1m(z)-allotype, er også opplistet i tabell 2. 3 Tabell 2. Plasmididentifikasjonsnummere for forskjellige tungkjede- og lettkjedeplasmider L28-vektor eller pbc-vektor representerer den opprinnelige Ab-cDNA-klon. Innskuddene i disse plasmidene ble overført til en ufullstendig 12B7-basert vektor for fremstilling av de intermediære plasmider. Ytterligere et overføringstrinn førte til de endelige ekspresjonsplasmider, som enten ble innført i celler etter linearisering eller anvendt for rensing av mab-geninnskudd før celletransfeksjon. (ND) = ikke utført.

90 89 mab L28-vektor Plasmid ID Intermediat Plasmid ID Gm(f+) ekspresjon Plasmid ID Glm(z) ekspresjon Plasmid ID Tungkjeder TNV14 p171 p1777 p1781 p1786 TNV1 p172 (ND) (ND) (ND) TNV148 p173 p1778 p1782 p1787 TNV148B p1760 p1779 p1783 p1788 TNV196 p174 (ND) (ND) (ND) pbc-vektor Plasmid ID Intermediat Plasmid ID Ekspresjon Plasmid ID Lettkjede TNV14 p1748 p17 p177 TNV1 p1748 p17 p177 TNV148 p1749 p176 p1776 TNV196 p1749 p176 p1776 Lettkjede-PCR-produkter ble kuttet med restriksjonsenzymene SalI og SacII og så klonet mellom SalI-setet og SacII-setet i plasmid pbc. De to forskjellige lettkjedeversjonene, som avvek fra hverandre i en aminosyre, ble betegnet p1748 og p1749 (tabell 2). DNA-sekvensanalyse bekreftet at disse konstruksjonene hadde korrekt sekvens. SalI/AflII-fragmentene i p1748 og p1749 ble så klonet mellom SalI-setet og AflII-setet i den intermediære vektor p1746 for fremstilling av p17 hhv. p176. Disse halvdeler av lettkjedegenene ble så koblet til de 3 halvdeler av genet ved å overføre BsiWI/AflIIfragmentene fra p17 og p176 til den nylig fremstilte konstruksjonen p1762 for erholdelse av de endelige ekspresjonsplasmidene p177 hhv. p1776 (tabell 2). 1 Celletransfeksjon, analyse og subkloning I alt 1 transfeksjoner av musemyelomceller ble utført med de forskjellige TNVekspresjonsplasmidene (se tabell 3 i seksjonen Resultater og diskusjon). Disse transfeksjonene skilte seg fra hverandre når det gjaldt (1) vertscellene, som var Sp2/0 eller 63; 82) tungkjedens konstante område, som var kodet av den tidligere benyttede IgG1- vektor fra Centocor eller tungkjedens konstante område i 12B7; (3) de angjeldende mab var TNV148B, TNV148, TNV14 eller en ny HC/LC-kombinasjon; (4) hvorvidt DNA var linearisert plasmid eller renset Ab-geninnskudd; og () nærvær eller fravær av

91 90 den komplette J-C-intronsekvens i tungkjedegenet. I tillegg ble flere av transfeksjonene gjentatt for å øke sjansen for at et stort antall kloner kunne analyseres. 1 Sp2/0-celler og 63-celler ble begge transfektert med en blanding av tungkjede- og lettkjede-dna (8-12 μg av hver) ved elektroporering under standard betingelser som beskrevet tidligere (Knight, DM. et al. (1993) Molecular Immunology : ). For transfeksjon nr. 1, 2, 3 og 16, ble de angjeldende ekspresjonsplasmider linearisert med kutting med et restriksjonsenzym før transfeksjonen. For eksempel ble restriksjonsenzymene SalI og NotI anvendt for linearisering av TNV148B-tungkjedeplasmid p1783 hhv. lettkjedeplasmid p1776. For de gjenværende transfeksjoner ble DNAinnskudd som kun inneholdt mab-genet separert fra plasmidvektoren ved å kutte tungkjedeplasmider med BamHI og lettkjedeplasmider med BsiWI og NotI. mabgeninnskuddene ble så renset ved agarosegelelektroforese og Qiex-renseresiner. Celler transfektert med rensede geninnskudd ble samtidig transfektert med 3- μg PstIlinearisert plasmid psv2gpt (p13) som kilde for en seleksjonsmarkør. Etter elektroporeringen ble cellene utsådd i 96-brønners vevsdyrkningsplater i IMDM, 1% FBS, 2 mm glutamin og inkubert ved 37ºC i en inkubator med % CO 2. To dager senere ble et likt volum IMDM, % FBS, 2 mm glutamin, 2xMHX-seleksjon (1xMHX = μg/ml mykofenolsyre, 2, μg/ml hypoksantin, 0 μg/ml xantin) tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 2 til 3 uker mens kolonier ble dannet. 2 Cellesupernatanter oppsamlet fra brønner med kolonier ble analysert for human IgG ved ELISA som beskrevet. Kort beskrevet, ble forskjellige fortynninger av cellesupernatantene inkubert i 96-brønners EIA-plater belagt med polyklonalt anti-humant IgG Fcfragment fra geit, hvoretter bundet humant IgG ble påvist ved anvendelse av alkalisk fosfatasekonjugert anti-humant IgG(H+L) fra geit og de tilhørende fargede substrater. Standardkurver, som benyttet som standard det samme rensede mab som var målt i cellesupernatantene, inngikk for hver EIA-plate for å tillate kvantifisering av humant IgG i supernatantene. Cellene i kolonier som så ut til å danne mest humant IgG ble overført til 24-brønners plater for ytterligere bestemmelse av produksjonen i utvokste kulturer, og utgangsklonene som produserte mest ble deretter påvist. 3 Utgangsklonene som produserte mest ble subklonet for påvisning av subkloner med høyere produksjon og for fremstilling av en mer homogen cellelinje. 96-brønners vevsdyrkningsplater ble inokulert med en celle pr. brønn eller fire celler pr. brønn i IMDM, % FBS, 2 mm glutamin, 1xMHX og inkubert ved 37ºC i en inkubator med % CO 2 i 12- dager inntil koloner tydelig kunne ses. Cellesupernatanter ble oppsamlet fra brøn-

92 91 ner som inneholdt en koloni pr. brønn og analysert ved ELISA som beskrevet ovenfor. De utvalgte koloniene ble utvalgt til 24-brønners plater, og kulturene fikk vokse ut før subklonene med den høyeste produksjon ble påvist ved å kvantifisere nivået av humant IgG i supernatanten. Denne prosessen ble gjentatt ved at de utvalgte subkloner fra første runde fikk gjennomgå nok en runde med subkloning. De beste subklonene fra andre runde ble valgt som cellelinjer for videre uvikling. 1 Karakterisering av cellesubkloner De beste subklonene fra andre runde ble valgt og vekstkurver fremstilt for å evaluere mab-produksjonsnivået og cellevekstegenskaper. T7-flasker ble inokulert med 1x celler/ml i ml IMDM, % FBS, 2 mm glutamin og 1xMHX (eller serumfritt medium). Uttak på 0 μl ble tatt hver 24. time og tettheten av levende celler bestemt. Analysene fortsatte inntil antall levende celler var mindre enn 1x celler/ml. De oppsamlede uttak av cellesupernatanter ble analysert for konsentrasjonen av det foreliggende antistoff. ELISA-analyser ble utført ved å benytte som standard rtnv148b eller rtnv14 JG Prøvene ble inkubert i 1 time på ELISA-plater belagt med polyklonalt anti-humant IgG Fc fra geit og bundet mab påvist med alkalisk fosfatasekonjugert anti-humant IgG(H+L) fra geit i en fortynning på 1:00. 2 En annen type vekstkurveanalyse ble utført for to cellelinjer for å sammenligne veksthastigheten i nærvær av forskjellige mengder MHX-seleksjon. Cellelinjene C466A og C466B ble opptint i MHX-fritt medium (IMDM, % FBS, 2 mm glutamin) og dyrket i ytterligere 2 dager. De to cellekulturene ble så hver oppdelt i tre kulturer som enten inneholdt intet MHX, 0,2xMHX, eller 1xMHX (1xMHX = 0, μg/ml mykofenolsyre; 2, μg/ml hypoksantin, 0 μg/ml xantin). En dag senere, ble nye T7-flasker inokulert med kulturene i en utgangstetthet på 1x celler/ml, og cellene ble talt hver 24. time i en uke. Det ble ikke oppsamlet uttak for måling av mab-produksjonen. Doblingstiden ble beregnet for disse prøvene ved å benytte formelen som foreligger i SOP PD Ytterligere undersøkelser ble utført for å evaluere stabiliteten av mab-produksjonen over tid. Kulturene ble dyrket i 24-brønners plater i IMDM, % FBS, 2 mm glutamin, enten med eller uten MHX-seleksjon. Kulturene ble splittet til nye kulturer når de ble konfluente, og den opprinnelige kultur fikk vokse ut. På dette tidspunkt ble det tatt et uttak av supernatanten og lagret ved 4ºC. Uttak ble foretatt over et tidsrom på -78 dager. Etter dette tidsrom ble supernatantene analysert for mengde antistoff ved antihuman IgG Fc-ELISA-analysen som er skissert ovenfor.

93 92 Resultater og diskusjon 1 Inhibering av TNF-binding til rekombinant reseptor En enkel bindingsanalyse ble utført for å fastslå hvorvidt de åtte TNV-mAb i hybridomcellesupernatant kunne blokkere binding av TNF! til reseptor. Konsentrasjonen av TNV-mAb i de angjeldende cellesupernatanter ble først bestemt ved standard ELISAanalyse av humant IgG. Et rekombinant p TNF-reseptor/IgG-fusjonsprotein, p-sf2, ble så belagt på EIA-plater og 12 I-merket TNF! fikk binde seg til p-reseptoren i nærvær av forskjellige mengder TNV-mAb. Som vist i figur 1, blokkerte alle de åtte TNV-mAb bortsett fra ett (TNV122) effektivt binding av TNF! til p-reseptoren. Faktisk så disse TNV-mAb ut til å inhibere TNV!-bindingen mer effektivt enn ca2-positivt kontroll-mab som var tilsatt til den negative kontrollhybridomsupernatant. Disse resultater ble tolket til å tyde på at disse TNV-mAb høyst sansynlig ville blokkere bioaktiviteten av TNF! i cellebasert analyser og in vivo og det var derfor nødvendig med ytterligere analyser. DNA-sekvensanalyse 2 3 Bekreftelse av at de isolerte RNA koder for humane mab Som et første trinn i karakterisering av de syv TNV-mAb (TNV14, TNV1, TNV32, TNV86, TNV118, TNV148 og TNV196) som viste TNF!-blokkerende aktivitet i reseptorbindingsanalysen ble total-rna isolert fra de syv hybridomcellelinjene som dannet disse mab. Hver RNA-prøve ble så anvendt for fremstilling av cdna for tungkjede eller lettkjede fra humant antistoff som omfattet den fullstendige signalsekvens, den fullstendige sekvens for variabelt område og en del av sekvensen for konstant område for hvert mab. Disse cdna-produktene ble så amplifisert i PCR-reaksjoner, hvoretter PCR-amplifisert DNA ble sekvensert direkte uten først å klone fragmentene. De sekvenserte tungkjede-cdna var >90% identisk med et av de fem humane kimcellelinjegenene som forelå i musene, DP-46 (figur 2). På tilsvarende måte var de sekvenserte lettkjede-cdna enten 0% eller 98% identiske med et av de humane kimcellelinjegenene som forelå i musen (figur 3). Disse sekvensresultatene bekreftet at RNAmolekylene som var transkribert til cdna og sekvensert kodet for tungkjeder og lettkjeder fra humant antistoff. Det bør bemerkes at siden de variable områder var PCRamplifisert ved benyttelse av oligonukleotider som tilsvarer den ende av sekvensen som koder for signalsekvensen, er de første få aminosyrene i signalsekvensen ikke nødvendigvis den faktiske sekvens i de opprinnelige TNV-translasjonsproduktene, men de representerer de faktiske sekvenser i de rekombinante TNV-mAb.

94 93 1 Unike nøytraliserende mab Analyser av cdna-sekvensene for de fullstendige variable områdene i både tungkjede og lettkjede fra hvert mab viste at TNV32 er identisk med TNV1, TNV118 er identisk med TNV14, og TNV86 er identisk med TNV148. Resultatene fra reseptorbindingsanalysen var i samsvar med DNA-sekvensanalysene, dvs. at både TNV86 og TNV148 var tilnærmet fire ganger bedre enn TNV118 og TNV14 når det gjelder blokkering av TNFbinding. Det påfølgende arbeidet fokuserte derfor på de fire unike TNV-mAb, TNV14, TNV1, TNV148 og TNV196. Slektskapet mellom de fire mab DNA-sekvensresultatene viste at genene som koder for tungkjedene i de fire TNV-mAb var svært homologe, og alle så ut til å være avledet fra samme kimcellelinjegen, DP-46 (figur 2). Siden tungkjede-cdr3-sekvensene er så like og har samme lengde, og siden alle benytter J6-eksonet, har de i tillegg sansynligvis oppstått fra en enkelt VDJgenrearrangeringsbegivenhet fulgt av somatiske endringer som gjorde vært mab unikt. DNA-sekvensanalyser viste at det kun var to adskilte lettkjedegener blant de fire mab (figur 3). Sekvensene som koder for lettkjedens variable områder i TNV14 og TNV1 er identiske med hverandre og med en representativ kimcellelinjesekvens fra Vg/38Kfamilien av humane kappakjeder. Sekvensene som koder for lettkjede i TNV148 og TNV196 er identiske med hverandre, men avviker fra kimcellelinjesekvensen i to nukleotidposisjoner (figur 3). 2 Den utledede aminosyresekvens for de fire mab viste slektskapet mellom de foreliggende mab. De fire mab inneholder fire adskilte tungkjeder (figur 4), men kun to adskilte lettkjeder (figur ). Forskjeller mellom TNV-mAb-sekvensene og kimcellelinjesekvensene var stort sett begrenset til CDR-domener, men tre av mab-tungkjedene avvek også fra kimcellelinjesekvensen i rammeverkskområdene (figur 4). Sammenlignet med de DP-46-kimcellelinjekodede Ab-rammeverksområdene var TNV14 identisk, TNV1 avvek i en aminosyre, TNV148 avvek i to aminosyrer og TNV196 avvek i tre aminosyrer. Kloning av cdna, setespesifikk mutagenese og oppbygging av de endelige ekspresjonsplasmider 3 Kloning av cdna Basert på DNA-sekvensen til de PCR-amplifiserte variable områder ble det bestilt nye

95 oligonukleotider for å utføre nok en runde med PCR-amplifisering for tilpassing av den kodende sekvens til kloning i ekspresjonsvektorer. For tungkjedene, ble produktene fra denne andre runde med PCR kuttet med restriksjonsenzymene BsiWI og BstBI og klonet i plasmidvektoren L28 (plasmididentifikasjonsnummere er vist i tabell 2). For lettkjedene ble PCR-produktene fra andre runde kuttet med SalI og AflII og klonet i plasmidvektoren pbc. Enkeltkloner ble så sekvensert for å bekrefte at sekvensen var identisk med tidligere sekvens erholdt ved direkte sekvensering av PCR-produkter, som viser det hyppigst forekommende nukleotid i hver posisjon i en muligens heterogen populasjon av molekyler. Sete-spesifikk mutagenese for endring av TNV148 De to mab TNV148 og TNV196 ble gjennomgående observert å være fire ganger mer effektive enn det nest beste mab (TNV14) når det gjelder nøytralisering av bioaktiviteten av TNV!. Som beskrevet ovenfor, avvek imidlertid tungkjedens rammeverksekvenser i TNV148 og TNV196 fra kimcellelinjens rammeverksekvenser. En sammenligning av tungkjedesekvensen i TNV148 med andre humane antistoffer viste at flere andre humane mab inneholdt en Ile-rest i posisjon 28 i rammeverk 1 (kun medregnet den modne sekvens), mens Pro-resten i posisjon 7 i rammeverk 3 var en uvanlig aminosyre i denne posisjon. En tilsvarende sammenligning av tungkjeden i TNV196 tydet på at de tre aminosyrene som denne avviker i fra kimcellelinjesekvensen i rammeverk 3 kan være sjeldne i humane mab. Det forelå en mulighet for at disse forskjellene kunne gjøre TNV148 og TNV196 immunogene ved tilførsel til mennesker. Siden TNV148 kun hadde en aminosyrerest som kunne volde bekymring, og siden denne aminosyrerest ble antatt å være uviktig for binding av TNF! ble det benyttet en setespesifikke mutageneseteknikk for endring av et enkelt nukleoid i den kodende sekvens for tungkjeden i TNV148 (i plasmid p173) slik at en Ser-rest som tilsvarer kimcellelinjen vil kodes i stedet for Proresten i posisjon 7. Det resulterende plasmid ble betegnet p1760 (se tabell 2). Det resulterende gen og mab ble betegnet TNV148B for å skille dem fra det opprinnelige TNV148-gen og det opprinnelige mab (se figur ). 3 Oppbygging av endelige ekspresjonsplasmider Det ble fremstilt nye antistoffekspresjonsvektorer basert på 12B7-tungkjedegenet og - lettkjedegenet som tidligere var klonet som genomiske fragmenter. Selv om de ble fremstilt forskjellige TNV-ekspresjonsplasmider (se tabell 2), er i alle tilfeller de - flankerende sekvenser, promoteren og intronenhanceren avledet fra de tilsvarende

96 9 1 12B7-gener. For lettkjedeekspresjonsplasmidene var også det fullstendige J-C-intron, den kodende sekvens for konstant område og den 3 -flankerende sekvens avledet fra 12B7-lettkjedegenet. For tungkjedeekspresjonsplasmidene som førte til de endelige produksjonscellelinjer (p1781 og p1783, se nedenfor), er de kodende sekvenser for konstant område i det humane IgG1 avledet fra ekspresjonsvektoren (p4) som tidligere har blitt benyttet av Centocor. Det er av betydning at de endelige produksjonscellelinjer som rapporteres her uttrykker en annen allotype (Gm(f+)) av TNV-mAb enn de opprinnelige, hybridomavledede TNV-mAb (G1m(z)). Dette skyldes at 12B7- tungkjedegenet avledet fra GenPharm-musene koder for en Arg-rest i den C-terminale ende av CH1-domenet, mens IgG1-ekspresjonvektoren p4 tilhørende Centocor koder for en Lys-rest i samme posisjon. Andre tungkjedeekspresjonsplasmider (f.eks. p1786 og p1788) hvori J-C-intronet, den fullstendige kodende sekvens for konstant område og den 3 -flankerende sekvens var avledet fra 12B7-tungkjedegenet ble fremstilt, men cellelinjer transfektert med disse gener ble ikke valgt som produksjonscellelinjer. Vektorene ble nøye utformet for å muliggjøre entrinnskloning av fremtidige PCRamplifiserte V-områder som kan gi endelige ekspresjonsplasmider. 2 3 PCR-amplifiserte cdna for variabelt område ble overført fra L28- eller pbc-vektorer til intermediære 12B7-baserte vektorer som innførte promoterområdet og en del av J- C-intronet (se tabell 2 for plasmididentifikasjonsnummere). Restriksjonsfragmenter som inneholdt den halvpart av antistoffgenene ble så overført fra disse intermediære vektorene til de endelige ekspresjonsvektorene, som tilveiebragte den 3 halvdel av de angjeldende gener slik at de endelige ekspresjonsplasmider ble dannet (se tabell 2 for plasmididentifikasjonsnummere). Celletransfeksjoner og subkloning Ekspresjonsplasmidene ble enten linearisert ved restriksjonskutting, eller antistoffgeninnskuddet i hvert plasmid ble renset fra plasmidryggraden. Sp2/0- og 63- musemyelomceller ble transfektert med tungkjede- og lettkjede-dna ved elektroporering. 1 forskjellige transfeksjoner ble utført, av hvilke de fleste var unike når det gjeler Ab, spesifikke egenskaper ved Ab-genene, hvorvidt genene forelå på lineariserte hele plasmider eller på rensede geninnskudd, og vertscellelinjen (oppsummert i tabell 3). Cellesupernatanter fra kloner som var resistente overfor mykofenolsyre ble analysert for nærvær av humant IgG ved ELISA og kvantifisert ved anvendelse av renset rtnv148b som referansestandardkurve.

97 96 Cellelinjene med den høyeste produksjon av rtnv148b Ti av 63-cellelinjene med høyest produksjon fra rtnv148b-transfeksjonen 2 (som produserte - μg/ml i utvokste 24-brønners kulturer) ble subklonet for å søke etter cellelinjer med høyere produksjon og for fremstilling av en mer homogen cellepopulasjon. To av subklonene fra utgangscellelinjen, 2.3, og 2.3-, dannet tilnærmet 0 μg/ml i utvokste 24-brønners kulturer, noe som utgjorde gangers økning sammenlignet med utgangscellelinjen. En andre subkloningsrunde av de subklonede linjene og 2.3. førte 1 Tabell 3. Oppsummering av celletransfeksjonen Identifikasjonsnummerene til tungkjede- og lettkjedeplasmidene som koder for hvert mab er vist. For transfeksjoner utført med rensede mab-geninnskudd inngikk plasmid p13 (psv2gpt) som kilde for seleksjonsmarkøren gpt. Tungkjedens konstante områder var kodet av enten den samme humane IgG1-ekspresjonsvektor som ble benyttet for koding av Remicade ( gammel ) eller av de konstante områder som inngår i 12B7 (GenPharm/Medarex)-tungkjedegenet ( ny ). H1/L2 viser til et nytt mab som består av TNV14-tungkjede og TNV148-lettkjede. Plasmid p1783 og p1801 skiller seg fra hverandre kun når det gjelder hvor mye av J-C-intronet som tungkjedegenene inneholder. Transfeksjonsnummerene, som definerer det første nummer i det generiske navn til celleklonene er vist til høyre. De rtnv148b-produserende cellelinjene C466 (A, B, C, D) og C467A som beskrives her er avledet fra transfeksjonsnummer 2 hhv. 1. Den rtnv14-produserende cellelinje C476A er avledet fra transfeksjon nr. 3. mab Plasmider HC/LC/gpt HC-vektor DNA-format Transfeksjon nr. Sp2/0 63 rtnv148b 1783/1776 gammel lineært 1 2 rtnv /177 gammel lineært 3 - rtnv C476A Sp2/0 19 μg/ml 2 Karakterisering av subklonende cellelinjer For en mer grundig karakterisering av cellelinjenes vekstegenskaper og for bestemmelse av mab-produksjonsnivået i større skala ble det utført vekstkurveanalyser ved benyttelse av T7-kulturer. Resultatene viste at alle de fire C466-seriecellelinjene nådde en topp i celletetthet på mellom 1,0x 6 og 1,2x 6 celler/ml og maksimal mabakkumuleringsnivå på mellom 1 og 140 μg/ml (figur 7). I motsetning til dette, nådde Sp2/0-subklonen med best produksjon, C467A, en topp i celletettheten på 2,0x 6 cel-

98 97 ler/ml og en maksimal akkumulering av mab på 2 μg/ml (figur 7). Det ble ikke utført en vekstkurveanalyse for den rtnv14-produserende cellelinje C476A. Nok en vekstkurveanalyse ble utført for å sammenligne veksthastigheten ved forskjellige konsentrasjoner av MHX-seleksjon. Denne sammenligningen ble gjort grunnet nyere observasjoner av at C466-kulturer dyrket i fravær av MHX ser ut til å vokse hurtigere enn de samme celler dyrket i den normale mengde av MHX (1x). Siden de cytotoksiske konsentrasjoner av forbindelser som mykofenolsyre har en tendens 1 2 For å kunne måle over flere størrelsesordener ble det ansett som mulig at anvendelse av en lavere MHX-konsentrasjon kunne føre til signifikant kortere celledoblingstider uten at det gikk ut over stabiliteten av mab-produksjonen. Cellelinjene C466A og C466B ble dyrket i: intet MHX, 0,2xMHX eller 1xMHX. Antall levende celler ble målt hver 24. time i 7 dager. Resultatene viste en MHX-konsentrasjonavhengig celleveksthastighet (figur 8). Cellelinje C466A viste en doblingstid på 2,0 timer i 1xMHX, men kun,7 timer uten MHX. På tilsvarende måte viste cellelinje C466B en doblingstid på 32,4 timer i 1xMHX, men kun 22,9 timer uten MHX. Det er av betydning at doblingstiden for de to cellelinjene i 0,2x MHX lignet mer på doblingstiden observert uten MHX enn doblingstiden med 1xMHX (figur 8). Denne observasjon åpner muligheten for at forbedret celleytelse i bioreaktorer, for hvilke doblingstiden er en viktig parameter, kan oppnås ved anvendelse av mindre MHX. Selv om stabilitetsanalyseresultater (se nedenfor) tyder på at cellelinje C466D stabilt kan produsere rtnv148b i minst 60 dager selv uten MHX tilstede viste stabilitetsanalysen imidlertid også høyere mabproduksjonsnivå når cellene ble dyrket i nærvær av MHX, sammenlignet med fravær av MHX. For å evaluere mab-produksjonen fra de forskjellige cellelinjene over et tidsrom på tilnærmet 60 dager, ble det utført stabilitetsanalyser på kulturer som enten inneholdt eller ikke inneholdt MHX-seleksjon. Ikke alle cellelinjer opprettholdt høy mabproduksjon. Etter kun 2 ukers dyrking produserte klon C466A tilnærmet 4% mindre enn ved undersøkelsens begynnelse. Produksjonen fra klon C466B så også ut til å falle signifikant. Klonene C466C og C466D opprettholdt imidlertid temmelig stabil produksjon, hvor C466D viste det høyeste absolutte produksjonsnivå (figur 9). 3 Konklusjon Fra et utgangssett bestående av åtte humane mab mot human TNF!, ble TNV148B utvalgt som det foretrukne, basert på flere kriterier som omfattet proteinsekvens og

99 98 TNF-nøytraliseringsevne, så vel som TNV14. Det ble fremstilt cellelinjer som produserte mer enn 0 μg/ml rtnv148 og 19 μg/ml rtnv14. Eksempel 4: Undersøkelse av artrittiske mus ved anvendelse av anti-tnfantistoffer og kontroller og en enkelt bolusinjeksjon I en alder på tilnærmet 4 uker ble Tg197-musene som inngikk i undersøkelsen basert på kjønn og kroppsvekt fordelt på en av 9 behandlingsgrupper og behandlet med en enkelt intraperitoneal bolusdose av Dulbecco s PBS (D-PBS) eller et anti-tnf-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse (TNV14, TNV148 eller TNV196) enten med 1 mg/kg eller mg/kg. 1 RESULTATER: Når kroppsvekten ble analysert som endring fra vekten før doseringen viste dyrene behandlet med mg/kg ca2 gjennomgående høyere vektsøkning enn de D-PBS-behandlede dyr gjennom hele undersøkelsen. Denne vektøkningen var signifikant i uke 3-7. Dyrene behandlet med mg/kg TNV148 oppnådde også en signifikant vektøkning i undersøkelsens uke 7 (se figur ). 2 Figurene 11A-C viser forløpet av sykdomsomfanget basert på artrittindeksen. Artrittindeksen for gruppen behandlet med mg/kg ca2 var lavere enn for D-PBSkontrollgruppen fra uke 3 og fortsatte å være det gjennom resten av undersøkelsen (uke 7). Dyrene behandlet med 1 mg/kg TNV14 og dyrene behandlet med 1 mg/kg ca2 viste ingen signifikant reduksjon i AI etter uke 3 sammenlignet med den D-PBS-behandlede gruppen. Det var ingen signifikante forskjeller mellom gruppene behandlet med mg/kg når disse ble sammenlignet med andre grupper med tilsvarende dose ( mg/kg ca2 sammenlignet med mg/kg TNV14, 148 og 196). Ved sammenligning av gruppene behandlet med 1 mg/kg viste gruppen behandlet med 1 mg/kg TNV148 signifikant lavere AI enn gruppen behandlet med 1 mg/kg ca2 i uke 3, 4 og 7. Gruppen behandlet med 1 mg/kg TNV148 var også signifikant lavere enn gruppen behandlet med 1 mg/kg TNV14 i uke 3 og 4. Selv om TNV196 viste signifikant reduksjon i AI opp til undersøkelsens uke 6 (ved sammenligning med den D-PBS-behandlede gruppe) var TNV148 den eneste behandling med 1 mg/kg som forble signifikant ved undersøkelsens avslutning. 3 Eksempel : Undersøkelse av artrittiske mus ved anvendelse av anti-tnfantistoffer og kontroller og multiple bolusdoser I en alder på tilnærmet 4 uker ble Tg197-musene som inngikk i undersøkelsen basert på kroppsvekt fordelt på en av 8 behandlingsgrupper og behandlet med en intraperitoneal

100 99 bolusdose av kontrollmaterialet (D-PBS) eller antistoff (TNV14, TNV148) ved 3 mg/kg (uke 0). Injeksjonene ble gjentatt for alle dyr i uke 1, 2, 3 og 4. Gruppe 1-6 ble evaluert for virkning av analysemateriale. Serumprøver erholdt fra dyrene i gruppe 7 og 8 ble evaluert for induksjon av immunrespons og farmakokinetisk fjerning av TNV14 eller TNV148 i uke 2, 3 og 4. RESULTATER: Ingen signifikante forskjeller ble bemerket ved analyse av kroppsvekten som endring fra vekten før doseringen. Dyrene behandlet med mg/kg ca2 viste gjennomgående høyere vektøkning enn de D-PBS-behandlede dyr gjennom hele undersøkelsen (se figur 12). 1 2 Figurene 13A-C representerer forløpet av sykdomsomfanget basert på artrittindeksen. Artrittindeksen til gruppen behandlet med mg/kg ca2 var signifikant lavere enn for D-PBS-kontrollgruppen med start i uke 2, og dette fortsatte gjennom resten av undersøkelsen (uke ). Dyrene behandlet med 1 mg/kg eller 3 mg/kg ca2 og dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV14 oppnådde ingen signifikant reduksjon i AI på noe tidspunkt i undersøkelsen ved sammenligning med D-PBS-kontrollgruppen. Dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV148 viste signifikant reduksjon ved sammenligning med D-PBS-behandlede gruppe med start i uke 3, og dette fortsatte gjennom uke. Dyrene behandlet med mg/kg ca2 viste signifikant reduksjon i AI ved sammenligning med de to lavere doser (1 mg/kg og 3 mg/kg) av ca2 i undersøkelsens uke 4 og, og var også signifikant lavere enn for de TNV14-behandlede dyr i uke 3-. Selv om det ikke så ut til å være signifikante forskjeller mellom noen av gruppene behandlet med 3 mg/kg var AI for dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV14 på noen tidspunkter signifikant høyere enn for gruppen behandlet med mg/kg, mens dyrene behandlet med TNV148 ikke var signifikant forskjellige fra dyrene behandlet med mg/kg ca2. 3 Eksempel 6: Undersøkelse av artrittiske mus ved anvendelse av anti-tnfantistoffer og kontroller og en enkelt intraperitonal bolusdose I en alder på tilnærmet 4 uker ble Tg197-musene som inngikk i undersøkelsen basert på kjønn og kroppsvekt fordelt på en av 6 behandlingsgrupper og behandlet med en enkelt intraperitonal bolusdose av antistoff (ca2 eller TNV148) i en konsentrasjon på enten 3 mg/kg eller mg/kg. Denne undersøkelsen benyttet D-PBS- og mg/kg ca2- kontrollgrupper. Ved analyse av kroppsvekten som endring fra kroppsvekten før doseringen, ga alle behandlinger tilsvarende vektøkning. Dyrene som ble behandlet med enten 3 eller mg/kg

101 0 TNV148 eller mg/kg ca2 hadde en signifikant økning i kroppsvekten tidlig i undersøkelsen (i uke 2 og 3). Kun dyrene som ble behandlet med TNV148 opprettholdt signifikant vektøkning ved de senere tidspunkt. Dyrene behandlet med 3 og med mg/kg TNV148 viste alle signifikant økning i uke 7, og dyrene behandlet med 3 mg/kg TNV148 hadde fortsatt signifikant forhøyet kroppsvekt 8 uker etter injeksjonen (se figur 14). 1 Figur 1 viser forløpet av sykdomsomfanget basert på artrittindeksen. Alle behandlingsgrupper viste en viss beskyttelse i de tidligere tidspunkter, hvor gruppene behandlet med mg/kg ca2 og mg/kg TNV148 viste signifikant reduksjon i AI i uke 1-3 og alle behandlede grupper viste signifikant reduksjon i uke 2. Senere i undersøkelsen viste dyrene behandlet med mg/kg ca2 en viss beskyttelse, med signifikant reduksjon i uke 4, 6 og 7. Den lave dose (3 mg/kg) av både ca2 og TNV148 viste signifikant reduksjon i uke 6, og alle behandlede grupper viste signifikant reduksjon i uke 7. Ingen av de behandlede grupper kunne opprettholde en signifikant reduksjon ved undersøkelsens avslutning (uke 8). Det var ingen signifikante forskjeller mellom noen av de behandlede grupper (bortsett fra kontrollgruppen som ble gitt saltvann) på noe tidspunkt. 2 Eksempel 7: Undersøkelse av artrittiske mus ved anvendelse av anti-tnvantistoffer og kontroller som en enkelt intraperitoneal bolusdose: en sammenligning mellom anti-tnf-antistoff og modifisert anti-tnf-antistoff Undersøkelsen ble utført for å sammenligne virkningen av en enkelt intraperitoneal dose av TNF148 (avledet fra hybridomceller) og rtnv148 (avledet fra transfekterte celler). i en alder på tilnærmet 4 uker ble Tg197-musene som inngikk i undersøkelsen basert på kjønn og kroppsvekt fordelt på en av 9 behandlingsgrupper og behandlet med enkelt intraperitoneal bolusdose av Dulbecco s PBS (D-PBS) eller antistoff (TNV148, rtnv148b) ved 1 mg/kg. Ved analyse av kroppsvekten som endring fra vekten før doseringen, viste dyrene behandlet med mg/kg ca2 en gjennomgående høyere vektøktning enn dyrene behandlet med D-PBS gjennom hele undersøkelsen. Vektøktningen var signifikant i uke 1 og uke 3-8. Dyrene behandlet med 1 mg/kg TNV148 oppnådde også signifikant vektøkning i undersøkelsens uke, 6 og 8. 3 Artrittindeksen hos gruppen behandlet med mg/kg ca2 var lavere enn for den D- PBS-behandlede kontrollgruppe med start i uke 4, og dette fortsatte gjennom resten av undersøkelsen (uke 8). Både den TNV148-behandlede gruppe og gruppen behandlet

102 1 med 1 mg/kg ca2 viste signifikant reduksjon i AI i uke 4. Selv om en tidligere undersøkelse (P ) viste at TNV148 var noe mer effektiv når det gjelder reduksjon av artrittindeksen etter en enkelt intraperitoneal bolusdose på 1 mg/kg, viste den foreliggende undersøkelse at AI i gruppene behandlet med begge versjoner av TNV-antistoffet var noe høyere. Selv om gruppen behandlet med 1 mg/kg ca2 (bortsett fra i uke 6) ikke var signifikant forhøyet ved sammenligning med gruppen behandlet med mg/kg ca2 og de TNV148-behandlede gruppene var signifikant høyere i uke 7 og 8, var det ingen signifikante forskjeller i AI mellom gruppene behandlet med 1 mg/kg ca2, 1 mg/kg TNV148 og 1 mg/kg TNV148B på noe tidspunkt i undersøkelsen. Det vil være åpenbart at oppfinnelsen kan utføres på en annen måte enn hva som spesielt er beskrevet i den foregående beskrivelse og i eksemplene.

103 2 P a t e n t k r a v 1 1. Humant anti-tnf-antistoff, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter tungkjede komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) og variable rammeverksregioner (framework regions) (FR) fra mab TNV148 som beskrevet i Figur 4; og lettkjede CDR og variable FR fra mab TNV 148 som beskrevet i Figur ; som eventuelt ytterligere omfatter den spesifiserte substitusjonen fra prolin til serin i FR3 fra mab TNV148B som beskrevet i Figur Antistoff i følge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte antistoff omfatter de tunge og lettkjedevariable regionene fra en av mab TNV 148 og mab TNV148B som beskrevet i Figurene 4 og. 3. Isolert nukleinsyremolekyl, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter et polynukleotid som koder for antistoffet i følge et hvilket som helst av de foregående kravene. 4. Rekombinant vektor, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter nukleinsyremolekylet i følge krav Vertcelle, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter nukleinsyremolekylet i følge krav 3 eller vektoren i følge krav Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter antistoffet i følge krav 1 eller 2 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel Antistoffet i følge krav 1 eller 2 eller sammensetningen i følge krav 6 for anvendelse innen diagnostikk eller terapi.

104 3 8. Antistoff eller sammensetning i følge krav 7 for anvendelse til behandling av immunrelatert sykdom.

105

106

107

108

109 1/16

110 2/16

111 3/16

112 4/16

113 /16

114 6/16

115 7/16

116 8/16

117 9/16

118 /16

119 11/16

120 12/16

121 13/16

122 14/16

123 1/16

124 16/16