Forelesninger i BI Cellebiologi. Denaturering og renaturering. Figure 3-13

Transkript

1 Figure 3.9

2 Denaturering og renaturering Figure 3-13

3 Denaturering og renaturering Figure 3-14 Viser tre trinn i refolding av et protein som har vært denaturert. Molten globule -formen er en intermediær - før endelig gjendannelse av nativ form.

4 Folding av proteiner in vivo fremmes av chaperoner Cellen er meget effektiv mht folding av proteiner. En gruppe av proteiner kalt chaperoniner er sentrale i denne sammenheng. To familier ; 1. Molekylære chaperoner og 2. Chaperoniner. Molekylære chaperoner ; binder og stabiliserer ufoldete eller delvis foldete proteiner pga sin ATPase -aktivitet. Chaperoniner ; deltar i selve foldingen. Molekylære chaperoner består av Hsp70-proteinfamilien (Hsp70 i cytosol og matrix i mitokondrier, Bip i ER og DnaK i bakterier). Hvordan Hsp70 virker sammen med chaperoninet TCiP ( tønneformet ) i endelig refolding til nativ form, er vist i Figure 3-15 a. Denne mekanismen er bedre forstått i bakterier som har chaperoninet GroEl. Chaperoniner beskytter andre proteiner mot uønsket binding - hatt i eske -prinsippet ( se Fig. 3.10).

5 Folding av proteiner avhenger av chaperonet Hsp70 og chaperoninet TCiP (GroEL i bakterier) Figure 3-15 (a)

6 Figure 3.10

7 Kjemiske endringer av proteiner gir endringer i biologisk aktivitet Etter syntesen av proteinet i ribosomet vil det endres kjemisk. To typer endringer : 1. Kjemisk modifisering og 2. Prosessering. 1. Kjemisk modifisering : medfører (ofte reversibel) påkobling av kjemiske grupper til den terminale amino- eller karboksyl-enden, eller reaktive grupper i sidekjedene. Vanligste form (80%) er acetylering dvs. CH 3 COkobles på - eller påkobling av lipidlignende (hydrofobe) haler. Fosforylering av sidekjeder og glykosylering (påkobling av karbohydratkjeder) er også en vanlig form for kjemisk modifisering. 2. Prosessering : medfører irreversible endringer som påvirker biologisk aktivitet. Ofte en fjerning av rester fra C- eller N-enden av polypeptidet, gjennom bryting av peptidbindinger ved proteolytisk spalting (proteaser). En spesiell form for prosessering kalles protein-self-splicing hvor et indre ( intein ) segment av polypeptidet (i bakterier eller enkle eukaryote) fjernes (autokatalystisk dvs. uten enzymer) med påfølgende sammensmelting av brudd-endene (Figure 3-17).

8 Figure 3-17 Forelesninger i BI Cellebiologi Self-splicing i bakterier og lavere eukaryoter

9 Cellen nedbryter proteiner gjennom ulike stoffskifteprosesser Cellen nedbryter proteiner både extracellulært og intracellulært. Extracellulær nedbrytning : fordøyelsesenzymer (digestive proteases) i tynntarmen. Eksempler ; endoproteaser (trypsin, chymotrypsin), exopeptidaser (amino- og carboxypeptidaser) og peptidaser. Intracellulær nedbrytning : aktuelle proteiner for nedbrytning er kort-livete (f.eks.mitotiske cycliner) og lang-livete (i øyelinser) proteiner samt proteiner som er feil foldet eller denaturert. Lysosomer er viktige her men også cytosolisk nedbrytning - ubiquitin-mediert-pathway. Den ubiquitin-mediert-pathway er basert på at en kjede av ubiquitin-molekyler påhenges lysin-sidekjeder av nedbrytningsproteinet. Dette komplekset vil så nedbrytes av proteasomer. Resulat: peptider og frigjorte ubiquitin-molekyler (Figure 3-18). Forutsetningen for at proteinet skal gjenkjennes av ubiquitin-molekylene er forekomsten av visse nedbrytnings-sekvenser på proteinet. Prioner (proteinaceous infectious particle) er en spesiell type proteiner som er selvreproduserende og etter refolding årsak til mange nye sykdommer - skrapesyke, kugalskap og Creutzfeldt-Jakobs sykdom. Prioner menes også å være årsaken til Alzheimers sykdom.

10 Ubiquitin-mediert-pathway Figure 3-18 ATP

11 Funksjonell design av proteiner (Del 3.3) Proteinets struktur vil antyde dets funksjon. I Figure 3-20 (a-d) er vist ulike proteinkonformasjoner og deres funksjon. Proteinet er ment å binde andre molekyler - ligander - med en høy grad av spesifisitet. Eksempel er binding til substratet (målmolekylet). Affinitet viser til bindingstyrke mellom protein og ligand; spesifisitet viser evne til selektivitet i valg av ligand. I dyr og mennesker produseres blodproteiner av typen antistoffer ved infeksjoner fremkalt av antigener (bakterier eller virus). Antistoffer (immunoglobuliner) viser en presis ligand-bindingspesifisitet. Immunoglobuliner (Y-formete) har lette og tunge kjeder - Figure 3-21 resp. gule/grønne og blå/orange. Antigener har mutiple seter (antigen-determinanter) kalt epitoper som kan indusere produksjon av spesifikke antistoffer. Hver type av av antistoff binder seg til sin egen induserende epitop. Mer detaljer om praktisk lab-bruk av mono- og polyklonale antistoffer kommer i forbindelse med demonstrasjoner på PBS bl.a. bruk av ELISA-teknikk og Westernblotting.

12 Funksjonell design av proteiner (Del 3.3) a.pore -kanal i kjernemembranen b. GroEL-chaperonin for proteinfolding c. Reverse-transkriptase med grop for RNA d. Topoisomerase II - DNA-bindingsenzym som hindrer DNA å bli overskrudd under replikasjon, formet som en tang.

13 Figure Antistoffer (immunoglobuliner) Y-formete, har lette og tunge kjeder - resp. gule/grønne og blå/orange. Armer av Fab-domener, en stang av Fc-domener og hvite antigen-molekyler som bindes til variable komplementær-bestemmende regioner (CDR). Karbohydrater (røde) er bundet til proteinet dvs. dette er et glykoprotein.

14 Enzymer : spesifikke katalysatorer og aktive seter Enzymer er spesifikke dvs. de virker kun på bestemte reaktanter eller substrater. Enzymet får ofte navn etter substratet ved tillegg av endelsen «- ase» - f.eks. virker enzymet hexokinase på hexose-sukkere. Men - mange enzymer har navn som ikke følger dette mønster (f.eks. trypsin som er et fordøyelsesenzym som nedbryter proteiner). Substrat-molekyler (S) bindes med ulike bindingstyper (Hbindinger, ione-bindinger eller kovalente) til et aktivt sete på enzymet under reaksjonen og danner et intermediært substratenzym-kompleks (ES; Fig. 6.13). Når reaksjonen er over frigjøres enzymet upåvirket fra produktene (P) : E + S --> ES --> E + P ES-komplekset har en lavere aktiveringsenergi enn «transition state» i den ikke-katalyserte reaksjonen (Fig. 6.14) - uten at dette påvirker den fri energi ( G) mellom reaktanter og produkter. Men - hastigheten i reaksjonen mot likevekt er betydelig øket.

15 Enzymer : aktive seter Figure 6.13