Genkartlegging. Hva er egentlig et genkart? Genetisk og fysisk kartlegging

Transkript

1 NTNU Genkartlegging 1 Termin IC Frank Skorpen Institutt for laboratoriemedisin, barne- og kvinnesykdommer Hva er egentlig et genkart? Kartet over det humane genom gir oss posisjonen av de ca 25,000 genene langs de 24 kromosomene, posisjonen i forhold til hverandre, og avstanden mellom dem. To fundamentalt ulike metoder anvendes for å sette sammen genkart over kromosomer: Fysisk genkartlegging Genetisk genkartlegging 2 Genetisk og fysisk kartlegging Genetisk Fysisk På genetiske kart er avstanden et mål på prosent meiotisk overkrysning mellom to eller flere markører. Avstanden angis i centimorgan (cm). I et perfekt fysisk kart måles avstanden i antall basepar. For andre fysiske kart med lavere oppløsning er det den fysiske avstanden vi observerer ved f.eks. mikroskopi. 3 1

2 4 5 Hvorfor genkartlegging? Genkartlegging er et viktig verktøy for å kunne isolere og karakterisere gener som er av interesse i medisinsk sammenheng 6 2

3 Hvorfor er gener viktige i medisin? Inneholder oppskriften Gentest for å identifisere individer at risk Mutasjon/genvariant Kopi av oppskriften Utfører oppgaven Sykdom Informasjon om gen-produktet: Behandling/ profylakse 7 Fysisk kartlegging - metoder Kromosomfarging In situ hybridisering Celle-hybrid paneler Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) DNA sekvensering 8 Kromosomfarging - FISH 9 Gjør det mulig å identifisere større delesjoner eller rearrangements 3

4 10 Genidentifisering - FISH Rearrangert En metafasecelle positiv for bcr/abl rearrangement (assosiert med kronisk myelogen leukemi), påvist ved hjelp av FISH. 11 Cellehybridpanel Humane kromosomer (eller deler av kromosomer) ført inn i celler fra annen art, eksempelvis fra mus eller hamster. 12 4

5 BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Insert size: kb) 13 Mapping av gen til et spesifikt kromosomalt segment Små, overlappende DNA fragmenter satt inn i vektor egnet for DNA sekvensering 14 DNA sekvensering Bestemmer den eksakte rekkefølgen av baser i et DNA molekyl A - adenine C - cytosine G - guanine T - thymine 15 5

6 Genkartlegging Genetisk kartlegging Anvender koblingsanalyse (linkage analysis) for å bestemme avstanden mellom gener. 16 Koblingsanalyse Anvender genetiske markører, og studerer nedarvingen av sykdom og markører i familier Gjør det mulig å identifisere områder på kromosomer som inneholder et risiko-/sykdomsgen. Utelukke områder som ikke inneholder et risiko-/sykdomsgen. Markør 17 Risiko-gen : 8/

7 OBS!: Ulike typer arv Dominant recessiv - kjønnsbunden Pleiotropi Multiple fenotyper Epistasi - Samvirkende gener Polygen arv (kvantitative egenskaper) Ufullstendig penetrans Genotype 100/100 --> Fenotype 70/100 Maternell/paternell arv (imprinting) 19 Genetisk markør Vanligvis ikke den egentlige årsak til sykdommen Mut Markør Sykdomsgen En genetisk markør er en DNA sekvens med kjent lokalisasjon på et kromosom En genetisk markør må ha den egenskap at den kan skille imellom de to homologe kromosomene (dvs. skille mellom alleler utgaver av et gen) som vi arver fra mor og far. 20 VNTR gir opphav til flere/mange alleler GATCGATCGATCGATCGATCGATC PCR 21 Microsatellite : repetert enhet < 5 bp Minisatellite : repetert enhet bp 7

8 RFLP restriksjonsfragment lengde polymorfisme cggccg Kløyvingssete for restriksjonsenzym 22 Singel nukleotid polymorfisme (SNP) A T C G Mulige genotyper: AA AC CC (TT TG GG) 23 Koblingsanalyse Søkerettermarkørersom er tilstede hos de med en gitt sykdom (eller annen fenotype), men fraværende hos de som ikke er syke. (Dvs., det anvendes mange markører fra ulike kromosomale områder). Markøren og sykdommen sies da å være koblet, dvs. markøren er antatt å ligge i nærheten av sykdomsgenet. Utfordring: Krever DNA fra syke og friske fra samme familie Krever DNA fra mange familier Arbeids- og tidkrevende metoder 24 8

9 Homolog rekombinasjon i meiosen Sannsynligheten for at to loci skal ende opp på separate kromosom ved overkryssing er proporsjonal til avstanden mellom dem. 25 Avstanden måles i enheter kallt centi- Morgans (cm). 1 cm tilsvarer 1 recombinasjonshendelse mellom to loci pr 100 meioser (dvs. i 1% av meiosene) Genetisk koblingsanalyse v.h.a. RFLP markør 26 VNTR og RFLP markører har vært anvendt til å lage detaljerte genetiske kart over kromosomer Humane Chromosome 3 from Science Human Genetic Map, Genome Map V (Life Technologies) 27 9

10 Hvor stort er et kromosom? Kromosom 1: 263 millioner bp Kromosom 21: 50 millioner bp X: 164 millioner bp Y: 59 millioner bp 1 cm ~ 1 million bp 28 Kloning av sykdomsgener Før 1980 var bare et fåtall sykdomsloci kjent (på bakgrunn av biokjemisk karakterisering) Sykdommer som er forbundet med store kromosomale endringer var tidlig identifisert ved hjelp av fargeteknikker og mikroskopi Vi har fire grunnleggende strategier for identifikasjon og kloning av sykdomsgener Posisjonell kloning Posisjonsuavhengig kandidatgenkloning Posisjonell kandidatgenkloning Funksjonell kloning 29 Posisjonell kloning Koblingsanalyser i familier ( genom scan ved bruk av mange markører) brukes for å snevre inn området hvor sykdomsgenet er lokalisert Andre teknikker må brukes for å påvise potensielle sykdomsgen i det aktuelle området 30 genome walking / - jumping DNA sekvensering 10

11 Posisjonsuavhengig kandidatgenkloning Sykdommen kan i mange tilfeller gi indikasjon på hvilke(t) gen som er involvert Dersom man har gode kandidater vil man undersøke disse før man initierer en omfattende genetisk kartlegging Aktuelle teknikker er: Sekvensering av aktuelle gen Ekspresjonsstudier (mrna, protein) 31 Posisjonell kandidatgenkloning 32 En kombinasjon av posisjonell kloning og posisjonsuavhengeig kandidatgenkloning Sykdommen kan i mange tilfeller gi en indikasjon på hvilke(t) gen som er involvert Posisjonen av aktuelle gen(er) kan finnes i våre godt utviklete genkart Dersom denne posisjonen sammenfaller med kunnskap om sykdomslokus kan antall kandidatgen reduseres dramatisk Funksjonell kloning Kunnskap om den biokjemiske årsaken til sykdommen kan eks. brukes til: Å rense proteinet (som forårsaker sykdommen), bestemme aminosyresekvensen og syntetisere DNA probe til screening i genbibliotek. Funksjonell komplementering. Muterte celler (celler med sykdomsgen) komplementeres med humant DNA. Probe 33 11

12 Assosiasjosstudier Søker etter assosiasjon mellom genetiske markører og sykdom Som oftest Case Control studier (populasjonsbasert) Kandidatgen-, eller Genome-wide association studies (GWAS) I GWAS kan inntil 1 mill genetiske markører (SNPs), spredt gjennom hele genomet, testes samtidig 34 Affymetrix Illumina Genom-wide scan for 7 vanlige sykdommer 35 15q25 Lungekreft 36 12

13 Kloning av Cystic Fibrosis (CF) genet The CF gene was finally cloned in 1989 at an estimated cost of US$200 million and involved several research labs from several countries. Probe RFLP 1 mill bp RFLP RFLP Chr 7 Probe Probe CF-gen: > bp 24 exons mutert i pas. med CF 37 Flankerende kloner Kloner med deler av CF gen Kloning av Cystic Fibrosis (CF) genet The CF gene was finally cloned in 1989 at an estimated cost of US$200 million and involved several research labs from several countries. 38 Først funnet å være koblet til en RFLP på kromosom 7 Videre mappingstudier viste at genet lå mellom to RFLP- markører, ca 1 Mb (1 mill bp) fra hverandre. Kloner som inneholdt deler av denne regionen ble så isolert ved å benytte DNA som inneholdt RFLP-markørene som probe Disse klonene ble så brukt som prober for å isolere flankerende DNA kloner. Prosedyren gjentatt med de flankerende kloner som probe Flere kloner som til sammen inneholdt CF-genet isolert Analyse av disse, samt isolering av cdna etterfulgt av sekvensering, viste at CF-genet strekker seg over 250 kb, inneholder 24 exons og gir opphav til et mrna på ca 6 kb. DNA sekvensering viste at dette var CF genet og at det var mutert i affekterte individer. Chromosome walking 13