Kromosomer, gener og DNA

Transkript

1 Kromosomer, gener og DNA Hva er det, og hvordan undersøker vi det Olaug Kristin Rødningen Dr.scient, overingeniør Avdeling for medisinsk genetikk, OUS

2 Et menneske består av ulike organsystem Organsystemene er bygd opp av organer Organer er bygd opp av vev Vev er bygd opp av celler Mennesker består av trillioner av celler

3 Cellene i kroppen har ulik form, størrelse og funksjon

4 Alle celler har en cellekjerne Her lagres arvematerialet; DNA DNA er et molekyl som inneholder instruksjon om hva cellen skal gjøre, og hvordan den skal kommunisere med andre celler, hvordan den skal vokse, dele seg, og danne fx. muskler og andre deler av kroppen Det bestemmer hvordan vi ser ut, hvilke egenskaper og sykdommer vi har

5 Deoxyribonukleinsyrer (DNA) Dobbeltspiral, bygd opp av 4 ulike byggesteiner, også kalt baser; A, C, G, T På hvert trinn binder A med T eller C med G Består av basepar (x2)

6 Kromosomer DNA-trådene er ca. 3 nanometer brede, og til sammen 2+2 meter Inni cellen kveiles DNA opp De 3 milliardene basepar er ikke en sammenhengende tråd, men delt opp i mindre biter; kromosomer Menneskeceller har 46 kromosomer (23 fra far og 23 fra mor)

7 Hvordan gjenkjenner vi kromosomer Hvert enkelt kromosom har en bestemt lengde, og pakkes på bestemte måter (tett/mindre tett) Karyotype Hvis vi tar ut cellekjerner, og farger dem rett før de har tenkt å dele seg (er veldig kompakte), kan vi ta bilde av dem i mikroskop Vi ser da mørke og lyse områder, og kan sortere dem etter karakteristiske mønster og lengde Kromosom 1 det lengste; 248 mill basepar, 21 kortest; 48 mill basepar Vi kan undersøke om de har et vanlig mønster, vanlig antall, og om vi ser en XX eller XY (kjønn) etc.

8 Gener Et gen er en definert bit av DNA som oftest fungerer som oppskrift for et bestemt protein Vi har omlag gener, og de fleste fins i to kopier (en fra far og en fra mor) De har et startpunkt og et stoppunkt på kromosomet, ex. CFTR Ligger etter hverandre bortover tråden, og har fast plass ift. andre gener Vi kjenner idag rekkefølgen til basene i alle gen, og hvor de ligger på kromosomene

9 Hvordan bruker cellene oppskriften i DNA? Genet blir kopiert til et mindre molekyl kalt mrna mrna blir deretter oversatt til protein ved at et maskineri leser tre og tre av bokstavene, og henter inn en bestemt aminosyre for hver triplett En triplett angir start, en triplett angir stopp, og andre tripletter angir en av 20 ulike aminosyrer Aminosyrene er byggesteiner i proteiner Genene er derfor oppskrifter for tusenvis av ulike proteiner som har ulike oppgaver i cellen Så lenge dette genet er på, fortsetter cellen å lage flere mrna, og flere kopier av dette proteinet

10 Proteiners funksjon i cellen Byggsteiner i alle deler av cellen cellevegg osv. Noen proteiner er enzymer katalyserer ulike kjemiske reaksjoner, næringsomsetning osv. Noen proteiner er med på å regulere når andre gener skal skrus av/på Immunforsvaret (antistoff) er bygd opp av proteiner Noen proteiner har som oppgave å transportere andre molekyler rundt Noen proteiner har som funksjon å reparere skader i DNA og mye mer...

11 Fra DNA til protein

12 Hvis alle celler har samme DNA, hvorfor er cellene så forskjellige? Alle celler har de samme genene, men bruker dem forskjellig. De ulike genene uttrykkes (oversettes til proteiner) i ulik mengde og på ulike tidspunkt i ulike celler Genene skrus av og på etter behov TID STED - MENGDE

13 Hvis vi alle har de samme genene, hvorfor er vi så forskjellige? Fordi vi alle har variasjoner i DNA`et vårt To individer er kun 99.5% like ift. DNA sekvens To individer har ulikheter ca. 4-5 millioner steder i genomet Det er rapportert >320 millioner varianter blant mennesker Forskjellen kan utnyttes innen rettsmedisin Normalvariasjon Variasjon forbundet med sykdom

14 Hvordan oppstår variasjonen Endringer skjer hele tiden Man tror det skjer feil i DNA i alle celler i kroppen hver dag Kan skje spontant Når cellen skal fordoble sitt DNA (før den skal deles) Når cellen prøver å reparere skadene som har oppstått De fleste blir reparert korrekt (bruker den andre tråden som oppskrift) Hvis den ikke blir reparert med andre tråd som oppskrift, blir den værende Mange variasjoner gir ikke noen effekt på proteinfunksjonen Hvis endringen skjer i kjønnceller, vil varianten kunne nedarves til neste generasjon. Da vil varianten være tilstede i alle celler hos barnet Hvis endringen skjer tidlig i fosterutviklingen, vil den kunne være tilstede i noen eller alle cellene til barnet

15 Endringer på DNA-nivå ATG CAC CAC GAA... Met His His Glu... EFFEKT Missense - En annen aminosyre blir satt inn ATG CCC CAC GAA... Met Pro His Glu... ATG CCC CAC TAA... Met Pro His Stop Nonsense - Proteinet blir for kort ATG CCC.ACG AAC... Met Pro Thr Asn... Frameshift (liten delesjon eller insersjon) - Andre aminosyrer blir satt inn herfra Kan endre funksjon eller mengde av proteinet som skal lages

16 Hvor vanlig er variasjonene? Alle mennesker har en variant 4-5 millioner steder i genomet De fleste er nedarvet de finnes altså i mors eller fars DNA også... Kun av disse er trolig de novo (nyoppstått) oppstått tilfeldig i kjønncellene eller tidlig i fosterutviklingen Finnes ikke hos mor eller far Alle mennesker har trolig 1-2 varianter som kan gi alvorlig genetisk sykdom hvis barnet får varianten fra den andre foreldren også

17 Når gir variasjon sykdom? Vi har vanligvis 2 kopier av alle gener; en fra far og en fra mor Noen varianter gjør at genet får endret aktivitet, dvs. det produseres for mye eller for lite protein Andre varianter kan påvirke hvordan proteinet ser ut og fungerer For noen gener tolereres det at en av kopiene har en ødeleggende variant, men ikke at begge kopiene er ødelagt (recessiv sykdom, ex. Cystisk fibrose) For andre gener er det tilstrekkelig at en av kopiene er ødelagt for at man skal utvikle sykdom (dominant sykdom, ex. Familiær hyperkolesterolemi)

18 Arvemønster X-bundet recessive gener Ulike varianter i et gen kan gi ulik alvorlighetsgrad av sykdommen Alvorlighetsgraden er også avhengig av de andre genene -> vanskelig å forutsi akkurat hvordan sykdommen vil forløpe Dominant sykdom kan også komme av at varianter oppstår i kjønnceller eller tidlig i fosterutviklingen, slik at ingen av foreldrene har samme variant (de novo)

19 Endringer på kromosomnivå Strukturelle rearrangement i eller mellom kromosomene Om de er større enn 5-10 millioner basepar, kan de oppdages i mikroskop Effekt: - Hvis antall kopier av genet blir > eller < 2, vil mengden protein som lages av de genene som er i regionen endres - Kan ødelegge strukturen til et gen i bruddpunktet, slik at ingen protein blir laget - Kan ødelegge av/på-mekanismen til genene i regionen, slik at vi ikke får normal mengde protein

20 Endringer på kromosomnivå Numeriske antall kromosomer ikke 46 Monosomi (kun ett X-kromosom: Turner syndrom) Trisomi (tre kromosom 21: Down syndrom)(to X og en Y: Klinefelters syndrom) Triploidi (tre kopier av alle kromosomer) Skjer oftest under produksjon av kjønnsceller (nondisjunction i meiose)

21 Endringer på kromosomnivå Sykdomsmekanismer og arvemønster som for endringer på DNA-nivå Omfatter oftest mer enn 1 gen, og kan gi mer sammensatt sykdomsbilde Sykdommer som skyldes kromosomendringer > gjerne forbundet med sentral region eller sentralt gen

22 Kleefstra syndrom /9q delesjonssyndrom Kan skyldes: - Bortfall (delesjon) av enden på kromosom 9 eller inni kromosom 9 som omfatter EHMT1 (55%) - Translokasjon eller annen strukturell endring som omfatter EHMT1 (20%) - Endring på DNA-nivå (25%) Ikke noen klar sammenheng mellom type endring og alvorlighetsgrad Illustrerer at man må velge ulike metoder for å finne den kausale varianten

23 Genetisk utredning Om man har en klinisk mistanke om en bestemt sykdom eller syndrom, kan man gjøre målrettede undersøkelser i DNA. Man vet hva som er den vanligste årsaken til sykdommen, og kan lete etter en bestemt variant i DNA/genomet. FISH, Sanger sekvensering, MLPA, trisomitest etc. Om man ikke har spesifikk mistanke om bestemt sykdom, kan man benytte screeningmetoder hvor man leter i hele eller store deler av DNA/genomet karyotyping, acgh, HTS Starter oftest med en blodprøve, hvor vi tar ut DNA

24 Metoder for målrettet analyse av gener FISH - påvisning av fravær/tilstedeværelse av spesifikke sekvenser - informasjon om plassering - avhengig av celler i deling Sangers sekvensering - enkeltbasemutasjoner - små delesjoner/insersjoner - begrenset av primerplassering Fragmentanalyse - Fragmentlengder (ekspansjoner) - Semikvantitativ - trisomier MLPA - delesjoner/duplikasjoner - begrenset av probeplassering Karyotyping - påvisning av store strukturelle feil >5-10Mb - påvisning av numeriske feil - avhengig av celler i deling Array CGH - påvisning av delesjoner/duplikasjoner > 10 kb hele genomet - ser ikke balanserte kromosomfeil High throughput sekvensering (HTS) - Påviser rekkefølgen av baser i enten hele genomet, eller i utvalgte deler

25 Screeningmetoder hvor man analyserer flere gener samtidig Karyotyping - påvisning av store strukturelle feil >5-10Mb - påvisning av numeriske feil - avhengig av celler i deling Array CGH - påvisning av delesjoner/duplikasjoner > 10 kb hele genomet - ser ikke balanserte kromosomfeil High throughput sekvensering (HTS) - Påviser rekkefølgen av baser i enten hele genomet, eller i utvalgte deler

26 Array CGH en metode for å påvise kopitallet til alle gener En glassbrikke har fragmenter av syntetiske DNA-biter festet til seg, hentet fra opptil 1 million kjente steder i genomet 100 µm 10 µm pixel resolution Chromosome 22 TBX1 genet Array

27 Signal fra TBX1-genet er grønne -> genet er tilstede i bare 1 kopi DNA fra pasient og kontroll kuttes i biter og merkes med hver sin farge - Røde signal: for mye fra pasient - Grønne signal: for lite fra pasient - Gule signal: like mye av hver Dataanalyse Beregne ratioer mellom fargestyrken for pasient / kontroll DNA fra pasient og kontroll binder til glassbrikken Scanning Ratioer gjøres om til log2-verdier: 0: normal (2 kopier) -1: heterozygot delesjon (1 kopi) >-2: homozygot delesjon (0 kopier) +0.58: duplikasjon (3 kopier) +1: duplikasjon (4 kopier) Ved at vi vet hvor det syntetiske DNA på glasset er hentet fra, kan vi finne ut hvilke gener hos pasienten som hadde et annet kopitall en kontrollen. Vi kan påvise delesjoner/duplikasjoner = ubalanse

28 Hvilke gener ligger i området? Hvilken funksjon har disse genene? Er noen av disse genene relatert til sykdom? Passer det med kliniske funn? Generelle databaser Ensembl OMIM, PubMed Kopinummer databaser: Database of Genomic Variants: Syndrom databaser: DECHIPHER GeneTests ECARUCA Unique Søke i syndrom-databaser Er det rapportert om tilsvarende avvik? Søke i databaser for kopivariasjon Er det rapportert som normalvariasjon? (vi har alle ca kopitallsvarianter, som utgjør ca. 4 mill basepar) er avviket årsak til sykdom hos pasient...eller ikke..?

29 High throughput sekvensering (HTS) Metode for å finne baserekkefølgen (sekvensen) i DNA Baserer seg på at man har biter av DNA fra pasienten på en glassbrikke Man tilsetter fargede baser, og lar dem binde til DNAet (A-T, G-C) Man tar bilde av dette, og ser rekkefølgen av hvilke baser som er bundet Når vi har sekvensen, sammenlikner vi denne med en referanse, og finner ut om det har oppstått en fx. missense Kan sekvensere utvalgte gener, eller ALT i en operasjon Metoden vil etterhvert være god nok til å erstatte alle andre metoder

30 Datalister over varianter Ofte > før man har tatt vekk de man vet er normale

31 Screeningundersøkelser Nyttige når man ikke er sikker på hvor man skal begynne å lete Her analyserer man hele eller store deler av arvematerialet i en analyse ->rask Finner av og til kjente varianter pga. kliniker ikke har gjenkjent tegnene Utfordring: forstå betydningen av det vi finner Metodene har vært drivere ift. internasjonalt samarbeide Deling av data helt avgjørende Mange funn er så sjeldne at ingen har påvist det før betydning uavklart Ofte helt avgjørende å finne en annen pasient med samme variant for å sannsynliggjøre betydningen

32 DiGeorge syndrom 22q11 delesjonssyndrom 1,5 Mb eller 3 Mb delesjon 24 eller 30 gener 94% de novo 6% arvet fra foreldre Foreldre kan ha en veldig mild fenotype, mange har ikke merket noe Mulige forklaringer på varierende uttrykk: Hyppig: 1/3000-1/6000 barn - Ulike varianter på det andre kromosomet - Modifiserende varianter i andre gener

33 Tilstander med redusert penetrans Noen genetiske tilstander har redusert penetrans det innebærer at fx. far og sønn kan ha samme variant, men bare en av dem er syke. En penetrans på 10% betyr at kun 1/10 med varianten blir syk

34 Eksempel på svar Array CGH påviste en 400 kb delesjon på.. som sannsynligvis er medvirkende årsak til pasientens fenotype. Den påviste delesjonen omfatter genene, og er forenelig med delesjonssyndrom (OMIM ). Tilsvarende delesjon er påvist hos et stort antall friske personer, men rapporteres noe hyppigere hos pasienter med språk- og lærevansker, forsinket utvikling og atferdsproblemer (ref.). Dette indikerer at den påviste delesjonen ikke alene kan forklare pasientens fenotype. Den påviste delesjonen anses som en risikofaktor for nevrokognitiv utviklingsforstyrrelse, men antas å ha en penetrans på kun ca. 10% (ref.).

35

36 Karyotyping Sanger FISH acgh HTS eksom HTS - genom Diagnostisk utbytte ved psykisk utviklingshemming Karyotyping: 3-6% Sanger og FISH: 6-10% acgh: 15-23% HTS eksom: 24-33% HTS genom: 26% Vissers L, Nat Rev Genetics 2016

37 Økning i antall gener forbundet med psykisk utviklingshemming De fleste recessive genene er forbundet med tilstander der PU bare er en del av bildet

38 Dagens utfordringer Vi kjenner sekvensen til hele genomet Vi har teknologien til å finne alle slags varianter, og den er rask Vi har masse kunnskap om >5000 monogene sykdommer, ulike kromosomforandringer, ulike sykdomsmekanismer og behandlingsmuligheter...men vi har ikke full oversikt over funksjonen til alle gener...eller hvordan en bestemt variant endrer funksjonen til genproduktet; proteinet...vi har ikke oversikt over samspillet mellom genene...og ikke full forståelse av hvorfor samme forandring kan gi så forskjellig utfall...og vi finner stadig nye varianter som ingen har sett før