I lys av akkreditering Overgang fra Sanger sekvensering til dypsekvensering innen genetisk sykdomsdiagnostikk

Transkript

1 I lys av akkreditering Overgang fra Sanger sekvensering til dypsekvensering innen genetisk sykdomsdiagnostikk Knut Erik Berge, Avdeling for medisinsk genetikk, Oslo universitetssykehus Ullevål Agenda DNA hva vet vi? DNA historie. Metoder for å undersøke DNA. Ny sekvenseringsteknologi ved AMG. Akkreditering. 1

2 Det humane genom 46 kromosomer. 3 milliarder basepar. ~ gener. Kodende sekvenser utgjør kun 1 2% av det det totale genom. Variasjon forekommer 1/ /1300 nukleotide. Et individ har unike non synonyme og unike synonyme varianter (dvs ulikt fra referansegenomet). Hvert individ er bærere av 100 mutasjoner som slår av genet, og 20 gener er fullstendig slått av nyoppståtte mutasjoner per generasjon. Det humane genom 46 kromosomer. 3 milliarder basepar. ~ gener. Kodende sekvenser utgjør kun 1 2% av det det totale genom. Variasjon forekommer 1/ /1300 nukleotide. Et individ har unike non synonyme og unike synonyme varianter (dvs ulikt fra referansegenomet). Hvert individ er bærere av 100 mutasjoner som slår av genet, og 20 gener er fullstendig slått av nyoppståtte mutasjoner per generasjon. 2

3 DNA historie 1866: Gregor Mendel krysset hvite og røde erteblomster. Tillegger at årsaken til observasjonene var forårsaket av faktorer. 1869: Sveitseren Johann Friedreich Miescher studerte cellekjerner og identifiserer en ny og ikke tidligere beskrevet forbindelse som besto av tilsynelatende store molekyler. Miescher gir forbindelsen navnet nuclein, noe som i ettertid viste seg å være et kompleks bestående av DNA og proteiner. 1909: Begrepet gen that which produces (genere) for Mendels faktorer introduseres av dansken Wilhelm Johannsen. DNA historie 1944: Avery viser at snille pneumokokker blir sykdomsgivende når de blandes med DNA fra slemme pneumokokker. Dette er det første holdepunktet for at the gene er DNA og ikke proteiner. 1953: Francis Crick og James Watson beskriver DNA strukturen! 3

4 DNA struktur To motsatt orienterte spiraler bestående av ytre sukkerfosfat bindinger. Inn mot midten er basene orientert og disse danner basepar. Rekkefølgen av basene inneholder oppskriften til proteiner. DNA er universelt. DNA historie 1977: Fredrick Sanger utvikler metode for sekvensering av DNA (=Sangersekvensering). 1987: Kary Mullis utvikler polymerase chain reaction (PCR), en teknologi som gjør en raskt og enkelt i stand til å mangfoldiggjøre DNA. Nordmannen Kjell Kleppe ( ) beskrev allerede prinsippet for PCR i en artikkel som ble publisert i : Sekvensen av det humane genom publiseres. 4

5 Standardmetoder på genetisk laboratorium Fragmentanalyse MLPA DNA sekvensering Enkeltbasemutasjoner Små delesjoner/insersjoner FISH Southern blotting Karyotyping Array CGH Dypsekvensering et paradigmeskifte Sanger sekvensering: Sekvensering av ett og ett område på basepar i hver reaksjon. Dypsekvensering*: Massiv parallellisering av sekvenseringen. Kan sekvensere hele genomet på en gang (ca. 3Mb). *Next generation sequencing (NGS), High Throughput Sequencing (HTS) 5

6 Dypsekvensering et paradigmeskifte Parameter ABI 3100 ABI 3730 HiSeqX Sekvenseringslengde 700 bp 700 bp 150 bp (x2) Ant. sekvenseringer per run x 10 9 Sekvenseringstid 2 t 30 min 3 dager Tid for 1 x humane genom (3 Gb) 120 år 15 år 8 min Dypsekvensering gir nye muligheter Store muligheter for effektivisering: Mange gener kan sekvenseres samtidig. Nye pasientgrupper får tilbud. Større mulighet til å finne årsak til sykdom. Ny kunnskap fra forskning kan implementeres raskere i diagnostikk. 6

7 Prisutvikling Dypsekvensering prinsipp Assembly» (=montering) av korte DNA sekvenser 7

8 Rådata behandles i bioinformatisk pipeline Strategier ved dypsekvensering Målrettet sekvensering: Kun gener analysen er designet for. Eksomsekvensering: Alle kodende områder. Ca gener 1 2 % av genomet Bioinformatisk filtrering av kandidatgener for ulike diagnoser. Genomsekvensering: Hele genomet sekvenseres. Bioinformatisk filtrering av kandidatgener for ulike diagnoser. 8

9 Diagnostisk HTS prosjektgruppe, Seksjon for laboratoriediagnostikk, AMG OUS Ullevål 2012: Prosjektgruppen etableres. 2016: Vedtatt å bli en egen enhet. Gruppemedlemmer: 8 laboratorieingeniører. 10 bioinformatikere. Gruppeleder. HTS tilbud ved AMG Eksomsekvensering Antall gener (funn%) Målrettet sekvensering Antall gener (funn%) Bindevevssykdommer 44 (5%) Trio undersøkelse ved PU 750 (20%) Ciliopati 115 (19%) Kardiomyopati 46 ( ) Epileptisk encefalopati og PU 57 (10%) Arvelig kreft 17 ( ) Hereditær spastisk paraparese og ataksi 51 (15%) Iktyose 40 (75%) Reanalyser for nytt genpanel (24%) Mitokondriesykdommer 213 ( ) Epidermolysis bullosa 20 (57%) Ektodermal dysplasi 34 (63%) Immunsvikt 308 ( ) Kortikale malf. og pontoc.hypoplasi 136 (20%) Kraniofaciale malformasjoner 58 (5%) Bevegelsesforstyrrelser 240 ( ) Psykisk utviklingshemming (PU) 850 ( ) 9

10 Diagnostisk aktivitet Prøvevolum 2015 (Inkl piloter og reanalyser) Gj.snitt svartid (dager) Prøver mottatt 2016 (per 3/11, inkl piloter, reanalyser og trio) Gj.snitt svartid (dager) Eksomer mottatt 2016 (per 3/11) Gj.snitt svartid (dager) Gjennomsnitt 60 dager for eksom i produksjon. > 95% av prøvene svares ut innen tre måneder. Forventer kortere svartider i Akkrediterings utfordringer Sanger sekvensering godt innarbeidet metode over flere år. HTS en ny teknologi under rask utvikling. 10

11 Akkrediterings utfordringer Nye instrumenter; Sekvensatorer: Endring av sekvenserings plattform medfører vesentlige endringer i laboratoriet og innen bioinformatikk. Exomsekvensering > genomsekvensering? Roboter: Manuelle arbeidsoppgaver erstattes av automatiserte prosedyrer. Ombyggingsprosjekt; Utvidelse og tilretteleggelse av laboratorielokaler. Installering av kjøleanlegg. Akkrediterings utfordringer Nye pasientgrupper nye genpaneler! Utvide antall gener i et panel? Stadig forespørsler fra rekvirenter. Bioinformatiske endringer; Pipeline oppdateres kvartalsvis tilpasset forespørsler og forbedringer. Reanalysering; Mutasjonsnegative pasienter undersøkes for flere paneler (dataene er jo tilgjengelig!). Etablere gode og effektive prosedyrer for dette. 11

12 Akkrediterings utfordringer Tolkning av resultater. Hva er sikre sykdomsgivende varianter? Hva er usikre varianter? Skal disse svares ut??? Hva er normale varianter? Amr et al. (2016): > pasienter us. > varianter i 132 gener > 6900 unike varianter > 2400 usikre varianter Internasjonale retningslinjer utarbeidet (ACMG). Utvikling av variantvurderings verktøy (ella). HTS dynamisk! Et fagfelt i rask utvikling! Instrumenter. Endringer i teknologi. Nye oppdateringer. Ny forespørsler. Veien blir til mens man går den! Fleksibilitet viktig! Vil definert/fast akkreditering hindre behovet for rask omstilling? 12

13 Endringer i prosedyrer 2016 Totalt 97; Laboratorieprosedyrer; 79 Bioinformatiskeprosedyrer; 18 HTS relaterte prosedyrer; 14 Direkte fleksibel akkreditering? Nyttig ved virksomheter som er i bevegelse! Endringer i prosedyrer 2016 Totalt 97; Laboratorieprosedyrer; 79 Bioinformatiskeprosedyrer; 18 HTS relaterte prosedyrer; 14 Direkte fleksibel akkreditering? Nyttig ved virksomheter som er i bevegelse! 13

14 Akkreditering av HTS ved AMG, OUS Godt samarbeid med Seksjon for kvalitet og drift Regelmessige arbeidsmøter. Internrevisjoner. Prosedyrer skrives. Validering og verifisering. Velfungerende avvikshåndtering Lav terskel. Målet er å sende inn søknad om akkreditering innen sommeren 2017 Ferdigstille validering og verifisering av metoder og instrumenter. Ferdigstille prosedyrer. 14