NGS = Next generation sequencing Massiv parallell sekvensering (MPS) Dypsekvensering

Transkript

1 NGS Sonja E. Steigen Overlege, Diagnostisk klinikk klinisk patologi, Universitetssykehuset Nord Norge Professor II, IMB, Uit Norges arktiske universitet 1

2 NGS = Next generation sequencing Massiv parallell sekvensering (MPS) Dypsekvensering Gir mulighet til å sekvensere en rekke genregioner og prøver parallelt. Persontilpasset medisin Teste tumorceller Vevsprøve Tilstrekkelig materiale God nok kvalitet Invasiv prosedyre cancer/cf/slideshows/7 signs and symptoms of lung cancer life stories/trainee nurse saw three doctors

3 Liquid biopsies Undersøkelse i blod Finne deler av DNA fra tumor (cellefritt DNA, cfdna) Finne sirkulerende tumorceller (CTC) Finne kreft i tidlig stadium/ Bekrefte kreftdiagnose Monitorere behandling Tilbakefall av kreftsykdom comprehensive approach to liquid biopsy/ Små mengder! Må kunne identifisere CTC/cfDNA med sikkerhet biopsy.gene quantification.info/ 3

4 Teste tumorceller mutasjoner? Presisjonsdiagnostikk for bedre behandling! Reflekstesting: Gjøres automatisk som en del av rutinen (ex lunge og EGFR) På etterspørsel: Ved spørsmål om iverksetting av utvidet behandling (ex coloncancer og RAS) Bestilling av prøver Formalinfiksert materiale Minst 10 % tumorceller på hele snittet < 10 % = ringe inn område Rekvirenten (patologen) MÅ angi tumor % Organ/type tumor 4

5 Sekvenseringsbibliotek Plukker ut aktuelle gener (klinisk relevans solide svulster) Benytter Polymerase chain reaction (PCR) (amplifisere/lage mange kopier av en bestemt DNA sekvens) Hver av disse segmentene kalles amplikon Primer Primer Amplicon content/uploads/2013/05/onepcr.png 5

6 Sekvenseringsbibliotek 250 amplikon med basepar = ca basepar Hvert amplikon/base blir sekvensert mange ganger (ved NGS minimum 500x) som gi stor lesedybde Mutasjoner som finnes i få celler kan unngå å «bli sett» ved få runder med sekvensering Ved mange runder med sekvensering («lest mange ganger») kan man få høy dekning av alle regionene i genet = HØY SENSITITET 6

7 Verktøykassa! Mange tumorer inn (strek kode): T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 Mange mutasjoner ut (parallelt): EGFR RAS KIT BRAF og oppbevaring/verktoykasser/verktoykasse / Tumorene «kobles» til mutasjonene T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 EGFR RAS KIT BRAF PARALELL TESTING av ALLE PRØVENE SAMTIDIG! 7

8 Validering Ny metode = like bra/bedre enn eksisterende metode Evaluering og dokumentasjon Teste ut mot prøver vi har kjørt før Test ut mot «kjøpte» mutasjoner (referansemateriale) Test ut mot referansemateriale fra Gen QA (UK NEQAS) Gjøre testene flere ganger (repeterbarhet/reproduserbarhet) Akkreditering? Rapportering Rapportere funn av klinisk relevans Gene Exon som undersøkes Rapporteres ved følgende tumortype BRAF Exon 15 CRC og melanom EGFR Exon 12,18, 19, 20, 21 Lunge KRAS Exon 2,3,4 CRC NRAS Exon 2,3,4 Lunge, CRC KIT Exon 8, 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18 GIST og melanom PDGFRA Exon 12, 14, 18 GIST 8

9 Rapportering I tillegg undersøkes hele eller deler av følgende gener: AKT1, ERBB2, FOXL2, GNA11, GNAQ, MET, PIK3CA, RET og TP53. Dette står i laboratoriehåndboka Resultat fra disse undersøkelsene kan fås ved henvendelse til laboratoriet. 9

10 Rapportering Rapportering 10

11 Rapportering I II III IV Høy klinisk relevans Potensiell klinisk relevans Usikker klinisk relevans Benign/sannsynlig benign variant 11

12 Presisjonsdiagnostikk innen patologien Bygge opp kompetanse i laboratoriet Samarbeid! MDT Kliniker, røntgen, patolog Utfordringer Kompleks tolkning! Store krav til kompetanse i molekylær genetikk og bioinformatikk Kan gi resultater med usikker klinisk betydning Sårbar for feil, vente en uke på neste kjøring Kostbart 12

13 Fordeler? Betydelig utvidelse av mutasjonsundersøkelsene Kvantitativ undersøkelse Felles rutiner for mange undersøkelser Krever lite materiale (10 % neoplastiske celler!) Fremtidsrettet Konsekvens for behandlingsregimer Tester på kjente mutasjoner innen forskjellige tumortyper Klinisk betydning Fremtiden «Teste på tvers.» Mutasjonene bestemmer behandlingen og ikke tumortype clipart drawing/ 13

14 Spørsmål? 14