Molekylær patologi Amplifikasjonsmetoder

Transkript

1 Molekylær patologi Amplifikasjonsmetoder Emiel Janssen Seksjonsleder for Kvantitativ og Molekylær Patologi Daglig leder for laboratoriet for molekylær biologi Avdeling for Patologi Stavanger Universitetssjukehus Professor II, Biomedisin, UiS Hvorfor patologi diagnostikk Bekrefte funn gjørt mha andre teknikker benigne vs maligne primair vs. metastase frie operasjons kanter gradering og stagering subklassifisering ifm terapi 1

2 The Cancer Process Risikofaktorer for kreftutvikling Arvelige mutasjoner/ polymorfismer Infeksjoner med HPV, EBV, Helicobacter Pylori Miljø: Asbest, stråling Livstil: Fedme, diabetes, inaktivitet, stress, røyking All disse faktorene føre til reversible og irreversible endringer i genomet 2

3 Mutasjoner Spontan mutasjonsrate = 1 hver baser hver celledeling Antall baser i et genom = 6 x 10 9 Antall mutasjoner= 1 hver genomet hver celledeling Antall celledelinger = 10 7 hver sekund Dere vil få 18 milliard mutasjoner gjennom min forelesning Sentrale dogma DNA RNA PROTEIN mikrorna 3

4 Molecular Pathology DNA Mutations DNA: base substitutions: - conservative - missense - nonsense: stopcodon addition / deletion frame-shift A CAT SAW A FLEE A CAT ZAW A FLEE A RAT SAW A FLEE A CAT. A CAA TSA WAF LEE A CTS AWA FLEE Molecular Pathology Numerical abberrations 4

5 Molecular Pathology Deletion f. eks. EGFR -Lunge Molecular Pathology Duplication f. eks. Her2neu -Bryst 5

6 Molecular Pathology Translocation f. eks. ALK -Lunge Molecular Pathology Inversion f. eks. ALK -Lunge 6

7 Valg Hva vil man detektere? Materialet (FFPE, fersk, blod, urin) DNA/mRNA/mikroRNA/ctDNA Spesifisitet vs sensitivitet 7

8 Amplifikasjonsmetoder Hvorfor?? DNA fra en celle er 2 meter i lengde Ca. 6 pg DNA i hver celle (diploid) Så hvis man trenger 10 ng for en analyse = 1667 celler Hvis bare 10 % tumor celler celler = 16,7 µg vev DNA er degradert PCR reagenser Input materialet DNA/cDNA/RNA/microRNA osv Buffer/MgCl2 Primere Polymerase Nukleinsyre Sensitivitet?? Spesifisitet?? 8

9 PCR Polymerase Chain Reaction Foreslått i 1971 av Gobind Khorana Utviklet av Kary Mullis i 1984 mha klenow (E-coli) 1985 Taq (Thermus Aquaticus)-polymerase 1986 first prototype for PCR maskin PCR Amplifisere mengde tilgjengelige DNA (dobbeltstreng) Spesifikke områder eller alt 1 Cycle 94 Denaturation Extension Primer Annealing Time 9

10 PCR-methods rtpcr qpcr Pna-clamp PCR ddpcr coldpcr 10

11 rt-pct Enkel trins/dobbel trins Type primere (Hexa, poly T, spesifikk, multiplex) Type enzym Spike inn Kvantitativ PCR 11

12 HRM= høy oppløsning smelte kurve Sybrgreen eller prober Mye billigere Sjekk spesifisitet=smeltkurvene Sjekk amplifikasjon effektivitet Mer spesifikk Bra med lav ekspresjons nivå Molecular beacons Scorpion 12

13 Scorpion prober ganske likt molecular beacons LNA/PNA Locked Nucleic Acid Peptide Nucleic Acid Mer stabil binding med DNA/RNA Spesielt mot korte fragmenter Veldig spesifikk, opptil til en base Likt Tm for ulike prober 13

14 P(L)naCLAMP PNA eller LNA prober har høyere bindings affinitet Mer spesifikk Mutasjonsdeteksjon Blokkere vekk noen spesifikke gener (globin blokker) ARMS 14

15 Digital Droplet =ddpcr dpcr Beaming Fluidigm ddpcr Raindance 15

16 Cold PCR ko-amplifisering ved lavere denaturerings temperatur PCR Rettet mot heteroduplex mt-wt DNA Gi mer spesifisitet og høyer sensitivitet for visse endringer Ingen ekstra kostnader Veldig sensitiv, må optimaliseres < 200bp Forskjellig mutasjoner kan ha forskjellige temperaturer By Matthew Trudeau - Own work, Public Domain Multiplex + helgenom 16

17 Enkelt celle WGA Epigenetikk Wick et al; Nature Reviews Neurology Volume: 10, Pages: ; (2014) 17

18 18

19 Amplifikasjonsmetoder Hva slags informasjon vil du ha Hva er utgangsmaterialet Sensitivitet eller spesifisitet Kontroll metoder, positive/negative kontroller Referanse materialet reproduserbarhet Utstyr tilgjengelig Pris per test, mulighet for å samkjøre testene Kontekst/tolkning resultater 19

20 Molekylær diagnostikk Reagens utgifter øker kraftig Ressurs bruk øker kraftig Kunnskaps nivå bør øker kraftig MEN!!!!! Å behandle de riktige pasienter med de riktige medikamenter vil spare pasienter for unødvendige overbehandlingen og vil gi bedre effekt av behandlingen Takk for opmerksomheten 20