Kvantitative genteknologiske analyser

Transkript

1 Kvantitative genteknologiske analyser TH Svein Arne Nordbø

2 Indikasjoner for kvantitative analyser Vurdere klinisk betydning av mikrobefunn gjort med meget sensitive metoder Monitorere grad av viremi før oppstart av behandling Overvåke behandlingseffekt Diagnostikk av mutanter

3 Viktige trinn i analysen Valg av prøvemateriale Oppbevaring/transport Nukleinsyreekstraksjon cdna syntese Metodevalg Standardisering Tolkning

4 Prøvemateriale Serum/plasma EDTA-blod (helblod) Hvite blodlegemer Spinalvæske Andre biologiske materialer Nasofarynxaspirat Biopsi Fæces

5 Valg av prøvemateriale Bygger mye på empiri Serum/plasma (HIV, hepatitt B og C virus, parvovirus B19 m.fl.) EDTA-blod (helblod) (CMV og EBV) Hvite blodlegemer (CMV og EBV: kopier/10 5 celler) Spinalvæske: sammenlikne konsentrasjoner med samtidig tatt blodprøve hvis mistanke om defekt blod/hjernebarriere Andre biologiske materialer: Store metodologiske utfordringer pga forskjell i kvalitet på ulike materialer

6 Oppbevaring/transport Serum/plasma oppbevares ved kjøleskaps-temperatur inntil forsendelse EDTA-blod oppbevares ved 2-25ºC inntil evt. separasjon (helst innen 6 t) Transporttiden uten nedkjøling bør helst ikke overstige 24 t (gjelder spesielt RNA-virus) Unngå om mulig frysetining Følg instruksjonene til kommersielle kit-leverandører Ved lengre tids lagring (>3 døgn) før analysering skal prøvene oppbevares ved -70ºC

7 Nukleinsyre stabilitetstesting Pakningsvedlegg TM48

8 Pakningsvedlegg TM48

9 Pakningsvedlegg TM48

10 Nukleinsyreekstraksjon Evt. forbehandling av prøven Manuell ekstraksjon Automatisert ekstraksjon Separat DNA eller RNA ekstraksjon Kombinert DNA/RNA ekstraksjon (Boom) Sensitiviteten avhengig av prøvevolum og elueringsvolum

11 cdna syntese (RNA/RT-PCR) Random primers Evt. tilsetting av spesifikk primer Separat trinn eller kombinert med PCRkjøringen (one-step)

12 Kvantitative metoder Signal-amplifikasjonsmetoder bdna Hybrid capture Templat-ampifikasjonsmetoder PCR Konvensjonell Real-time ddpcr NASBA TMA Microarray

13 Templat-amplifikasjon vs signal-amplifikasjon Virus, bacterium or cell Target RNA or DNA TMA Add primers & enzymes PCR Add primers & enzymes bdna Add target probes and amplification probes Copies (RNA) Copies (DNA) One detection probe per copy One detection probe per amplified copy Multiple detection probes per target

14 Signal-amplifikasjonsmetoder Litt lavere sensitivitet enn gen-amplifikasjonstestene Mindre lineært måleområde Noe bedre reproduserbarhet (lavere cv)

15 Ranges of HBV DNA Assays x Roche (PCR) AMPLICOR Monitor v2.0 COBAS Monitor v2.0 TaqMan HBV ASR (PCR) Bayer (bdna) VERSANT HBV 1.0 VERSANT HBV 3.0 Digene II (Hybrid Capture) Ultrasensitive Standard ,000, , ,000, ,000 5,000,000, ,000, ,000, ,000 1,700,000,000 Courtesy of Robert G. Gish, MD HBV DNA Concentration in Log 10 Copies/mL

16 Chernoff, J Int Assoc Physicians AIDS Care 2002:1:134-40

17 Templat-amplifikasjonstester Meget sensitive og spesifikke metoder Varierende korrelasjon mellom ulike testmetoder Kontaminasjonsfare dutp/ung Internkontroll Spiking med fremmed DNA/RNA før ekstraksjon Egne primere (separat kjøring/multiplex) Tilsetting av internkontroll til PCR-mix Samme primere som målsekvensen Deteksjon av housekeeping genes Glucose-6-phospate dehydrogenase (G6PDH) m.fl. (DNA) Beta-actin m.fl. (RNA)

18 Inhibisjon Revers transkribering (RT) og PCR trinn kan inhiberes av urenheter i DNA/ RNA eluatet Inhibitorer kan stamme fra: Prøvematerialet Heparin, proteiner (hemoglobin ), polysakkarider, klorofyll, melanin m.m. Nukleinsyre ekstraksjonen Detergenter (SDS), fenol, etanol, proteinase K, salter (guanidinium, natrium acetate )

19 Rn Rn Hvordan sjekke for inhibitorer Spike med positiv amplicon og vann (kontroll) før PCR Spike med positiv amplicon og prøve før PCR Spike før RT hvis det er RNA som skal amplifiseres Prøve Ingen inhibisjon Kontroll Inhibisjon Cq Cq Antall sykler Cq Cq Antall sykler

20 Internkontroll med hybridiseringsprober (FRET)

21 HIV-kvantitering: Korrelasjon mellom NASBA (EASYQ) og PCR (Roche)

22 Real-time PCR Like sensitiv som nested PCR Meget god reproduserbarhet Betydelig raskere enn konvensjonell PCR Semikvantitativ metode Automatisert deteksjon med fluoroforer Betydelig bedre presisjon og mye større dynamisk område for kvantitative analyser Egner seg godt for multiplex PCR

23

24

25 Kvantitering med real-time PCR Hver PCR-syklus genererer dobbelt så mange amplicons En 10-folds endring i konsentrasjon tilsvarer 3,3 Ct (2 3,3 )

26

27

28 Standard Sekvens med kjent konsentrasjon Ekstern: Amplifiseres i egen brønn/kapillær Intern: Amplifiseres sammen med prøven Eksogen: Tilsettes PCR-mixen Endogen: Gensekvens som forekommer naturlig i prøvematerialet (for eksempel housekeeping genes som G6PDH)

29 Standard (forts.) Heterolog: Forskjellig sekvens som amplifiseres med forskjellige primere Homolog: Minimal forskjell fra målsekvensen. Amplifiseres med de samme primerene Kalibrator: Brukes til å justere verdiene pga lotvariasjoner (kalkulerte verdier divideres med verdien til kalibratoren)

30 Retningslinjer for preparering av standarder Den amplifiserte sekvensen bør være homolog med målsekvensen DNA Lineært plasmid Renset PCR-produkt RNA Syntetisk in vitro transkribert RNA

31 Beregning av konsentrasjon

32 Beregning av molekylvekt (MW)

33 Beregning av mengde

34 Standardkurve Ved bruk av eksterne standarder må amplifikasjonseffektiviteten være den samme som for målsekvensen En intern positiv kontroll kan kompensere for evt. inhibisjon Fit points method Brukeren setter baseline selv Nyttig ved bakgrunnsstøy og problematisk standardkurve Second derivative maximum method Automatisert kalkulasjon Bruker kan evt. fjerne outlayers blant replikater av hver enkelt standard

35 Kvantitative metoder Absolutt kvantitering Med ekstern standard Med ekstern standard og intern positiv kontroll Relativ kvantitering Relatert til konsentrasjon av housekeeping gene

36 Digital droplet PCR (ddpcr) Ny teknikk som distribuerer ekstrahert DNA i meget små (nano) dråper (olje-emulsjon) Måler fluorescens-intensitet i hver dråpe etter amplifiseringen (endepunkts-pcr) Beregner templatmengden ved hjelp av Poissonstatistikk uten bruk av ekstern standard Meget god presisjon og reproduserbarhet (lav cv) Høy sensitivitet, men lavere dynamisk måleområde enn real-time PCR Kostbar teknikk som fortsatt sliter med noen «barnesykdommer»

37

38

39 Deteksjon av mutanter med ddpcr Fig. 2 Detection of rare mutant alleles in a background of wild-type DNA by digital PCR. (A) In conventional qpcr, mutant and wild-type alleles are mixed together in one bulk reaction where rare mutants compete for reagents with more abundant wild-type DNA... Ruth Hall Sedlak, Keith R. Jerome Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Volume 75, Issue 1, 2013, 1-4

40 Klinisk anvendelse av kvantitative metoder Nytteverdi Utfordringer

41 Cumulative Incidence of HCC (%) Baseline HBV DNA Level and Cumulative Incidence of HCC Entire Cohort (REVEAL Study) N = 3653, 13-year follow-up < < < < IU = ~5 copies/ml Chen C-J, et al. JAMA. 2006;295:65. HBV DNA (Copies/mL)

42 Cumulative Incidence of HCC (%) Baseline HBV DNA Level and Cumulative Incidence of HCC Subgroup of Noncirrhotic HBeAg Patients with Normal ALT N = < < < < Chen C-J, et al. JAMA. 2006;295:65. HBV DNA (Copies/mL)

43 Viral Load Testing Copies/mL to IUs* Assay Versant HBV DNA 3.0 (bdna) Cobas Amplicor HBV Monitor Conversion Factor 5.2 copies/ml = 1 IU/mL 5.6 copies/ml = 1 IU/mL Cobas TaqMan 48 HBV 5.8 copies/ml = 1 IU/mL 1 pg = 283,000 copies *Conversion factors given by the manufacturers. Zeuzem S. Methods Mol Med. 2004;95:3.

44 EBVgenom

45 Niesters et al. J Clin Microbiol. 2000;38:712-5.

46 E B V -cop ies/µg D N A Viral load as a marker for disease activity Viral load is significantly higher in patients with PTLD vs. patients without single cases prove the opposite: a negative viral load does not exclude PTLD a high viral load does not prove PTLD p < 0, P atien ts with ou t P TL D P atien ts with P TL D Gärtner et al., J Clin Microbiol 2002;40:351

47 Journal of Clinical Virology 41 (2008) The median time interval between NPAs taken at admission and discharge was 7 (2 15) days, while the median interval between admission and the first medical visit after discharge was 21 (17 29) days.

48

49 Kasus 1 år gammel jente Normal fødsel og utvikling Plaget med kolikksmerter Begynt i barnehage i januar 2007 Etter dette gastroenteritt 3 ganger, 1. gang påvist norovirus Siste 6 dager oppkast og diarè, hoste, tp. 40,5 ved innleggelse, lettere dehydrert

50 Funn Nasofarynksaspirat Humant metapneumovirus (Ct 41,0) Adenovirus (Ct 36,4) Humant bocavirus (Ct 26,6) Hemophilus influenzae (middels vekst) Fæces Humant bocavirus (Ct 34,1) og rotavirus.

51 Konklusjon Kvantitative analyser får stadig større betydning for diagnostikk og behandling av infeksjoner Fortsatt noe mangelfull standardisering av metoder Internasjonale standarder mangler for mange agens Korrelasjon til klinikk kan være en utfordring Kvantiteringer utført ved ett laboratorium kan ikke uten videre sammenlignes med kvantiteringer utført ved et annet laboratorium Pasienter bør om mulig følges opp med samme metode utført ved samme laboratorium

52 Oppgave: Er denne pasienten HBV-DNA positiv?