Kvan%ta%v sann%ds PCR %l diagnos%sk bruk. Sann%ds PCR. Prøvemateriale og prøvehåndtering

Transkript

1 Kvan%ta%v sann%ds PCR %l diagnos%sk bruk Kvan%ta%v sann%ds PCR %l diagnos%sk bruk Økende bruk, men Mange kilder %l usikkerhet/variasjon Alle tester skal valideres/verifiseres før diagnos%sk bruk Fordel at metoder %l klinisk forskning enkelt kan overføres %l diagnos%sk bruk Sara Bremer Sara Bremer Oversikt Trinnene for sann%ds PCR- analyse av DNA/RNA Oversikt Trinnene for sann%ds PCR- analyse av DNA/RNA Prøvemateriale og prøvehåndtering Ekstraksjon DNA/ RNA (total/mrna) (RNA) Sann%ds PCR Prøvemateriale og prøvehåndtering Ekstraksjon DNA/ RNA (total/mrna) (RNA) Sann%ds PCR - Blod/vev - Oppbevaring - Holdbarhet Relevante retningslinjer: - UtbyTe - Kvalitet - Renhet OECD Guidelines for quality assurance in molecular gene%c tes%ng, Primingstrategi - Enzym Clinical and Laboratory Standars Ins%tute. MM1- A2. Molecular Diagnos%cs Methods for Gene%c Diseases; Approved Guideline - Metodedesign - Rela%v/absoluT - Referansgener - Kontroller - Dataanalyse - Kategorisering - Svarrapportering - Blod/vev - Oppbevaring - Holdbarhet Relevante retningslinjer: - UtbyTe - Kvalitet - Renhet OECD Guidelines for quality assurance in molecular gene%c tes%ng, Primingstrategi - Enzym Clinical and Laboratory Standars Ins%tute. MM1- A2. Molecular Diagnos%cs Methods for Gene%c Diseases; Approved Guideline - Metodedesign - Rela%v/absoluT - Referansgener - Kontroller - Dataanalyse - Kategorisering - Svarrapportering EP17- A, Protocols for Determina%on of Limits of Detec%on and Limits of Quan%fica%on EP17- A, Protocols for Determina%on of Limits of Detec%on and Limits of Quan%fica%on Clinical and Laboratory Standards Ins%tute. MM13- A. Collec%on, Transport, Prepara%on, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Ins%tute. MM13- A. Collec%on, Transport, Prepara%on, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. Bus%n SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum informa%on for publica%on of quan%ta%ve real- %me PCR experiments. Clin Chem 2009;55: Bus%n SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum informa%on for publica%on of quan%ta%ve real- %me PCR experiments. Clin Chem 2009;55: MaTocks CJ, et al. A standardized framework for the valida%on and verifica%on of clinical molecular gene%c tests. Eur J Hum Genet MaTocks CJ, et al. A standardized framework for the valida%on and verifica%on of clinical molecular gene%c tests. Eur J Hum Genet

2 Prøvemateriale og prøvehåndtering DNA RNA RNA- analyser: prøvemateriale og prøvehåndtering Fullblod PAXgene Blod (MBK/FAR- OUS, LKB- HUS) - EDTA/sitrat (Hårsekker, blodspot (MBK- RH)) Formalinfiksert vev (Mol.pat, OUS) Oppbevaring, holdbarhet C, alikvoter - Blod/DNA- eluat? - Hvordan evaluere dete? Blod (MBK- RH) - PAXgene- rør - Heparin, ex vivo immunak%vering Formalinfiksert vev (Mol.pat, OUS) Stabilisering RNA- profil Oppbevaring, holdbarhet C, alikvoter - Blod/RNA- eluat? - Hvordan evaluere dete? EDTA- rør Percentage of t0 yields of total RNA from blood stored for 30 days in PAXgene tubes at 4 C ( ) and 20 C ( ) and EDTA tubes at 4 C ( ) and 20 C ( ). 5 Ref: Rainen L et al., Clinical Chemistry, RNA- analyser: prøvemateriale og prøvehåndtering Beinmarg RNA- analyser: prøvemateriale og prøvehåndtering PAXgene Blood RNA Tube (IVD), Qiagen/BD Tempus Blood RNA Tube, Applied Biosystems Ref: PreAnaly%x 7 8 2

3 RNA- analyser: prøvemateriale og prøvehåndtering Men, PAXgene/Tempus- rør er Bare egnet %l spesifikke prøvematerialer (blod, beinmarg) Ikke egnet %l alle nedstrøms applikasjoner Kostbare Hva med andre prøvematerialer? Isolerte cellepopulasjoner Vev: ferske prøver vs. formalinfiksert 9 Oversikt Trinnene for sann%ds PCR- analyse av DNA/RNA Prøvemateriale og prøvehåndtering - Blod/vev - Oppbevaring - Holdbarhet Relevante retningslinjer: Ekstraksjon DNA/ RNA (total/mrna) - UtbyTe - Kvalitet - Renhet OECD Guidelines for quality assurance in molecular gene%c tes%ng, 2007 (RNA) - Primingstrategi - Enzym Clinical and Laboratory Standars Ins%tute. MM1- A2. Molecular Diagnos%cs Methods for Gene%c Diseases; Approved Guideline EP17- A, Protocols for Determina%on of Limits of Detec%on and Limits of Quan%fica%on Clinical and Laboratory Standards Ins%tute. MM13- A. Collec%on, Transport, Prepara%on, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. Bus%n SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum informa%on for publica%on of quan%ta%ve real- %me PCR experiments. Clin Chem 2009;55: MaTocks CJ, et al. A standardized framework for the valida%on and verifica%on of clinical molecular gene%c tests. Eur J Hum Genet Sann%ds PCR - Metodedesign - Rela%v/absoluT - Referansgener - Kontroller - Dataanalyse - Kategorisering - Svarrapportering Ekstraksjon DNA/RNA RIN ~ 10 18S 28S DNA Ekstraksjonsprinsipp - Automa%sert - Paramagne%ske silikapar%kler UtbyEe - NanoDrop: Konsentrasjon Kvalitet? Renhet? RNA Ekstraksjonsprinsipp - Automa%sert - Paramagne%ske silikapar%kler - DNase behandling UtbyEe - NanoDrop: Konsentrasjon Kvalitet - Agilent Bioanalyzer 2100: RIN, 28S/18S Bidrar med betydelig variabilitet i analyseprosessen Bør %lstrebe å redusere variabiliteten mest mulig Antall replikater? Prinsipp og oppset avhengig av nedstrøms analyser Kombinasjon av forankrede oligo(dt) og random heksamere primere Renhet - 260/280 nm ra%o, PCR- effek%vitet

4 Oversikt Trinnene for sann%ds PCR- analyse av DNA/RNA Strategier for kvan%fisering Prøvemateriale og prøvehåndtering - Blod/vev - Oppbevaring - Holdbarhet Relevante retningslinjer: Ekstraksjon DNA/ RNA (total/mrna) - UtbyTe - Kvalitet - Renhet OECD Guidelines for quality assurance in molecular gene%c tes%ng, 2007 (RNA) - Primingstrategi - Enzym Clinical and Laboratory Standars Ins%tute. MM1- A2. Molecular Diagnos%cs Methods for Gene%c Diseases; Approved Guideline EP17- A, Protocols for Determina%on of Limits of Detec%on and Limits of Quan%fica%on Clinical and Laboratory Standards Ins%tute. MM13- A. Collec%on, Transport, Prepara%on, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved Guideline. Bus%n SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum informa%on for publica%on of quan%ta%ve real- %me PCR experiments. Clin Chem 2009;55: MaTocks CJ, et al. A standardized framework for the valida%on and verifica%on of clinical molecular gene%c tests. Eur J Hum Genet Sann%ds PCR - Metodedesign - Rela%v/absoluT - Referansgener - Kontroller - Dataanalyse - Kategorisering - Svarrapportering LBK- HUS Ekstern standard AbsoluT Ekstern standard med intern kontroll Kvan%fisering Uten effek%vitetskorreksjon 14 Rela%v Kalibratornormalisert Med effek%vitetskorreksjon OUS Ekstern standard Metoder Deteksjonsformat Ubundet Uspesifikk binding Egenutviklet Fordeler - Fleksibilitet - Tilgjengelighet (finnes oue ikke kit) - Pris - Datatolkning/problemløsning Ulemper før bruk - Tidkrevende - Må CE- merke reagenser Kit Fordeler - Enklere og mindre %dkrevende - Verifisering før bruk Ulemper - Pris - Mindre fleksibilitet - Begrenset utvalg av metoder - Vanskeligere problemløsning Sekvensuavhengig: dsdna SYBR green I Op%malisering Kvan%fisering Andre: ResoLight High Resolu%on mel%ng Sekvensspesifikk Hybridiza%on probes Hydrolysis probes Universal ProbeLibrary SimpleProbe Molecular Beacons SYBR Green I Ubundet Hybridiseringsprober Spesifikk binding FRET Hydrolyseprober

5 Metodedesign plassering av primere og prober Transkriptvarianter Funksjon Sekvensvarianter Allelspesifikk PCR Hybridgener, tandemvarianter Unngå pseudogener DNA vs. RNA Intron- /eksonoverganger Sekvenssammensetning og homologi CYP2D6/CYP2D7P- hybrider Figur fra Gaedigk A et al., 2010 PCR- ligningen DNA- amplifikasjon TeoreIsk: Effek%vitet (E) = 2 (100 %) N n = N 0 x 2 n N n = Molekyler ved syklus n N 0 = Molekyler ved start n = Antall sykler Transkriptvarianter IMPDH1 (NCBI) Parametere som påvirker PCR- effek%viteten PCR- effek%vitetskorreksjon PCR inhibitorer: Hemoglobin, urea, heparin Organiske/fenol- forbindelser glykogen, lipider, Ca 2+, RT- enzym RNA/DNA quality DNA- fluoroforer (SYBR Green I, e%diumbromid) Uspesifikke produkter PCR- be%ngelser (Tid, temperatur) PCR- effekivitet PCR enhancere: DMSO, glycerol, BSA, formamid, PEG, TMANO, TMAC Kommersielle produkter: Gene 32 protein, Perfect Match, Taq Extender, AccuPrime RNA/DNA- konsentrasjon PCR- reagenser (MgCl 2, primere, probes, enzym) PCR- utstyr Effek%vitet: Oue E 2 PCR- ligning: N Cp = N 0 x E Cq Es%mering av PCR- effek%viteten Seriefortynning AbsoluT økning av fluorescens Matema%sk modell%lpasning f.eks. ΔE = 0,05 PCR- sykler % error 66 % error 113 % error

6 PCR- effek%vitetskorreksjon Rela%v kvan%fisering Referansegener for RNA- analyser PCR- ligning: N Cp = N 0 x E Cq Seriefortynningsmetoden PCR- produkt Amplifikasjon Lineær regresjon E = 10 (- 1/s%gningstall) Import av eksterne standardkurver E- metoden Fluorescens Syklus Syklus Log konsentrasjon (start) Husholdningsgener Koder for essensielle proteiner rrna, mrna Korrigerer for forskjeller i: Startmengde IsoleringsutbyTe RNA/DNA degradering RNA/DNA kvalitet PipeTering effek%vitet Tilstedeværelse av rela%vt intakt RNA Historiske ß- ac%n, GAPDH, 18S rrna Genekspresjon = målgen prøve referansegen prøve Rela%v kvan%fisering Referansegener for RNA- analyser Rela%v kvan%fisering Referansegener for DNA- analyser Op%male referansegener: Stabilt utrykk UTrykk på nivå med målgen RNA- spesifikk deteksjon Unngå pseudogener Refersansegenindeks: Kombinasjon av referansegener Ulike funksjonelle klasser Geometrisk snit: (a 1 x x a n ) 1/n IMPDH1 genekspresjon Hvor mange referansegener? Minst tre? Hvordan velge referansegener? Algoritmer? 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ALAS B2M G6PDH Dager eter transplantasjon Gen som koder for essensielt protein Ingen rapportert kopitallsvariasjon Eks. CYP2D6- kopitallsanalyse Albumin, ALB (72 bp) Ribonuclease P RNA component H1, RPPH1 Antall referanse gener? Hvordan velge? Korrigerer for forskjeller i: Startmengde IsoleringsutbyTe DNA- degradering DNA- kvalitet PipeTering Posi%v kontroll for ekstraksjon Kopitall = målgen prøve referansegen prøve

7 Rela%v kvan%fisering Normalisering %l kalibrator Sann%ds rela%v kvan%fisering Datanalyse Kalibratorprøve Prøve(r) med kjent kopitall Korrigerer for forskjeller mellom kjøringer Reagenser Instrumenter Kon%nuerlig kvalitetskontroll Kopitall/ genekspresjon = (målgen prøve /referanse prøve ) (målgen kalibrator /referanse kalibrator ) Programvare? Instumentprogramvare Ekstern programvare, f.eks. GenEx Sta%s%ske beregninger? Parametriske vs. ikke- parametriske tester Transformering av rådata Rela%v vs. absolut kvan%fisering? Kategorisering av kon%nuerlige variable? Gråsoner mellom kategorier? Antall GSTM1- genkopier Eks. kopitallsanalyse GSTM Sann%ds rela%v kvan%fisering Svarrapportering Konsentrasjoner? Kopier/μL Rela%ve mengder/endringer? Eks. prosentvis hemming Kategorier? 0, 1, 2 eller 3 genkopier Klinisk tolkning av svar? Gene expression RGE (%) = Exp C peak x 100 % Exp C 0 Time post- dose (h) Validering og kvalitetssikring Rapportering av måleusikkerhet?

8 Validering og kvalitetssikring Kon%nuerlig kvalitetskontroll Validering og kvalitetssikring Diskusjon: Hvordan validere metoden? Posi%ve kontroller Antall? Nivåer (genekspresjon/kopitall)? Stabilitet? Nega%ve kontroller Prosesseringskontroll RT nega%v kontroll PCR nega%v kontroll Ekstern kvalitetskontroll (SLP) Hvem %lbyr kvalitetskontrollprogram for kvan%ta%ve analyser? 29 MaTocks CJ et al., Validering Kvan%ta%ve analyser med kon%nuerlige verdier? Rik%ghet Gjenta målinger Bestemme avvik fra gjennomsnit/regresjonslinje Presisjon Repeterbarhet Intermediær presisjon Reproduserbarhet Linearitet, deteksjons og kvan%fiseringsgrenser Standardkurver Obs! Ikke beregne VK av Cq- verdier direkte Robusthet Holdbarhet og oppbevaring DNA- konsentrasjon LLOQ LOD cdna templates/reac%on (start) Bremer et al. 2007, Clin. Chem. Validering Kvan%ta%ve analyser med kategoriske verdier? Kategorisk test Kvan%ta%ve rådata grupperes i kategorier To nivåer av rik%ghet og presisjon Rådata Kategorisering Kon%nuerlig validering Nøyak%ghet: Sannsynlighet for at spesifikk verdi plasseres i bestemt kategori Kompe%%v hypotestes%ng, odds ra%o Evt. Se på regneark fra NGRL (Manchester) Cut- off ved 95 % KI Robusthet Holdbarhet og oppbevaring DNA- konsentrasjon MaTocks CJ et al.,

9 Hva ønsker/trenger vi? Veileder? Huskeliste? Validering/verifisering? Dataanalyse? Metodeutvikling? Svarrapportering? 33 9