Anvendelser av molekylærgenetiske målemetoder

Transkript

1 Anvendelser av molekylærgenetiske målemetoder Metodekurs i medisinsk biokjemi (O-26173) september 2012 Helge Rootwelt Avdeling for medisinsk biokjemi 1

2 Anvendelser av molekylærgenetiske målemetoder Praktiske eksempler i medisinsk biokjemi Utfordringer og feilkilder Kvalitetssikring og rasjonell drift Lovverk og etikk 2

3 α1-antitrypsinmangel Genotyping av Z- og S-variantene av α1-antitrypsin Z S RFLP (Restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme): PCR, restriksjonskutting, gelelektroforese Krav /indikasjon for å utføre analysen? Feilkilder? Alternativ utredning? 3

4 Indikasjoner? Kontraindikasjon? APOE-genotyping Hvem er ansvarlig for at rekvirering og informasjon til pasienten er i samsvar med bioteknologiloven? Hvorledes rapportere resultatet? Sensitive data og tilgang i labark/pasientjournal 4

5 Mutasjonsanalyse med hybridiseringsprober og smeltekurver på LightCycler 5 Smeltekurve (-d(f)/dt) Fluorescens (F)

6 Hemokromatose: HFE-genotyping for viktigste sekvensvariant: C282Y (LightCycler) Smeltekurve (-d(f)/dt) Fluorescens (F) Korrekt HGVS-nomenklatur: HGVS = Human Genome Variation Society NM_ :c.845G>A NP_ :p.C282Y 6

7 Hemokromatose-diagnostikk Hvilken plass har egentlig gentesting? Etiologi: Arvelige (primære) og ervervede (sekundære) årsaker Klinikk: Mange og til dels ukarakteristiske og diffuse symptomer Biokjemiske analyser: Transferrinmetning, ferritin, jern, ALAT Leverbiopsi? Genanalyser Mange ulike gen er involvert i jernomsetningen HFE, Transferrinreceptor-2, Hepcidin, Hemojuvelin, Ferroportin HFE hyppigst involvert ved arvelig hemokromatose hos nordeuropeere 90 % av hemokromatosepasientene er homozygote for C282Y-varianten (dvs c.845g>a:-), men penetransen av C282Y-varianten er lav: Hvorfor oppgir noen penetrans 2 % mens andre 50 %? Kan C282Y være diagnostisk for hemokromatose? Utelukker mangel av C282Y at pasienten har hemokromatose? noen er sammensatt heterozygote for C282Y og H63D, evt S65C HGMD Professional ( ): Ytterligere 45 sykdomsmutasjoner i HFE-genet 7

8 Villtypen mister laktaseaktiviteten etter småbarnsalderen Laktase-genotyping Melkekyrhold gav seleksjon for sekvensvarianter som opprettholder laktaseproduksjon også hos ungdom og voksne Sekvensvarianter i enhancerområdet oppstrøms for LCT-genet (i intron 13 av MCM6-genet) avgjør ekspresjonen relatert til LCT-genet: c c>t intron 13 av MCM6-genet: NM_ :c C>T 8

9 Diagnostiske utfordringer Tarmbiopsi Komplisert og ubehagelig Laktase-genotyping Funksjonelle tester Tidkrevende og noe ubehagelig Mange falske positive og negative Gentester Enkle, men identifiseres alle relevante genotyper? Sekvensering Sanntids PCR +/- prober +/- smeltekurver 9

10 LCT-genotyping m /LightCycler / FRET-prober Sekvensvarianter påvist med probebasert smeltekurveanalyse C>G T/T C>G & T>G C/T T>G C/C Problemprøver og kontroller fra Solve Tjora, Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Aker (Analysert på Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet) 10

11 Sekvensvarianter påvist med High Resolution Melting (HRM) LightCycler / ResoLight: LCT-genotyping c c>g c t>g c c/t c c>g c t>g c t/t c c/c Problemprøver og kontroller fra Solve Tjora, Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Aker HRM pilotforsøk ved Sara Bremer, Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet 11

12 Flere påviste sekvensvarianter i LCT-genet Sekvensvarianter som så langt er funnet med vår rutinemetode på LightCycleren: c a>g c c>g c c>t c t>c c t>g c g>a 12

13 Hva representerer dette? 13

14 Matrixeffekter påvirker smeltekurven Effekten av DNA-ekstraksjon Hva representerer dette? DNA ekstrahert av oss DNA ekstrahert av Equalis 14

15 Farmakogenetikk Legemiddel A B C D E Legemiddelomsettende enzym CYPnX CYPnY Andre enzymer Effekt (N=Normal) N N N 15

16 Farmakogenetikk Legemiddel A B C D E Legemiddelomsettende enzym CYPnX CYPnY Andre enzymer Effekt N N N Ett medikament (C) Flere enzymer (CYPnX, CYPnY,.) 16

17 Farmakogenetikk Legemiddel A B C D E Legemiddelomsettende enzym CYPnX CYPnY Andre enzymer Effekt N N N Ett enzym (CYPnX) Flere medikamenter (B, C,.) 17

18 Legemiddel Legemiddelomsettende enzym Farmakogenetikk Metoprolol, Amitriptylin, CYP2D6*1/*1 Kodein (inaktivt prodrug) Metaboliseres til inaktive metabolitter Aktiveres til morfin Effekt N N 18

19 Legemiddel Farmakogenetikk Metoprolol, Amitriptylin, Kodein (inaktivt prodrug) Legemiddelomsettende enzym CYP2D6*4/*5 (inaktivt enzym) Metaboliseres til inaktive metabolitter Aktiveres til morfin Effekt 19

20 Legemiddel Farmakogenetikk Metoprolol, Amitriptylin, Kodein (inaktivt prodrug) Legemiddelomsettende enzym CYP2D6 multiplikasjon el. aktiverende sekvensvariant (økt aktivitet) Metaboliseres raskere/kraftigere til inaktive metabolitter Aktiveres raskere/kraftigere til morfin Effekt 20

21 Farmakogenetikk Legemiddel A B C D E Legemiddelomsettende enzym CYPnX CYPnY Andre enzymer Indusere Hemmere Effekt N?? I tillegg til genetiske varianter som påvirker enzymaktiviteten, finnes det en lang rekke medikamenter og andre stoffer som fungerer som indusere eller hemmere av de legemiddelomsettende enzymene 21

22 Eksempel på virkningen av indusere og hemmere på legemiddeleffekt Legemiddel Legemiddelomsettende enzym Takrolimus Cyp3A4&5 inaktiverer Tacrolimus P-gp pumper ut og eliminerer Grapefrukt; Voriconazol + dosebehov: ~10-20% Rifampicin dosebehov ~500% Effekt? 22

23 Manglende genotype-fenotype-korrelasjon er vanlig! Monogene sykdommer Søsken med samme monogene sykdom kan ha svært forskjellig klinisk symptomatologi og forløp, fordi: Andre gen kan interagere Miljøfaktorer er viktige effekter der og da (f. eks: Faste kan utløse en metabolsk krise) epigenetikk (f. eks: Faktorer i svangerskapet kan prege barnet for livet) Alle kjemiske og fysiske prosesser i kroppen skjer i et miljø som er påvirket av summen av pasientens genetiske konstitusjon og tidligere og aktuelle miljøpåvirkninger Genotyping alene gir derfor sjelden eksakt prediktiv informasjon 23

24 PCR Fallgruver og forholdsregler Allel drop-out av ett allel kan gi tilsynelatende homozygoti for det andre allelet Sekvensvariant under PCR-primer Redusert/manglende amplifikasjon Sekvensvariant under probe Manglende deteksjon ved endepunktsanalyse der proben ikke har hybridisert tilstrekkelig (TaqMan) Prøvemateriale med svært lite templat Tilfeldig variasjon i mengden av de to allelene 24

25 Allel drop-out av ett allel kan gi tilsynelatende homozygoti for det andre allelet Sekvensvariant under PCR-primer i det ene allelet kan gi manglende amplifikasjon av dette allelet A. Sjekk databaser MMACHC og unngå områder med sekvensvarianter når du designer primere B. Ha primer for alle sekvensvarianter under primerne C. Gjør to PCR-reaksjoner med hvert sitt sett med primere som ikke overlapper D. Mindre strenge PCR-betingelser for å tåle en sekvensvariant under primer? 25

26 Allele drop-out / Hemokromatose Under normale (ideelle) betingelser, er de tre genotypene bestemt av allelfrekvensene i hht Hardy-Weinberg equilibrium: p 2 + 2pq + q 2 = 1 Feder s originale publikasjon identifiserte HFE-genet som viktigste årsak til arvelig hemokromatose (Nat Genet 1996 Aug;13(4): ) Det var SNV under forward primer (TGGCAAGGGTAAACAGATCC): rs (gj.sn. heterozygositet: 0,16) SNV under reverse primer (CTCAGGCACTCCTCTCAACC): rs (gj.sn. heterozygositet: 0,11) Feder påviste lav frekvens av heterozygote hos pasientene og brukte det som mål på at de jo var syke og derfor hadde høy forekomst av homozygote for det syke allelet. Han oppgav ikke H-W-beregning for kontrollpopulasjonen. Mange har senere sagt at den lave andelen heterozygote også kunne forklares ved allel drop-out. Viktig: Lag gode metoder slik at du påviser korrekte genotyper! 26

27 Allel drop-out av ett allel kan gi tilsynelatende homozygoti for det andre allelet Sekvensvariant under probe Endepunktsanalyse der proben ikke hybridiserer kan gi manglende deteksjon av det aktuelle allelet (TaqMan) Homozygot Heterozygot Uten DNA Homozygot 27

28 Allel drop-out av ett allel kan gi tilsynelatende homozygoti for det andre allelet Sekvensvariant under probe Endepunktsanalyse der proben ikke hybridiserer kan gi manglende deteksjon av det aktuelle allelet (TaqMan) Homozygot Heterozygot Uten DNA Homozygot? 28

29 Allel drop-out ved lite prøvemateriale Prøvemateriale med lite templat kan gi færre kopier av det ene allelet pga tilfeldigheter i fordelingen, og etter cycler er PCR-produktet fra dette allelet utkonkurrert. (PCR av plasma etc) Unngå reaksjoner med lite utgangsmateriale eller lav konsentrasjon (1 µl blod 50 ng gdna genomekvivalenter = >>nok) Analyser replikater dersom det er lite utgangsmateriale, og sjekk at du får samme resultat i alle prøver. OBS: Samme resultat betyr likevel ikke at det er korrekt! Lite prøvemateriale gjør analysen svært sårbar for minimale forurensninger med annet DNA som da kan bli dominerende. 29

30 Resultater fra TaqMan-genotyping i et forskningsprosjekt Hva er rart her? Hva kan det skyldes? 30

31 Allel drop-in Feil i TaqMan-assayet: Begge probene binder seg selv om pasientene ikke er heterozygote! NEIL1 Asp252Asn : G er hyppigst (allelfrekvens 0,995). Proben for A binder seg selv om det ikke er A i prøven. XRCC1 Lys298Asn : T er hyppigst (allelfrekvens 0,999) Proben for G binder seg selv om det ikke er G i prøven 31

32 Typisk resultat ved genotyping for laktaseintoleranse: c c>t 32

33 Typisk resultat ved genotyping for laktaseintoleranse: c c>t Så gikk vi tom for prober og bestilte en ny forsendelse av identiske prober, og da fikk vi følgende smeltekurver Hva ser vi? Hva i all verden kan dette skyldes? 33

34 Intakt probe med 3 fosfatblokk: Proben ikke kan forlenges LC640-TGTAGCCCCTGGCCTCAAAG-fosfat..gataatgtagTccctggcctcaaaggaactctc....ctattacatcAgggaccggagtttccttgagag.. Probe uten tilstrekelig fosfatblokk: Proben fungerer som primer og introduserer C i posisjon c LC640-TGTAGCCCCTGGCCTCAAAG-fosfat..gataatgtagTccctggcctcaaaggaactctc....ctattacatcAgggaccggagtttccttgagag.. 34

35 Resultat TPMT-genotyping TPMT = TioPurinMetylTransferase? TPMT*3B LC480 software TPMT*1/*1 MEN, liten topp for *3B og *3C *3B *1? TPMT*3C *1 *3C Lysbilde, kasuistikk og problemstilling: Sara Bremer Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet 35

36 Resultat TPMT-genotyping? TPMT*3B LC480 software TPMT*1/*1 MEN, liten topp for *3B og *3C Kontaminasjon? Nei, ny DNA-isolering + PCR identisk resultat *3B *1 (Mikro)kimerisme? Graviditet? Blodtransfusjon? Transplantasjon?? TPMT*3C Kontakter rekvirenten *1 *3C Lysbilde, kasuistikk og problemstilling: Sara Bremer Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet 36

37 Resultat TPMT-genotyping? TPMT*3B Pasienten Ikke transplantert Har vært gravid Får gjentatte blodtransfusjoner *3B *1 Svarrapportering Både *1 og *3A-alleler, men usikkert svar Anbefaler Monitorere 6-TGN- og Me-MP Ny prøve for genotyping? TPMT*3C *1 *3C Lysbilde, kasuistikk og problemstilling: Sara Bremer Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet 37

38 Resultat TPMT-genotyping *1/*3B TPMT*3B Ny TPMT-genotyping Tydelig topp for *3B og *3C Resultat: TPMT*1/*3A *3B *1 Forklaring: Kimerisme Donorleukocytter fra blodtransfusjon dominerte over pasientens leukocytter pga: -fåegne leukocytter -proliferasjon av donorleukocytter/stamceller Krav til blodtransfusjon: < leukocytter/450 ml (Leukocyttfiltrering fjerner 99.9%) *1 *1/*3C *3C TPMT*3C Lysbilde, kasuistikk og problemstilling: Sara Bremer Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS-Rikshospitalet 38

39 Hvilke feil gjøres ved gentesting? Manglende tillatelse til å utføre analysen Prøveforbytning Feil prøvemateriale DNA: Pas. er mosaikk; transplantert RNA: Feil vev (vevsspesifikk ekspresjon) Teknisk feil Kontaminasjon med PCR-produkt (eller annet materiale) Feil på utstyr eller software eller på reagenser Menneskelig feil Lage et assay som ikke fungerer etter hensikten Forbytte reagenser: Tror man analyserer en annen mutasjon Feiltolker kurver/resultater Feilrapporterer Mottaker misforstår resultatet Uklare/vanskelige formuleringer Manglende påvisning av mutasjon er ikke identisk med normal genotype! Genotype bestemmer ikke nødvendigvis fenotype 39

40 Hvilke feil gjøres ved gentesting? Manglende tillatelse til å utføre analysen Prøveforbytning Feil prøvemateriale DNA: Pas. er mosaikk; transplantert RNA: Feil vev (vevsspesifikk ekspresjon) Teknisk feil Kontaminasjon med PCR-produkt (eller annet materiale) Feil på utstyr eller software eller på reagenser Menneskelig feil Lage et assay som ikke fungerer etter hensikten Forbytte reagenser: Tror man analyserer en annen mutasjon Feiltolker kurver/resultater Bruk hodet Feilrapporterer Mottaker misforstår resultatet og positive og negative kontroller Uklare/vanskelige formuleringer Manglende påvisning av mutasjon er ikke identisk med normal genotype! Genotype bestemmer ikke nødvendigvis fenotype - og ikke stol blindt på resultatet du får 40

41 Kvalitetssikring Trend: (krav om) akkreditering (Standard 15189) Omfattende dokumentasjon kreves nå også for publisering Valideringsstandard fra EuroGentest eller CLSI* Omfattende krav men fornuftig når først etablerer system for det EuroGentest ledende på verdensbasis ( Validering av ny metode eller Verifisering av etablert metode Sammenlikning med gullstandard/annen metode/annen lab Ekstern kvalitetskontroll FDA : Laboratory-developed tests that have not been properly validated put patients at risk, such as for missed diagnosis, wrong diagnosis, and failure to receive appropriate treatment CE-merking av egne reagenser Bruk referansesekvenser ( og internasjonalt anbefalt nomenklatur ( *Clinical and Laboratory Standards Institute ( 41

42 Automasjon Kvalitetssikring De fleste feil innenfor molekylærdiagnostikk er menneskelige, derfor. mest mulig automasjon vha. software og instrumenter, jfr øvrige analyser på laboratoriet Elektronisk rekvirering el. skanning av papirrekvisisjon med semielektronisk rekvirering Barkodeavlesning av prøverørsetikett styrer nukleinsyreekstraksjon på robot Elektronisk sporing av ekstraherte prøver på barkodede brett Robotisert pipettering av PCR-reagenser og PCR-oppsett Automatisert genotyping av DNA eller kvantifisering av RNA Automatisert svarrapportering av resultater som er innenfor predefinerte grenser 42

43 Øvelse gjør mester(?) Kvalitetssikring Funksjonsfordeling, sentralisering og evt. kjøp av produkter og tjenester der det er mest fornuftig. Norsk portal for medisinsk-genetiske analyser 43

44 Rasjonell drift Validerte metoder, automasjon og funksjonsfordeling sikrer ikke bare kvalitet men også kostnadseffektivitet. 44

45 Lovverk og etikk Bioteknologiloven (Lov om humanmedisinsk bruk av bioteknologi m.m.) (Fra Loven er under pågående evaluering) Forrang fremfor Helseforskningsloven OBS: Gjelder helsevesenet og ikke forbrukertjenester (DTC-testing)!!! Undersøkelser for å stille sykdomsdiagnose krever ikke særskilt informasjon eller samtykke. For bærerdiagnostikk og prediktiv og presymptomatisk testing kreves genetisk veiledning før, under og etter undersøkelsen, samt skriftlig samtykke. Slike undersøkelser skal ikke utføres på barn under 16 år med mindre undersøkelsen kan påvise forhold som ved behandling kan forhindre eller redusere helseskade hos barnet. (Foreldre mottar veiledning og samtykker. Barn år skal involveres) Dette ansvaret er pålagt rekvirenten. Resultater av genetiske tester er pasientens eiendom og skal ikke informeres til forsikringsselskap, arbeidsgiver e.l. 45

46 Patients, doctors, and geneticists are about to hit by a tsunami of genome sequence data Physicians will have a vast amount of genomic data at their fingertips to help them diagnose and treat patients. We need to start thinking hard and soon about how we can deal with that information 46

47 Noen nyttige hjemmesider for molekylærgenetikk Norsk portal for medisinsk-genetiske analyser: Startside for de fleste oppslag og søk på gen- og sykdomsnivå: Oversikt over laboratorier og sykdommer: Anbefalt nomenklatur og nummerering for DNA, RNA og proteiner: Retningslinjer for laboratoriepraksis vedr. gendiagnostikk: Program for a sjekke for kjente sekvensvarianter under primere og i PCR-produkt for øvrig: Diverse gratisprogrammer for molekylærbiologi: 47