Molekylære metoder i medisinsk mikrobiologi.

Transkript

1 - 1 - Molekylære metoder i medisinsk mikrobiologi. Laboratorieøvelser tirsdag 17.mars. Øvelser: 1. Ekstraksjon av nukleinsyrer ved varmelysering (S. aureus) 2. DNA-isolering med Qiagen kolonne (to prøver: stafylokokk og en gruppe B streptokokk). 3. Konvensjonell PCR for påvisning av meca og nuc. 4. Realtime PCR med Evagreen-mastermiks for påvisninig av ETEC Øvelse 1: Varmelysering En S. aureus til MRSA-undersøkelse spredd på blodagar er utgangspunktet (renspredning fra en koloni) 200 µl MBG-vann tilsettes et 1,5 ml eppendorf rør 3-4 kolonier fra renspredning på blodagar tilsettes røret med bakterieøse Sett røret på varmeblokk med risting på 95 ºC i 15 min. Sentrifuger eppendorf rørene ved rpm i 2 min. Overfør 100 µl av supernatanten til et nytt eppendorfrør (unngå bunnfallet) Prøven fortynnes deretter 1:10 (5 µl lysat + 45 µl vann) og videre til 1:100 (5 µl av 1:10 fort.+ 45 µl vann) til PCR. (Benyttes videre i øvelse 3). Merk rør. Øvelse 2: DNA-isolering ved Qiagen kolonne Hver gruppe mottar 2 prøver ferdig enzym- og varmebehandlet som beskrevet på side 5. Prøve 1 (GBS) skal etter DNA isolering med qiagen kolonne benyttes videre i øvelse 7 (real-time Taqman PCR i morgen). Prøve 2a eller 2b (to ulike stafylokokker, halvparten av gruppene får den ene og den andre halvparten får den andre prøven). Denne prøven skal etter DNA isolering med qiagen kolonne benyttes videre i øvelse 3 (konvensjonell PCR for påvisning av MecA og Nuc i dag).

2 - 2 - Prosedyren som følger med reagenspakken til Qiagen kolonnen følges. Start på punkt fire i prosedyren. I punkt 7 skal det elueres i 100 µl i stedet for 200 µl AE buffer. Punkt 8 ikke nødvendig å utføre fordi vi skal ha rikelig med DNA i prøven. Etter ekstraksjon skal prøve 1 oppbevares i kjøleskap til i morgen. Prøven merkes godt med gruppenavn. Denne skal benyttes til real-time PCR for GBS (øvelse 7).

3 - 3 - Øvelse 3: Konvensjonell PCR for påvisning av meca og nuc PCR instrument: Bio-Rad T100 Thermal cycler Prinsipp: Konvensjonell PCR med påfølgende gelelektroforese av PCR produkt. Metoden vil påvise genene meca og nuc PCR produkt størrelse: meca 533 bp nuc 279 bp Reaksjonsmiks til 6 prøver UTEN polymerase blir utlevert og inneholder: Reaksjonsmiks pr. prøve: 5,0µl dntp (1mM) 2,0µl meca sense (10 µm) 2,0µl meca antisense (10 µm) 2,0µl nuc sense (10 µm) 2,0µl nuc antisense (10 µm) 5,0µl 10 PCR bufferi m/15mm MgCl 29,5µl MBG-vann Fremgangsmåte 3 µl AmpliTaq Gold (polymerase) tilsettes reaksjonsmiksen utdelt. Bland godt! Merk 5 PCR rør med nr. og gruppenavn Fordel 48µl reaksjonsmix til hvert PCR-rør Tilsett deretter 2 µl prøve pr. PCR rør og bland. Oppsett som beskrevet under: PCR oppsett: 1. 1:10 fortynning av varmelysert S. aureus 2. 1:100 fortynning av varmelysert S. aureus 3. Prøve 2a eller 2b fra DNA isolering Qiagen kolonne 4. Negativ kontroll (dh 2 O) 5. Positive kontroll (CCUG 60578) Rørene settes over i PCR-maskin PCR program C i 15 min (aktivering av amplitaq Gold) C i 20 sek C i 20 sek C i 15 sek Trinn 2-4 repeteres totalt 35 cykler C i 7 min (ekstra elongering) 6. 4 C

4 - 4 - Øvelse 4: Realtime PCR med Evagreen-mastermiks for påvisning av ETEC PCR instrument: CFX 96 Prinsipp: Realtime PCR med Evagreen -mastermiks med smeltepunktsanalyse. Genene LT (varme-labilt enterotoksin) og STh/STp (varme-stabilt enterotoksin) påvises. Smeltetemperaturer: Sth/p smeltepunkt 75,5 C ± 1 Lt smeltepunkt 80,5 C ± 0,5 PCR-produkt: Varmelabilt enterotoksin LT: 273 bp Varmestabilt enterotoksin STp: 166 bp Varmestabilt enterotoksin STh: 120 bp Hver gruppe får utdelt ETEC reaksjonsmiks til 5 prøver, positiv kontroll og en av prøvene 3a, 3b eller 3c. Reaksjonsmiksen inneholder: Reaksjonsmiks pr. prøve: 10 µl SsoFast EvaGreen Supermix 1 µl Lt sense (6 µm) 1 µl Lt antisense (6 µm) 1 µl STp sense (6 µm) 1 µl STp antisense (6 µm) 1µl STh sense (6 µm) 1 µl STh antisense (6 µm) 2 µl MBG-vann Fremgangsmåte Fordel 18 µl reaksjonsmiks pr. prøve i PCR-strips. Tilsettes 2 µl templat og bland. Oppsett som beskrevet under. Sett på lokk (strimmel) ved hjelp av egnet verktøy. Ikke ta på den del av lokket som dekker prøver. Fluorescensavlesning i PCR maskin skjer gjennom lokket. Merk strips med gruppenavn helt på enden. Oppsett av prøver: 1. Prøve 3a, 3b eller 3c ufortynnet 2. Prøve 3a, 3b eller 3c 1:10 fortynnet 3. Negativ kontroll (MBG-vann) 4. Positiv kontroll (CCUG 38079) PCR-program C i 2 min C i 2 sek C i 5 sek Trinn 2-3 repeteres totalt 40 cykler. Smeltepunktsanalyse: 65 C til 90 C med økning på 0,2 C pr. 10 sek.

5 - 5 - Behandling utført på forhånd med prøver som skal ekstraheres på Qiagen Spinkolonne 1. En koloni bakterier slemmes opp i 200 µl TE-buffer. Stapfylokokker: tilsettes 20 µl Proteinase K og 10 µl Lysostahin Gruppe B streptokokker: tilsettes 15 µl Lysozyme, 5 µl Proteinase K og 5 µl Mutanolysin. 2. Inkuber 15 min. ved 37 ºC 3. Inkuber 15 min. ved 65 ºC