Genotyping ved bruk av Loop-mediert Isotermal DNA-amplifisering (LAMP)

Transkript

1 Genotyping ved bruk av Loop-mediert Isotermal DNA-amplifisering (LAMP) Hundhausen, T.; Hulsbeek, M.; Avreid, T.; Heggøy, M.; Lacsamana, N.; Tednes, U.; Slettan, A.

2 Genotyping is the process of determining differences in the genetic make-up (genotype) of an individual by examining the individual's DNA sequence. reveals the alleles an individual has inherited (Wikipedia, acc ) Polymerase-Chain- Reaction (PCR) Kary B. Mullis

3 Loop-mediert isotermal DNA-amplifisering (LAMP) - lavere teknologiterskel for brukere - PCR DNA-isolering nødvendig Som regel LAMP et al. Fortrinnsvis Amplifisering Termocycler Varmeblokk/(Vannbad) Isotermal nei ja Tid til deteksjon (1-) min min Deteksjonsmetode Mange alternativer Mange alternativer, bl.a. visuell (dagslys) Brukervennlighet Middels Potensiell høy Kostnader Middels-høye krav til utstyr og kompetanse Lave-middels krav til utstyr og kompetanse

4 ASSURED-kriterier Verdens (WHO) helseorganisasjon PCR LAMP no (yes) yes/yes no yes no (yes/yes) yes yes (yes) (yes)/no (yes)

5 LAMP - amplifikasjon ved (kun) én temperatur Isotermal amplifikasjon, DNA-polymerase med strand-displacement, o C., min For flere detaljer henvises til poster og til

6 LAMP - endepunktanalyse og real-time-deteksjon Lang inkubasjon ( min.), vanskelig å skille svak positiv fra negativ. Rask (10-20 min.), sensitiv, real-time fluorometer/-turbidimeter kreves.

7 Hydroxynaftolblå og malachitgrønt som indikator min min. Endring i Mg2+ konsentasjon DNA-interkalerend

8 Hydroxynaftolblå og malachitgrønt som indikator min min. Malachitgrønt best kompromiss? Ingen utstyr, god analytisk sensitivitet og noenlunde raskt.

9 Genotyping av RHD og andre blodtyper hvorfor? Tvetydig serologi-resultat, f.eks. pga. genetiske varianter eller multitransfunderte pasienter, Genotyping av blodgivere, mange blodtyper parallelt, høy gjennomstrømning (tilgjengelig og raskt sml. med serologi) Prenatal noninvasiv Rhesus (RHD-) diagnostikk (foster-dna i mors blod), prenatal «RhD profylakse» for å hindre RhDimmunisering kun til RhD-neg. mødre med RhD-pos. foster Rhesus (RHD-) genotyping er for tiden aktuell

10 Genotyping av RHD RHD negativ RHD positiv Siden det finnes mange varianter av RHD-genet typer man gjerne 2 exoner (f.eks. 7+10) Etablert metode: Polymerase-Kjede-Reaksjon (PCR)

11 RHD-genotyping ved bruk av LAMP Mennesker med kjent RhD-fenotype ble genotypet vha. LAMP for RHD exon 7, med hydroxynaftolbå som indikator, 15 personer RHD exon 10, med malachitgrønt som indikator, 62 personer

12 Allelspesifikk LAMP RHD exon 7, krysstabell RhD pos RhD neg Total LAMP pos 10 (SP) 0 10 LAMP neg 0 (FN) 5 (SN) 5 Total Urenset DNA (Kinnslimhinne) RhD pos LAMP pos 2 (SP) 0 RhD neg LAMP neg 0 (FN) 2 (SN) Total 2 2 Bioingeniøren

13 Allelspesifikk LAMP RHD exon 10, testparametere RhD pos RhD neg Total LAMP pos 43 (SP) 1 (FP)* 44 LAMP neg 0 (FN) 18 (SN) 18 Total * Typet i 4 duplikater, 2x pos, 2x neg Diagnostisk nøyaktighet: 98 % [95 % KI: % ] Diagnostisk sensitivitet: 100 % [95 % KI: %] Diagnostisk spesifisitet: 95 % [95 % KI: %] Pos. sannsynlighetsratio: 19 [95 % KI: 3-128] Neg. sannsynlighetsratio: (0) [95 % KI: 0 0,08]

14 Allelspesifikk RHD-LAMP, analytisk sensitivitet Estimert analytisk sensitivitet for RHD-LAMP exon 7 RHD-DNA-mengde per ,6 1,9 Neg. ktr. reaksjon i pikogram (ingen DNA) Resultat pos. pos. pos. pos. pos. (pos.) neg. neg. Estimert analytisk sensitivitet for RHD-LAMP exon 10 RHD-DNA-mengde per reaksjon i pikogram 0 Resultat pos. pos. pos. pos. pos Neg. ktr. (ingen DNA) (pos.) neg. neg. En human cellekjerne inneholder ca. 6-7 pikogram DNA. Analytisk sensitivitet estimeres forsiktig til ca genomiske ekvivalenter, hhv RHD-kopier.

15 Loop-mediert Isotermal DNA-amplifisering (LAMP) Oppsummering og konklusjon Et isotermal, brukervennlig alternativ til PCR, f.eks. pasientnær analysering. I ferd med å etableres innenfor patogendiagnostikk. Allelspesifikk RHD-LAMP med god diagnostisk sensitivitet og spesifisitet. Analytisk sensitivitet av endepunkt RHD-LAMP per i dag underlegen sml. med real-time-pcr som kan detektere ned til 1-2 RHD kopier/reaksjon, men godt nok for de fleste bruksområder.

16 Loop-mediert Isotermal DNA-amplifisering (LAMP) Oppsummering og konklusjon Et isotermal, brukervennlig alternativ til PCR, f.eks. pasientnær analysering. I ferd med å etableres innenfor patogendiagnostikk. Allelspesifikk RHD-LAMP med god diagnostisk sensitivitet og spesifisitet. Analytisk sensitivitet av endepunkt RHD-LAMP per i dag underlegen sml. med real-time-pcr som kan detektere ned til 1-2 RHD kopier/reaksjon, men godt nok for de fleste bruksområder.