Når bruke immunoassays og når bruke LC-MSMS: Eksempler fra endokrinologi

Transkript

1 Når bruke immunoassays og når bruke LC-MSMS: Eksempler fra endokrinologi NKK-møtet 2015 Gardermoen, den 13. mars 2015 Jens P Berg Avdeling for medisinsk biokjemi Klinikk for diagnostikk og intervensjon Institutt for klinisk medisin, UiO og Oslo Universitetssykehus

2 Utvikling av immunoassays for hormoner Første radioimmunoassay i 1959 av Yalow og Berson Måling av insulin De første immunoassays basert på egenproduserte antisera Rensede proteinhormonpreparater fra NIH og WHO etablert som standarder for analysene Ulike antisera, kalibratorer og assay-betingelser førte til svært stor variasjon i resultater For 20 år siden varierte hcg-resultatene for ulike assays med mer enn 10x Nå er variasjonen <50 %

3 Elementer i et immunoassay De viktigste elementene i et immunoassay Antiserum/antistoffer Monoklonale antistoffer Kalibrator Tracer Mindre lot-til-lotvariasjon

4 Immunoassay En kvantitativ målemetode basert på reaksjonen mellom et antigen og ett eller flere spesifikke antistoffer Spesifisiteten avhenger av bindingen mellom antistoff og spesifikke antigene epitoper på antigenet To ulike typer immunoassays kompetitive non-kompetitive

5 Kompetitive assay Bindingsinhibisjons-assay Hormonet som måles konkurrerer med et radioaktivt merket hormon om binding til antiserum Brukes til måling av små hormoner Assay-sensitivitet øker ved redusert antiserumkonsentrasjon og lang inkubasjonstid Optimale betingelser krever timer til dagers inkubering Automatiserte analysatorer: Inkubering min Redusert kvalitet på analysene

6 Viktige forutsetninger for god kvalitet Optimalt assaydesign for lite immunogene molekyler som steroidhormoner Løsemiddelekstraksjon Kromatografi Strukturelt identiske tracere Manuelle, arbeids- og tidkrevende metoder begrenset til spesiallaboratorier Forenkling av metodene Ett-trinns reaksjoner Plattform-formater «Direkte» steroidhormonanalyser Riktighet og spesifisitet på bekostning av turn-around-tid og kostnader

7 Massevirkningslov + k a k d [antistoff-antigen] [antistoff] x [antigen] =k a (assosiasjonskonstant) Alt som kan forstyrre likevektsreaksjonen, kan påvirke kvantiteringen = matrikseffekter De fleste immunoassays går ikke lenger til likevekt Økt sårbarhet for matrikseffekter.

8 Direkte immunoassay for testosteron Metodespesifikk bias og analytisk nonspesifisitet for direkte T-analyser Lave T-konsentrasjoner Direkte T-immunoassays er inadekvate «Tilfeldig tall» Østradiolkonsentrasjon målt i pm minst like krevende som T-måling i nm

9 Måling av fri fraksjon Steroid/thyreoideahormoner bundet til bindeproteiner Biologisk aktivitet knyttet til den frie fraksjonen Hvordan binde fritt hormon til antistoff uten å ødelegge likevekten mellom hormonet og andre bindeproteiner i prøven?

10 Fordelingen av T4 i serum TTR 20% TBG 75% Alb 5% Fritt 0,03% 10

11 Fordelingen av T4 i serum Antistoffbasert måling av fritt T4 TTR 20% TBG 75% Alb 5% Fritt 0,03% 11

12 Ett-trinnsmetode for måling av ft4 TTR Alb TBG TBG

13 Signal Ett-trinnsmetode for måling av ft4 S-fT4

14 Immunometrisk (sandwich)-analyse Hormoner med MV > 3 kd Capture antibody (antiserum) festes til fast fase Binder til én epitop på hormonet Detektor-antistoff merket med radioisotop, enzym eller lignende binder en annen epitop Deteksjonsgrensen øker ved økende antistoffkonsentrasjoner Svært lave deteksjonsgrenser til tross for korte inkubasjonstider

15 Hormoners heterogenitet De fleste peptid- og proteinhormoner forekommer i ulike former i blodet Veksthormon 20 og 22 kd Intakt hcg og fri hcg-betakjede Intakt PTH og hormonelt inaktive trunkerte former Definere hvilke former som skal måles og bruke antistoffer som gjenkjenner relevante epitoper Genetiske polymorfismer Varianter av LH som ikke gjenkjennes av visse antistoffer

16 PTH ekstern kvalitetskontroll Labquality 2/2012 for OUS-Ullevål

17 hcg-standard Første standard etablert i 1939 Ekstrakt av urinproteiner fra gravide kvinner Verdi i enheter basert på biologisk aktivitet Senere standarder har blitt kalibrert i forhold til den foregående Arbitrære enheter har også blitt gitt til subenheter og fragmenter som mangler biologisk aktivitet 1 IU hcga eller hcgb tilsvarer 1 µg 1 µg hcg tilsvarer 9,3 IU Analyser som måler både hcg og hcgb rapporterer verdier i IU basert på hcg-standarden

18 Ulike former av hcg hcg alfa-subenhet Intakt hcg hcg beta-subenhet Nicked hcg beta-subenhet hcg beta-kjernefragment N-glykaner Birken et al. Clin Chem 2003;49: O-glykaner

19 Sammenligning av assays Prosentvis i forhold til intakt hcg Intakte hcg-assays hcgn hcgb hcgbn hcgbcf Sturgeon et al. Clin Chem 2009;55:

20 Sammenligning av assays Prosentvis i forhold til intakt hcg Intakt hcg og hcgb-assays hcgn hcgb hcgbn hcgbcf Sturgeon et al. Clin Chem 2009;55:

21 Sammenligning av assays Prosentvis i forhold til intakt hcg Intakt hcg, hcgb-og hcgbcf-assays hcgn hcgb hcgbn hcgbcf Sturgeon et al. Clin Chem 2009;55:

22 Etablering av beslutningsgrenser Harmonisering eller standardisering for å oppnå like resultater uavhengig av metode Standardisering Etablert «gullstandarder» i form av referansemateriale, referansemetoder og nettverk av referanselaboratorier Kvalitetskontroller med tillagt verdi (referanseverdi) Harmonisering Ingen «gullstandard» Forskjeller i resultater utjevnes ved faktorisering Kalibratorer Resultater Kvalitetskontroller skal gi samme nivå uavhengig av metode

23 Massespektrometri Tilgjengelige like lenge som immunoassays Siste 10-året utvikling av mindre massespektrometre med høy sensitivitet og spesifisitet som referansemetoder samt mulighet for analyse av mange analytter samtidig Benyttet i anti-dopingarbeid i flere 10-år

24 Referansemetoder Massespektrometri vanlig til referansemetoder for hormoner Med økende molekylvekt øker heterogeniteten Redusert mulighet til å standardisere analysen MS er foreløpig ikke et realistisk alternativ til proteinhormonbestemmelser

25 Krav til bruk av massespektrometri Foreløpig ikke kommet inn i retningslinjene for utredning av hormonsykdommer J Clin Endocrinol Metab krever at manuskripter som bruker kjønnshormonanalyser som viktige endepunkter, skal benytte MS-baserte assays I nær fremtid vil kravet også gjelde Binyrebarkhormoner Vitamin D

26 Oppsummering Bestemmelse av steroidhormonkonsentrasjoner er ikke tilfredsstillende med de fleste direkte automatiserte assays Disse bør erstattes med massespektrometriske metoder Det utvikles referansemetoder for peptid- og proteinhormoner Bruk av substanskonsentrasjoner for peptid- og proteinhormoner bør introduseres som en erstatning for internasjonale enheter basert på biologisk aktivitet