Erfaringer med LC/MS i kliniske studier

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "Erfaringer med LC/MS i kliniske studier"

Einar Engebretsen
7 år siden
Visninger:

1 Erfaringer med LC/MS i kliniske studier Katja B Prestø Elgstøen OUS Rikshospitalet 27 mai 2010

2 1. medfødte stoffskiftesykdommer 1. generelt om metodeutvikling og LCMS 2. eksempler på applikasjoner 3. sluttbemerkninger

3 Medfødt stoffskiftesykdom DNA RNA enz 1 enz 2 enz 3 enz 4 enz 5 A B C D E F X Y patologiske metabolitter

4 Laboratoriediagnostikk av medfødte stoffskiftesykdommer (IEM) På 3 nivåer: På metabolittnivå trenger ikke å vite hva vi ser etter På enzymnivå På DNA-nivå må vite hva vi ser etter Seksjon for biokjemisk genetikk (SBG), Avd. for medisinsk biokjemi ved OUS Rikshospitalet har landsfunksjon for laboratorieutredning av IEM. Vi utreder omkring 2000 pasienter årlig og diagnostiserer omkring 200 ulike sykdommer.

5 Metabolsk screening - multikomponentanalyse F A B C D E normal A B C D E F X Y patologisk Kan starte behandling basert på laboratoriefunn

6 Generelt ved bruk av eller utvikling av LC-MSMS metoder Tenk gjennom : hvorfor LC-MS? analyttens egenskaper samt konsentrasjon prøvematriks egenskaper dine egenskaper! Hva er du god på? mye prøveopparbeidelse vs mye kromatografi vs mye MSMS fancy analytisk kjemi ikke alltid like robust..

7 hvorfor LC-MS? molekylvekt electrospray LC-MSMS EI GC-MS Ikke-polar polar

8 hvorfor trippel quadrupol? ionekilde Q 1 Q2 Q3 detektor molekylion fragmention Q hvorfor MSMS: A-B-C-D A-C-B-D samme mw QQQ A-B C-D A-C B-D ulik fragmentering

9 molekylion LC-MS positiv ionisering typisk MH+ ved m/z mw +1 negativ ionisering typisk M at m/z mw -1 ADDUKTER Adduct ion Kilde m/z av adduct [M + COOH] - format M + 45 [M + CH3COO] - eddiksyre M + 59 [M + Cl] - klorinerte løsemiddel M + 35 [M + NH4] + ammonia M + 18 [M + Na] + Na-salter / glass M + 23 [M + K]+ K salter M + 39 [M + CH3CNH] + acetonitril M + 42 [M + CH3OHH] + metanol M + 33

10 Fragmentering Et molekyls fragmenteringsmønster er dets fingeravtrykk og er uavhengig av prøvematriks. Fragmenteringsmønster er vanskelig å prediktere. benyttes ofte i kvantitativ analyse, for eksempel MRM, precursor ion scan. O O CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 O C C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 kun fragment som bærer ladning detekteres NH 2 CH 2 -C CH 2 -CH 3

11 Utvikle en kvantitativ LC-MSMS metode 1. Q1 scan, finne molekylion 2. Product Ion Scan av referansestoff Q1 Q2 Q Intensitet (cps) M Finner fragmentene til molekylionet Q1 låst på molekylionet (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 skanner produktene Finner produktionet som gir høyest intensitet 40 m/z 110 Produktene av 180

12 3. Multiple Reaction Monitoring MRM Q1 Q2 Q Intensitet (cps) Q1 låst på molekylionet (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 låst på produktion Optimaliserer alle MSMS parametere. tid

13 Precursor Ion Scan Q1 Q2 Q Intensitet (cps) Finner hvilke molekylioner som gir ett bestemt fragment. Q1 scanner (precursor) Q2 = kollisjonscelle Q3 låst på ett produkt Brukes for klasse spesifikk analyse ( f.eks acylkarnitiner ) 100 m/z 250

14 Utvikle eller sette opp en LC-MSMS metode MSMS-metoden er nå klar, basert på rent referansestoff. Metoden skal fungere for reell prøve. Behov for prøveopparbeidelse? Hva vil vi bli kvitt? Behov for kromatografi? Finnes det interferenser som ikke lar seg fjerne med prøveopparbeidelse? Hvordan vet vi det? ser ingenting er det dannet adducter?

15 Eksempel på applikasjon A Kvantitering av acylcarnitiner i plasma : plasma + IS + acetonitril for felling av proteiner sentrifuger, avpippeter dampe inn til tørrhet derivatiserer til butylestere dampe inn til tørrhet ingen kromatografi direkte MSMS

16 Tandem MS, klassespesifikk analyse av acylcarnitiner CH 3 H O H 3 C N CH 2 C C CH 3 O O C O CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 CH 3 CH 3 C2 C3 C2D 3 IS C3D 3 IS isotopmerket internstandard CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH2 CH CH COOH m/z 85 C4 C5 C6 C7 C4D 3 IS C6D 3 IS

17 Multiple Reaction Monitoring av acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 acylcarnitine

18 MRM av acylcarnitiner

19 Hvorfor MRM? bedre sensitivitet, bruker ikke tid på å scanne uinteressante m/z enkelt å tolke, enkelt å behandle data Hvorfor ikke MRM? med MRM ser vi kun det vi har bedt om å få se (det man ikke ser kan man få vondt av!)

20 Precursor Ion Scan av acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 acylcarnitine

21 6.9e4 6.5e4 6.0e4 acylcarnitinprofil, precursors av 85 normal C2 IS C16 IS 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 C C C3 IS C4 IS C8 IS C12 IS e e4 C m/z, amu 431.4

22 1.4e5 acylcarnitinprofil, precursors av propionsyreemi 1.3e5 1.2e5 1.1e5 C3 1.0e5 9.0e4 C e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 C e4 2.0e4 C2 IS C3-IS C4 IS C8 IS C12 IS C16 IS 1.0e m/z, amu 459.6

23 Acylcarnitiner, oppsummert : Selektiviteten i MSMS-metoden for butylesterne er meget god. God kjennskap til interferenser. Kun proteinfelling derivatisering direkte MSMS uten kromatografi. MRM for kvantitering, Precursor Ion Scan for acylcarnitinprofil.

24 Hvorfor kromatografi? for å unngå interferenser fra andre stoffer med samme m/z for å minske ionesuppresjon og med det øke følsomheten.

25 kompleks prøve HPLC total ion chromatogram tid Q1 m/z MSMS Q Q m/z

26 Eksempel på applikasjon B Kvantitering av metylmalonsyre i plasma : plasma + IS fast fase ekstraksjon, sterk anionbytter dampe inn til tørrhet derivatiserer til butylestere dampe inn til tørrhet løs i mobilfase omvendt fase kromatografi positiv MSMS med MRM

27 LC-MSMS av plasma, MRM og metylmalonsyre IS ravsyre metylmalonsyre

28 Hvorfor fast fase ekstraksjon? gir grundigere opprensing av prøve enn proteinfelling og medfører at prøven som injiseres er mindre kompleks. bra for kromatografiske kolonner! økt levetid.

29 fast fase ekstraksjon 1. load 2. vask SAX prøve 4. opprenset prøve 3. eluer

30 Metylmalonsyre, oppsummert : Derivatisering gir god følsomhet, fast fase ekstraksjon gir meget robust analyse. Ravsyre har samme mw som metylmalonsyre og gir samme fragmentering (samme MRM). Må ha kromatografi. Fast fase ekstraksjon derivatisering omvendt fase kromatografi, positiv MRM for kvantitering.

31 Eksempel på applikasjon C LC-MSMS av puriner og pyrimidiner i urin puriner pyrimidiner thymine uracil

32 Kvantitering av puriner og pyrimidiner i urin : mål kreatinin med standard klinisk kjemi (nedbrytningsprodukt av kreatinfosfat i muskel) fortynn til kreatinin på 1 mmol/l og tilsett IS omvendt fase kromatografi (lang kolonne) gradient negativ MSMS med MRM Mobilfase A: 50mM eddiksyre ph4,0 Mobilfase B: 50mM ammonium format ph5,0/meoh/acn (2:1:1)

33 pyrimidiner : Metabolitt MW Produkt/Fragment-ion RT minutter Anvendt internstandard uracil 112,1 111/42 3,2 uracil IS uracil int.std. 114,1 113/43 3,2 thymin 126,1 125/42 4,4 thymin IS thymin int. std. 130,1 129/42 4,4 adenin 135,1 134/107 6,4 adenin IS adenin int.std. * Q1 136,1 135/108 6,4 hypoxantin * Q1 136,1 135/92 3,7 hypoxantin IS hypoxantin int.std. * Q1 138,1 137/93 3,7 xantin 152,1 151/108 3,8 xantin IS xantin int.std. 154,1 153/109 3,8 orotsyre 156,1 155/111 2,5 uracil IS N-carbamyl-β-alanin 132,1 131/88 2,6 N-carb.-β-alanin IS N-carb.-β-alanin int.std * Q1 138,1 137/89 2,6

34 puriner : Metabolitt *mw og MRM MW Produkt/Fragment-ion RT minutter Anvendt internstandard thymidin 242,2 287/241 5,9 thymin IS pseudouridin * MRM 244,1 289/243 2,7 uracil IS uridin * MRM 244,2 289/243 3,3 uracil IS deoxyadenosin 251,2 296/45 8,6 adenosin IS deoxyinosin 252,2 297/251 4,9 adenin IS deoxyguanosin * MRM 267,2 312/266 5,5 adenin IS adenosin * MRM 267,2 312/266 7,5 adenosin IS adenosin int.std. 268,2 313/267 7,5 inosin 268,2 267/135 4,1 adenin IS guanosin 283,2 328/282 4,4 adenosin IS

35 Puriner XIC of -MRM og (21 pairs): pyrimidiner 111.1/42.0 amu from i Sample urin 17 ( F*8) of wiff LC-MSMS negativ Max cps. ionisering. 1.10e4 1.00e Time, min

36 1.00e Time, min Time, min XIC of -MRM (21 pairs): 137.0/93.0 amu from Sample 17 ( F*8) of wiff e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 XIC of -MRM (21 pairs): 151.0/108.0 amu from Sample 17 ( F*8) of wiff Max cps. XIC of -MRM(21 pairs): 153.0/109.0 amu from Sample 17 ( F*8) of wiff Max. 1.1e4 cps. 1.6e e e e4 1.00e e e e e4 xantin xantin IS hypoxantin IS Time, min Time, min 5.22 ekstrahert 6.95 Max. 2.0e4 cps.

37 Puriner og pyrimidiner i urin, oppsummert : Urin langt enklere prøvematriks enn plasma kun fortynning nødvendig. Negativ ionisering gir god nok følsomhet i urin. Kromatografi nødvendig da flere stoffer har samme MRM Måler overgang fra format-adduct til molekylion for purinene. Mål kreatinin fortynn i hht kreatininverdi omvendt fase kromatografi med format i mobilfase - negativ MRM for kvantitering.

38 Sluttbemerkninger LC-MS generelt om prøvematriks : blod/plasma/serum : mye proteiner som må fjernes. Lav konsentrasjon av analytt. urin : høy ionestyrke som må reduseres. Høy konsentrasjon av analytt og interferenser. generelt om tubinger/kolonner osv: ha egne overganger/tubinger/kolonner for hver applikasjon hvis mulig. lag gode loggsystemer, spesielt hvis flere brukere. vurder helheten ved oppgradering/endring av metoder.

39 Sluttbemerkninger LC-MS om du setter opp en publisert metode : forstå din analysemetode, hva skjer ved hvert trinn og hvorfor. om du utvikler metoden selv : heller for omfattende enn for lettvint til du har grundig kunnskap og oversikt over interferenser. sjekk robusthet av metoden bruk eksterne kvalitetskontroller i tillegg til egne. en metode er aldri ferdig validert.

Like dokumenter

kvantitativ analyse ved bruk av istopfortynning eksempler på bruk av massespektrometri i rutinelaboratoriet

kvantitativ analyse ved bruk av istopfortynning eksempler på bruk av massespektrometri i rutinelaboratoriet Massespektrometri; et kraftfullt verktøy i medisinsk biokjemi i fremtiden Katja B Prestø Elgstøen Forsker II Seksjon for medfødte metabolske sykdommer Avd. medisinsk biokjemi OUS-Rikshospitalet kelgstoe@ous-hf.no