ANALYSEMETODER. Immunoassay

Transkript

1 ANALYSEMETODER Immunoassay ANALYSEPRINSIPP En immunoassay er en kvantitativ målemetode som baserer seg på reaksjonen mellom et antigen og ett eller flere spesifikke antistoffer. Metoden er følgelig avhengig av gjenkjennelsesreaksjonen mellom antistoff og de respektive determinante immunogene seter på antigenet. Analyser basert på immunoassayprinsippet kan deles inn i to hovedgrupper: Kompetitive assays (reagens underskuddsassays) og non-kompetitive assays (reagens overskuddsassays). Kompetitive assays De kompetitive assays benytter seg av at reaksjonen mellom antigenet (analytten) som skal kvantiteres, og det spesifikke antistoffet er reversibel. Metoden består i at en blanding bestående av en konstant mengde merket antigen og antistoff inkuberes, det siste i underskudd, og en variabel mengde umerket antigen til stede i standarder eller ukjent prøve. Under inkuberingen vil det da oppstå en "konkurranse" mellom merket og umerket antigen om det begrensede antall antistoff-bindingsseter. Bindingen av merket antigen til antistoff vil følgelig være omvendt proporsjonal med mengden umerket antigen til stede. Etter endt inkubering er det nødvendig å skille bundet og ubundet merket reagens (antigen) for at det såkalte responssignalet skal kunne måles. På grunnlag av det registrerte responssignalet (fritt eller bundet merket antigen) i de respektive standarder konstrueres en standardkurve, og på grunnlag av det registrerte responssignalet i de ukjente prøver, kan mengde antigen (analytt) beregnes. I prinsippet anvendes to forskjellige separasjonsprosedyrer. Den ene baserer seg på isolasjon av fritt merket antigen, mens den andre baserer seg på isolasjon av merket antigen-antistoff-kompleks. Av de to metodene er den siste mer "robust" enn den første. Årsaken til dette er at når fritt antigen isoleres (adsorberes), vil det dannede antigen-antistoff-kompleks begynne å dissosiere. Dersom separasjonstiden ikke er like lang for alle prøver, vil graden av dissosiasjon være forskjellig, særlig dersom dissosiasjonshastigheten er høy. De fleste moderne kompetitive immunoassays baserer seg derfor på isolasjon av merket antigen-antistoffkompleks, enten ved at primær-antistoff eller et sekundær-antistoff er bundet til en fast fase (for eksempel en brønn i en mikrotiterplate). I og med at det benyttes kun en epitop på Analytten og et antistoff, kan kompetitive immunoassays benyttes til bestemmelse av både små (tyroksin) og store (proteinhormoner) analytter. Non-kompetitive assays Når det gjelder de non-kompetitive immunoassays, baserer disse seg på at det benyttes to forskjellige antistoffer rettet mot to forskjellige epitoper på det antigenet (analytten) som skal kvantiteres. Det ene antistoffet er som regel immobilisert

2 (bundet til en fast fase), mens det andre er bærer av et eller annet egnet merkestoff, og fungerer derved som "merkelapp". De to anvendte antistoffene benyttes i overskudd, slik at all tilgjengelig analytt i de respektive inkubater bindes til det immobiliserte antistoffet under inkubering. Det merkede antistoffet vil også bindes til de samme analyttmolekyler, og mengden bundet merket antistoff vil derfor direkte gjenspeile mengden analytt til stede. På samme måte som ved de kompetitive assays, er det nødvendig å skille bundet og ubundet merket reagens (antistoff) etter endt inkubering for at responssignalet skal kunne registreres. Som nevnt vil de non-kompetitive assays nesten alltid operere med det ene antistoffet koblet til en fast fase, og kalles derfor ofte for "two-site immunometric sandwich" assays. I og med at det benyttes to eptioper på analytten og to antistoffer, kan denne type immunoassay bare benyttes til bestemmelse av anlytter som er store nok til å inneholde to uavhengige epitoper. Homogene immunoassays Kravet om stadig hurtigere analysesvar, sammen med behovet for forenklede analyser, har ført til en økende etterspørsel etter de såkalte "non-separation" assays. Dette er analyser der det ikke må skilles mellom fritt og bundet merket reagens for måling av responssignalet (homogene assays). Metoden er basert på at merkestoffets egenskaper er forskjellige i fri og bunden form. MERKESTOFFER De non-kompetitive metoder er langt mere sensitive og spesifikke enn de tidligere kompetitive assays. Dette skyldes i vesentlig grad anvendelsen av monoklonale antistoffer og innføringen av nye typer merkestoffer med langt høyere spesifikk aktivitet enn det man kunne oppnå ved merking med radioaktivitet. I de første kompetitive assays ble det utelukkende benyttet radioaktivitet som merkelapp. Etter hvert ble det også introdusert andre merkestoffer som f.eks. merking med enzym, og fluorescerende prober som fluorescin-isotiocyanat. Kravet om mer og mer sensitive immunometriske metoder, behovet for en økende grad av rasjonalisering, kravet om økt holdbarhet av merket reagens og strengere rutiner i forbindelse med kast og arbeid med radioaktive substanser har ført til en stadig søken etter nye merkestoffer og innføring av såkalte "black box " instrumenter. Nye merkestoffer som luminol og akridin-estere (chemiluminiscence), og lanthanidchelater (time-resolved fluorescense) har på grunn av dette sett dagens lys. BEREGNING AV RESULTATER Ved de fleste kompetitive og non-kompetitive assays må som nevnt merket fritt reagens separeres fra merket bundet reagens før måling av responssignalet (heterogene assays). Siden det i dag anvendes en rekke forskjellige merkestoffer med responssignaler basert på vesentlig forskjellige prinsipper, er bruk av spesielle

3 instrumenter til disse endepunktsmålinger i stadig større grad nødvendig. Uansett type måleinstrument er kravet i dag at utstyret er tilkoplet en datamaskin som både kan konstruere en standardkurve, beregne resultater, overføre svar til en "main frame" datamaskin og produsere relevante kvalitetskontrolldata. Til konstruksjon av standardkurven brukes det følgende tre metoder i forbindelse med denne funksjonen: Dataprogram som baserer seg på den teoretiske modellikning som gjelder for reaksjon mellom antigen og antistoff. Dataprogram som baserer seg på en matematisk empirisk kurvetilpasning. Program som baserer seg på forskjellige interpolasjonsteknikker. KVALITETSVURDERING Før Hormonlaboratoriet tar i bruk en ny immunoassaymetode, enten basert på egne reagenser (in-house-metode) eller på et kommersielt testkit, blir blant annet følgende kvalitetsparametere bestemt (metodevalidering): Metodens måleområde (dynamic range). Metodens spesifisitet, det vil si en undersøkelse over hvordan nær beslektede substanser påvirker analysen. Metodens deteksjonsgrense (analytisk sensitivitet), det vil si gjentatte målinger av prøver som ikke inneholder analytten som skal måles (nullprøver), og deretter bestemmelse av analyttkonsentrasjonen som gir en respons tilsvarende mean respons i nullprøven pluss 2,5 x standard avvik. Metodens kvantifiseringsgrense (funksjonell sensitivitet), det vil si bestemmelse av den laveste analyttkonsentrasjonen som gir en CV <20% bestemt ved hjelp av adderte dose-presisjonsprofiler, eller gjentatte målinger av de samme prøver i en rekke serier. Metodens nøyaktighet, det vil si i hvor stor grad metoden er i stand til å gi "sanne" verdier. Dette undersøkes enten ved å sammenlikne oppnådde analyseverdier med verdier målt ved en absolutt/referansemetode (f. eks. LC- MS/MS), eller ved å bestemme metodens bias ved å delta i et eksternt kvalitetsvurderingsprogram. ETABLERING AV REFERANSEOMRÅDER Etter at metodens kvalitetsparametere er bestemt, bør det i størst mulig grad etableres et referanseområde for følgende grupper: Friske ikke hospitaliserte, syke, barn, voksne, eldre, menn og kvinner. På Hormonlaboratoriet har ble følgende materialer brukt for å etablere områdene: Serum fra friske blodgivere, menn og kvinner Serum fra frivillige studenter/ansatte Serum fra hospitaliserte pasienter som lider av sykdommen Serum fra friske personer som er med i "andre" kliniske studier

4 Det benyttes også referanseområder som er bestemt av leverandøren av metoden eller fra publisert materiale. I slike tilfeller bekreftes referanseområdene med minst 20 prøver fra en av gruppene som nevnt ovenfor. KVALITETSSIKRING For å sikre høy kvalitet på de daglige rutineanalyser er det nødvendig å ha implementert et adekvat kvalitetssikringsprogram (QA). Et av elementene i forbindelse med kvalitetssikringen er anvendelsen av interne kvalitetskontroller (IQ). På Hormonlaboratoriet ble det laget egne interne kvalitetskontroller til dette bruk, basert på serum fra normale blodgivere. Kontroller på tre nivåer anvendes. Disse er laget ved hensiktsmessig blanding av serum fra forskjellige blodgivere og evt. "spiking" med rene hormonpreparater. Internkontroller medanalyseres i hver serie, og verdiene føres på et eget kontrollark (Shewart plot). Hormonlaboratoriet benytter et et spesielt EDB-program for resultatberegning og kvalitetskontroll (Multicalc fra Perkinelmer - Wallac Oy, Finland). Dette benyttes til alle de manuelle og for en del av de automatiserte metodene. Anvendelsen av internkontroller gjør det mulig kontinuerlig å følge metodenes reproduserbarhet. Alle laboratoriets akkrediterte metoder er med i et eksternt kvaltetssikringsprogram (EQAS). I slike program får laboratoriet tilsendt ukjente prøver som settes opp som en rutineprøve. Svaret sendes til EQAS leverandøren som sender ut rapporter som viser hvordan laboratoriets prøvesvar samsvarer med de andre deltagende laboratoriene og eventuelt, med en referansemetode (LC-MS/MS for steroidhormoner). FEILKILDER Som nevnt innledningsvis baserer en immunoassay seg på en reversibel reaksjon mellom et antigen (standard eller analytt) og ett eller flere mer eller mindre spesifikke antistoffer. Hovedprinsippet ved en immunoassay er å sammenlikne immunogenisiteten til analytten som ønskes å måle og en mer eller mindre vel definert standard. Alle substanser som kan påvirke bindingen mellom analytt og antistoffet, vil følgelig kunne gi opphav til "gale" resultater. Det er derfor vanlig med mye større usikkerhet i immunoassays enn i vanlige klinisk-kjemiske analyser hvor jo en egenskap av analytten bestemmes direkte. I tabellen under er det listet opp en del faktorer som kan føre til uriktige analysesvar ved benyttelse av analyser basert på immunoassay-prinsippet. Uspesifikt antistoff (gir opphav til kryssover) Spesifikt monoklonalt antistoff (kan overse isoformer) Ufullstendig separasjon av bundet og ubundet antigen Binding av merkelapp til annet enn spesifikt antistoff (uspesifikk binding, NSB) Substanser som kan påvirke responssignalet

5 Forskjellig matrix i standardprøver og pasientprøver Interferns i form av heterofile antistoffer eller revmatoid faktor i prøven Kromatografi GENERELT Kromatografiske metoder brukes ved Hormonlaboratoriet til analyse av adrenalin, noradrenalin og vanilinmandelsyre i urin, 25-hydroksy-vitamin D i serum, forskning (proteomikk, metabolomikk) og som referanse for immunologiske metoder. ANALYSEPRINSIPP 1 Kromatografi er en separasjonsmetode basert på to ikke blandbare faser. Den ene fasen er mobil og den andre stasjonær. En prøve blir injisert i den mobile fasen og transportert gjennom en kolonne langs den stasjonære fasen. De ulike stoffer fordeler seg mellom eller vekselvirker med de to fasene i forskjellig grad og separeres dermed. Vanlige kromatografimetoder er: Væskekromatografi (Liquid Chromatography, LC) o Den mobile fasen er en væske o Den stasjonære fasen er et fast stoff Gasskromatografi (GC) o Den mobile fasen er et gass o Den stasjonære fasen er en væske Ved Hormonlaboratoriet brukes LC som kromatografisk metode. Separasjonsprinsippet som er brukt er omvendt fase kromatografi, der den mobile fasen er polar, en vandig væske (vandig buffer, MeOH, acetonitril) og den stasjonære fasen er hydrofob (C 18, PFP). Separasjonen er basert på interaksjoner mellom analytt og stasjonærfase, og de viktigste interaksjonene er van der Waal krefter (svake hydrofobe krefter) som øker med størrelsen av analytten. I omvendt fase kromatografi har polare stoffer (stoffer med mange OH, NH3, =O grupper) minst retensjon, mens hydrofobe stoffer (stoffer med mange CH grupper) har høyest retensjon. LC instrumentene deles inn i HPLC (High Performance LC) og UHPLC (Ultra High Performance LC). Forskjellen er partikkelstørrelsen brukt i separasjonskolonnen. Typisk partikkelstørrelse i HPLC er 3,5-10µm, mens den er <2µm i UHPLC. Mindre partikler i kolonnen betyr høyere mottrykk, og et UHPLC system må derfor tåle trykk på opp til 1200 bar. Fordelen med UHPLC er raskere separasjon (< 5 min på UHPLC vs. > min på HPLC) og smalere topper, noe som fører til at det kan separeres

6 flere analytter per tidsenhet [2]. DETEKSJON 3 For å dra nytte av en kromatografisk separasjon må en detektor installeres ved slutten av separasjonskolonnen. Den skal gi et elektrisk signal når de forskjellige stoffer eluerer fra kolonnen. Dermed fåes en konsentrasjonsprofil (kromatogram) mot tiden. Følgende detektorer brukes ved Hormonlaboratoriet: UV (Ultra Violett absorpsjonsdetektor) o Detekterer komponenter som absorberer UV-lys. o Brukt til proteomikk/metabolomikk. Elektrokjemisk detektor o Detekterer komponenter som kan oksideres eller reduseres. o Brukt til katekolaminer (adrenalin, noradrenalin) og vanilinmandelsyre. MS (Massespektrometri) o Separasjon av ioner i gassfase basert på masse-ladningsforhold (m/z). o Brukt til 25-hydroksy-vitamin D og proteomikk/metabolomikk. For å kunne bruke MS, må analytten(e) ioniseres. De vanligste ioniseringsteknikkene for små eller mellomstore molekyler er: Elektrospray ionisering (ESI) Atmosfærisk trykk kjemisk ionisering (APCI) Atmosfærisk trykk foto ionisering (APPI) Alle ioniseringsteknikkene lager først og fremst intakte molekylioner. Videre fragmentering skjer i masseanalysatoren. ESI er den mest brukte ioniseringsteknikken og denne brukes også ved Hormonlaboratoriet. Eluenten fra LC systemet introduseres gjennom et kapillær i ionekilden, og et spray lages ved hjelp av nitrogengass og varme samtidig som det settes på en spenning. Ideelt skal analytten være ladet i mobilfasen, ellers skjer ladningsoverføring samtidig med dråpedannelsen i sprayen. Separasjon ev ionene skjer i masseanalysatoren, og her finnes det også flere typer å velge mellom: Kvadrupol (Q) eller trippel kvadrupol (QQQ) o Til små molekyler og targeted analysis. o QQQ typisk til rutine bruk kombinert med MRM på grunn av høy sensitivitet. Time-of-flight (TOF) o Til proteiner (på grunn av bedre masse oppløsning).

7 Ion-trap (IT) eller orbitrap (OT) o Til proteomikk/metabolomikk. o Bedre masse oppløsning og mulighet for å utføre MS/MS. Ved Hormonlaboratoriet brukes to typer masseanalysatorer: QQQ (rutine, 25- hydroksy-vitamin D) og orbitrap (proteomikk/metabolomikk). 1. Tyge Greibrokk, Elsa Lundanes, Knut E. Rasmussen, Kromatografi, Universitetsforlaget, Oslo, 1998, 3.utgave. 2. Naijun Wu, Andrew M. Clausen, Fundamentals and practical aspects of ultrahigh pressure liquid chromatography for fast separations, J. Sep. Sci. (2007), 30, Colin F. Poole, The essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2003, 1. utgave