Liv Hanne Bakke Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold. Hormonlaboratoriet Hva er steroidhormoner? Når analyseres steroidhormoner

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "Liv Hanne Bakke Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold. Hormonlaboratoriet Hva er steroidhormoner? Når analyseres steroidhormoner"

Håkon Nilssen
7 år siden
Visninger:

1 Liv Hanne Bakke Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold Hormonlaboratoriet Hva er steroidhormoner? Når analyseres steroidhormoner Hva er LC MS Fordeler og utfordringer med LC MS Våre metoder Prøveopparbeidelse Konklusjon 1

2 Hormonlaboratoriet Over analyser per år Rekvirenter flest eksterne ca. 20% internt i OUS Analyseteknikker stort sett immuno assay overført 6 analytter til LC MS/MS så langt Ca analyser av steroidhormoner Ca ønskes på sikt å overføres til LC MS Kolesterol, Mw=386,65 Pregnenolon, Mw=316,48 Progesterone, Mw=314,46 Deoxykortikosteron (DOC), (HSD3B2) CYP11A1 (STARD 1 og 20,22 desmolase, cholesterol side chain cleavage enzyme), hastighetsbestemmende 17αhydroxylase (CYP17A1) 21 hydroxylase (CYP21A2) 11β hydroxylase 2 (CYP11B2) Pregnenolon, Mw=316,48 Progesteron, 11 deoxykortisol (11 DEO), 11β β 2 11βhydroxylase 1 (CYP11B1) Steroidhormoner Dehydroepiandrosteron (DHEA), 17,20 Lyase (CYP17A1) 17,20 Lyase 18 OH Androstenedion, Mw=286,42 21 deoxykortisol (21 DEO), Kortisol, 21 17β HSD (HSD17B3) 17β HSD Aromatase (CYP19A1) 11β HSD 1 (HSD11B1) 11β HSD 2 (HSD11B2) 18β hydroxylase Androstenediol, Mw=290,44 Testosteron, Østron (Estron) Lever og placenta Kortison, Mw=360,44 17β HSD Aldosteron, Mw=360,44 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 Østriol 5αreduktase (SRD5A1) Aromatase Østradiol, Mw=272,38 Lever og placenta Hormonlaboratoriet

3 Analyseres ved Hormonlaboratoriet Pregnenolon, Mw=316,48 Steroidhormoner Dehydroepiandrosteron (DHEA), 17,20 Lyase (CYP17A1) Androstenedion, Mw=286,42 17β HSD Testosteron, Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 5αreduktase (SRD5A1) Progesterone, Mw=314,46 Deoxykortikosteron (DOC), 21 hydroxylase (CYP21A2) 11β hydroxylase 2 (CYP11B2) Progesteron, 11 deoxykortisol (11 DEO), 11β β 2 11βhydroxylase 1 (CYP11B1) 17,20 Lyase 18 OH 21 deoxykortisol (21 DEO), Kortisol, 21 11β HSD 1 (HSD11B1) 11β HSD 2 (HSD11B2) 18β hydroxylase Kortison, Mw=360,44 Aromatase Aldosteron, Mw=360,44 Østradiol, Mw=272,38 Hormonlaboratoriet 2016 LC MS = overført til LC MS fra IA = analyseres på LC MS, kun til internt bruk Pregnenolon, Mw=316,48 Progesteron, 11 deoxykortisol (11 DEO), Vanskelig! Dehydroepiandrosteron (DHEA), Deoxykortikosteron (DOC), 18 OH Androstenedion, Mw=286,42 21 deoxykortisol (21 DEO), Vanskelig! Kortisol, Testosteron, Kortison, Mw=360,44 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 Vanskelig! Østradiol, Mw=272,38 Vanskelig! Hormonlaboratoriet

4 Steroidhormoner Når analyseres steroidhormoner? Utrede enzymsvikt i binyrebarken Overproduksjon av kortisol Hypofysesvikt Hypertensjon Gonadesvikt Pubertetsutredning Infertilitet Polycystisk ovarie (PCO/PCOS) Kjønnsutredning Kreft/tumor Hva er LC MS? LC MS = Liquid Chromatography Mass Spectrometry Eller på norsk: Væske kromatografi masse spektrometri LC MS Mobilfase Kolonne Autoinjektor MS en Pumpe 4

5 Hva skjer i LC? En væske (mobilfasen) frakter prøven gjennom en kolonne komponentene i prøven har forskjellig interaksjon med materialet i kolonna (stasjonærfasen) Analytter som har lav interaksjon med stasjonærfasen eluerer ( kommer ut ) først Analytter som har høy interaksjon eluerer sist LC = separasjon av komponenter i en blanding separasjon t 0 t R 1 t R 2 t R 3 t R 4 tid (t) Kromatogram: hver komponent har en retensjonstid (t R ) Separasjon av analyer på d 5

6 The real world En topp i kromatografi inneholder ikke kun èn forbindelse Massespektrometri! Hva skjer i MS? 1) Analyttene blir ionisert ESI = Elektrospray ionisering Prøven sprayes ut av et kapillær inn i et høyspenningsfelt og positive eller negative ioner dannes 2) Ionene separeres etter masse/ladning (m/z) Kun molekylmassen til analytten når detektoren MS = separasjon av ioner i gassfase LC MS = separasjon i 2 dimensjoner, retensjonstid og molekylvekt 6

7 MS/MS = Tandem MS 2 MS eer hverandre MRM = multiple reaction monitoring Fjerner bakgrunn bedre sensitivitet Ser på karakterissk MRM overgang bedre selektivitet Fordeler med LC MSMS Mulig å analysere flere analytter samtidig Bruker lite prøvemateriale i forhold til immunoassay 300 µl serum gir svar på foreløpig totalt 10 analytter Selektivt sammenlignet med immunoassay har retensjonstid og MRM overgang for en analytt Fjerner bakgrunnsstøy bedre sensitivitet Kan inkludere hormoner som det ikke finnes immunoassay for Eksempel: 18 OH kortikosteron, 21 deoxykortisol 7

8 Utfordringer med LC MSMS Avansert instrument og analysemetode erfaring stor fordel Krevende metodeutvikling Kompetanse viktig Tidkrevende å lage og vedlikeholde egne metoder Multi analytt metoder Utfordrende å lage standarder/kontroller Tidkrevende databehandling før svarutgivelse Ved analyseproblemer Ingen andre med samme metode Kan være stor jobb med re validering «Binyre» 8,5 min pr prøve Multi analytt metode, får svar på mange analytter samtidig progesteron 11 deoxykortisol 21 deoxykortisol Deoxykortikosteron 18 OH kortikosteron Kortikosteron Kortisol Kortison 7 medikamenter Prednison Prednisolon Metylprednisolon Dexametason Betametason Fludrokortison Triamcinolon aldosteron 18 OHkortikosteron kortikosteron kortison 21 deoxykortisol kortisol prednisolon 11 deoxykortisol deoxykortikosteron 17 OHpregnenolon 21 OHpregnenolon progesteron DHT androsteron 8

9 «Androgener» 3,4 min pr prøve ca testosteron prøver pr år Testosteron Androstendion DHEA Androstendion Testosteron epi Testosteron Prøveopparbeidelse Ekstraksjon av analyen fra matriks frigjøring fra bindeprotein Fjerne interferenser lengre instrument levetid og mindre vedlikehold Oppkonsentrering forbedre deteksjonsgrense Ulike typer: Proteinfelling Væske væske ekstraksjon (LLE) Fastfase ekstraksjon (SPE) eller oe en kombinasjon av flere teknikker 9

10 x10 3 +ESI MRM Frag=380.0V CID@** ( > ) OH-kortikosteron 5.d Counts vs. Acquisition Time (min) Prøveopparbeidelse SLE: Supported Liquid Extraction Påsetting av prøven: prøven fordeles i små dråper på SLE materialet Eluering: løsningsmiddel som er ikke blandbart med vann. Hydrofobe analytter ekstraheres, interferenser blir igjen i materialet Prøveopparbeidelse 300 µl serum SLE med etylacetat Inndamping Reløsning i 100 µl Binyre Androgener 10

11 Konklusjon LC MS/MS blir mer og mer viktig ved analyse av steroidhormoner pga. spesifisiteten Kan få svar på mange analytter ut fra lite prøvemateriale og enkel prøveopparbeidelse Krever kompetanse og erfaring 11

Like dokumenter

Analyse av kjønns og stresshormoner

Analyse av kjønns og stresshormoner Sandra R. Dahl Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold Hormonlabortoriet Hva er kjønns og stresshormoner? Medisinsk bakgrunn for analyse av steroidhormoner