kvantitativ analyse ved bruk av istopfortynning eksempler på bruk av massespektrometri i rutinelaboratoriet

Transkript

1 Massespektrometri; et kraftfullt verktøy i medisinsk biokjemi i fremtiden Katja B Prestø Elgstøen Forsker II Seksjon for medfødte metabolske sykdommer Avd. medisinsk biokjemi OUS-Rikshospitalet kelgstoe@ous-hf.no

2

3 hva er massespektrometri (MS) kvantitativ analyse ved bruk av istopfortynning eksempler på bruk av massespektrometri i rutinelaboratoriet metabolomikk

4 Hva er et massespektrometer Et massespektrometer er et instrument som separerer ladede partikler (ioner) utfra deres masse/ladning (m/z) i gassfase. Massespektrometri gir informasjon om den kvalitative og kvantitative sammensetningen av både uorganiske og organiske analytter i komplekse prøver. gir informasjon om struktur (og dermed identifikasjon) av et stort antall komplekse molekyler gir informasjon om isotop-ratioer av atomer i en prøve. Begrensninger Kan kun analysere ioner - ionene må være i gassfase - destruktiv teknikk. Massespektrometri er i dag verdens raskest voksende analytiske teknikk.

5 Det periodiske system

6 Isotoper Variasjoner av et kjemisk element (grunnstoff) med forskjellig atommasse. Isotope former av et grunnstoff har samme antall protoner og elektroner, men forskjellig antall NØYTRONER. HYDROGEN DEUTERIUM

7 Isotopers nøyaktige atommasse

8 Det periodiske system Eksempel Cl (klor) I det periodiske system er Cl oppført med atommasse 35,453. Dette fordi det er en blanding av to isotoper med masse 35 (67,5%) og 37(32,5%). 35,453 er et vektet gjennomsnitt av de naturlig forekommende isotoper av grunnstoffet.

9 Bruk av isotoper (Identifisering av stoffer som inneholder grunnstoffer med karakteristisk isotop-profil). SOM INTERNSTANDARD FOR KVANTITATIV MS-ANALYSE. Bruker typisk C13, D, eller N15 analytt intern standard O O O O HO C C OH HO C C OH Mw 90 g/mol Mw 92 g/mol

10 INSTRUMENTERING (evt gel elektroforese) SEPARASJON I TID IONISERING MASSE SEPARASJON DETEKSJON massespektrometer

11 IONISERING Electrospray MS waste

12 Electrospray

13 MASSESEPARASJON skille ionene utfra deres masse/ladning. quadropol Vekselstrøm og radiofrekvens + likestrøm. Kun ioner med stabil bane gjennom quadrupolen når detektor. Mest brukte instrumenttype for LC-MSMS MASSEFILTER

14 MASSESEPARASJON skille ionene utfra deres masse/ladning. Time of Flight TOF Alle ionene akselereres til de oppnår samme kinetiske energi Hastigheten er da avhengig av masse/ladning. Mye raskere enn quadrupol mye høyere oppløsning får eksakt massetall.

15 Quadrupol summeformel TOF M/Z 83 C2HN3O 83,0120 C2H3N4 83,0359 C3HNO2 83,0007 C3H3H2O 83,0246 C3H5N3 83,0484 C4H3O2 83,0133 C4H5NO 83,0371 C4H7N2 83,0610 C5H7O 83,0497

16 TRIPPEL QUADRUPOL MSMS ionekilde Quadrupol 1 Quadrupol 2 Quadrupol 3 Detektor gir molekylion gir fragmention Q HVORFOR MSMS: A-B-C-D A-C-B-D Samme molekylvekt QQQ A-B C-D A-C B-D Ulik fragmentering

17 Mass spectrum of of 3-pyridylcarbinyl 6,9,12-octadecatrienoate

18 Eksempel på rutineapplikasjoner direkte MSMS-analyse

19 Medfødte metabolske sykdommer DNA RNA A B C D E F X Y patologiske metabolitter

20 Metabolsk screening - multikomponentanalyse F A B C D E normal A B C D E F X Y patologisk

21 Direkte MSMS analyse - acylcarnitiner CH 3 H O H 3 C N CH 2 C C carnitin O CH 3 OH S CoA O C CH 2 CH 2 R Aktivert fettsyre (Fatty Acyl CoA) CH 3 H O H 3 C N CH 2 C C Acylcarnitin O CH 3 O O C CH2 CH2 R b oksidasjon

22 MS/MS klasse spesifikk analyse, acylcarnitiner CH 3 H O H 3 C N CH 2 C C CH 3 O O CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 O C CH C2 207 C2D3 IS CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH C3 221 C3D3 IS 232 C4 235 C4D3 IS 246 C5 260 C6 263 C6D3 IS 274 C7 CH2 CH CH COOH 85

23 Klassespesifikk analyse, acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 Acylcarnitine

24 Precursor Ion Scan av acylkarnitiner normalprofil +Precursor (85.0): to min from Sample 8 (serum ktr.) of wiff Max. 6.9e4 cps. 6.9e4 6.5e4 6.0e4 C2 IS C16 IS e4 5.0e4 4.5e4 In te n s ity, c p s 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 C C C3 IS C4 IS C8 IS C12 IS e e m/z, amu 431.4

25 Precursor Ion Scan av acylkarnitiner propionsyreemi +Precursor (85.0): to min from Sample 8 ( Propsyreuri) of wiff Max. 1.4e5 cps. 1.4e e5 1.2e5 1.1e5 C3 In te n s ity, c p s 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 C e4 4.0e e4 2.0e C3-IS e m/z, amu

26 Multiple Reaction Monitoring MRM Q1 Q2 Q3 CH3-(CH2)3- O-(C=O)-(C=O)-O CH3-(CH2)3- O-(C=O)-(C=O)-O -CH2-CH2-CH2-CH3 CH3-(CH2)3- O-(C=O)-(C=O)-O -CH2-CH2-CH2-CH3 CH2-CH2-CH2-CH O O 57 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 O C C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 203

27 Multiple Reaction Monitoring av acylcarnitiner Q1 Q2 Q3 C2 260,6 85,0 C16-OH 472,4 85,0 acylcarnitine

28 MRM av acylcarnitiner

29 MRM Fordeler: Høy følsomhet Enkle resultater å tolke Ulempe: Vi ser kun det vi har programmert MS en til å se! MS eller LC-MS eller LC-MSMS-metode for.. Nesten alltid MRM

30 KROMATOGRAFI

31 revers fase (omvendt fase) væskekromatografi Mobilfasen består av vann og organisk løsemiddel (metanol, acetonitril) Den hydrofobe stasjonærfasen solvatiseres av løsemiddel og C18-armene reiser seg Analyttene har ulik løselighet i stasjonærfasen - ulik retensjon MOBILFASE 100mL 1mL/min STASJONÆRFASE

32

33

34

35

36 intensitet kromatogram mest vannløselig minst hydrofob mest polar minst vannløselig mest hydrofob minst polar tid

37 Kromatografisk separasjon fulgt av tandem masseskpektrometri LC-MSMS Kan det være nødvendig?

38 LC-MSMS av plasma, MRM og metylmalonsyre IS ravsyre metylmalonsyre Ravsyre og metylmalonsyre har samme MRM men kromatograferer forskjellig

39 Eksempel 2 Kvantitering av puriner og pyrimidiner i urin : mål kreatinin med standard klinisk kjemi fortynn til kreatinin 1 mmol/l og tilsett IS omvendt fase kromatografi (lang kolonne) gradient negativ MSMS med MRM

40 Puriner XIC of -MRM og (21 pairs): pyrimidiner 111.1/42.0 amu from i Sample urin 17 ( F*8) of wiff LC-MSMS negativ Max cps. ionisering. 1.10e4 1.00e In te n s ity, c p s Time, min

41 puriner : Metabolitt *mw og MRM MW Produkt/Fragment-ion RT minutter Anvendt internstandard thymidin 242,2 287/241 5,9 thymin IS pseudouridin * MRM 244,1 289/243 2,7 uracil IS uridin * MRM 244,2 289/243 3,3 uracil IS deoxyadenosin 251,2 296/45 8,6 adenosin IS deoxyinosin 252,2 297/251 4,9 adenin IS deoxyguanosin * MRM 267,2 312/266 5,5 adenin IS adenosin * MRM 267,2 312/266 7,5 adenosin IS adenosin int.std. 268,2 313/267 7,5 inosin 268,2 267/135 4,1 adenin IS guanosin 283,2 328/282 4,4 adenosin IS

42 mengde av produkt Måling av enzymaktivitet substrat enzym produkt substrat enzym 13C produkt produkt m/z

43 F A B C D E normal A B C D E F X Y patologisk

44 Metabolomikk

45 Metabolom - det totale settet av småmolekylære metabolitter i en biologisk prøve. Metabolomet gir opphav til en såkalt metabolsk profil. Metabolomikk - et systematisk studie av metabolske profiler i biologisk materiale. Metabolites Enzymes Genes Metabolomics Proteomics Genomics

46 Metabolske reaksjonsruter:

47 En medfødt stoffskiftesykdom innebærer alltid en endring i metabolomet Utvikle en robust LC-QTOF metode egnet for uselektert metabolomikkstudie av urin. Studere biokjemiske reaksjonsruter ved medfødte metabolske sykdommer Beskrive nye medfødte metabolske sykdommer.

48 60min separasjon mellom 4500 og 5000 ulike komponenter i urin separeres.

49 intensitet

50 Studere biokjemiske reaksjonsruter substrat enzym produkt enzym 13 C- substrat 13C - produkt

51 Jakte på metabolitter som er tilstede i 13C-prøven ved 1 amu høyere enn i kontrollprøven

52 Normalmetabolomet i urin Før vi kan definere avvik fra normal metabolsk profil må vi ha kunnskap om variasjon i normalmetabolomet. - mellom individ - innen ett individ friske forsøkspersoner på valgfri diett i 10 dager. Skrevet ned alt de har spist og drukket, samle morgenurin hver dag.

53 Normalmetabolomet i urin Hvor like blir vi av å spise samme diett i en dag? - 20 friske, mer eller mindre frivillige forsøkspersoner Dag 1: spis, drikk og vær glad Dag 2: samle morgenurin ( valgfri diett-metabolomet ) Kom til RH for frokost : -brød, bremyk, norvegia, paprika, banan. -drikk kun vann. Lag matpakke til lunsj. Kom til RH for middag: -spaghetti m kjøttsaus, grønn salat. Lag matpakke til kvelds. Dag 3: samle morgenurin ( lik diett-metabolomet )

54 Valgfri diett,dag 1 Lik diett,dag 2

55 Sluttbemerkninger Massespektrometri er et meget kraftfult verktøy i medisinsk biokjemi og har et bredt anvendelsesområde. stadig nye applikasjoner implementeres i rutine massespektrometri-basert metabolomikk bidrar til oppdagelse av nye diagnostiske markører og øker vår forståelse av metabolismen. romle romle romle.

56 Takk for oppmerksomheten og god lunsj! The science of metabolomics has been practiced in the field of nephrology, albeit with slightly less sophisticated analytical techniques, for centuries. This urine wheel was published in 1506 by Ullrich Pinder, in his book Epiphanie Medicorum. The wheel describes the possible colors, smells and tastes of urine, and uses them to diagnose disease.