Effekter og analyser av alkylfenoler. Stepan Boitsov Gruppe Marin Miljøkvalitet, HI

Transkript

1 Effekter og analyser av alkylfenoler Stepan Boitsov Gruppe Marin Miljøkvalitet, HI 1 1

2 OVERSIKT AV PRESENTASJONEN Biologiske effekter av alkylfenoler Etablering og validering av analysemetoder for alkylfenoler i produsert vann og biota Bruk av metoden i pågående forsøk Planlagt arbeid 2 2

3 Østrogen aktivitet av alkylfenoler OH HO 4-n-oktylfenol HO 17-β -estradiol Alkylfenoler - binder seg til østrogen-reseptor - stimulerer reseptor-transkripsjon - syntese av vitellogenin blir indusert - feminisering 3 3

4 Østrogen aktivitet av alkylfenoler OH OH OH OH OH OH >> > R R Para Meta Ortho R > = C 8 >C 7 >C 6 >C 9 > C 5 >C 4 >C 3 Tertiær Sekundær Normal 4-tert-Oktylfenol ganger mindre potent enn østradiol 4- tert-butylfenol - 1,5 million ganger mindre potent enn østradiol Effekter på torsk (Gadus Morhua): 4-heptylfenol akutt toksisk ved 400 µg/l Langkjedete alkylfenoler hormonelle effekter ved 0.04 µg/l 4 4

5 Kilder av alkylfenoler i naturen Alkylfenol etoksylater (APE) Oktylfenol, nonylfenol Produksjon reduseres; forbudt i Norge siden 2002 Produsert vann Alle vannløselige alkylfenoler Utslipp økes ortynning faktor 5 5

6 Etablering av analysemetoder Krav til metodene: Skal kunne brukes for alkylfenoler med forskjellig kjedelengde, fra fenol (C 0 ) til nonylfenol (C 9 ). Anvendelig til biotaprøver med både høyt (>70%) og lavt (<1%) lipidinnhold. Anvendelig til produsert vann prøver med både høyt (fenol) og lavt (C 5 -C 9 -fenoler) innhold av alkylfenoler. Høy selektivitet og følsomhet. Deteksjonsgrense i lavt ppb område. 6 6

7 Hovedtrinn i metoden (Produsert vann) iltrering av 100 ml vann. astfase ekstraksjon av filtratet på MAX sorbent, eluering med 5% CHOOH/MeOH. Oppkonsentrering av både filtrat og filter ekstrakt med N 2 til ca. 1 ml. Derivatisering med pentafluorobenzoylklorid. GC/MS analyse. Kvantifisering (isotop fortynning). R 3 NH 2 + C O N CH 2 + NR 3 Oasis MAX mixed-mode polymer sorbent har anionbytter-egenskaper N O 7 7

8 Hovedtrinn i metoden (biota) Ekstraksjon av ca. 1g vev med diklormetan. Opprensing med gel-permeation chromatography (GPC). Derivatisering med pentafluorobenzoylchloride. GC/MS analyse. Kvantifisering (isotop fortynning). 8 8

9 OH R + Pentafluorobenzoyl-derivatisering Cl C= O OH - Risting 1 min 30 min ved r.t. R O O = - Betingelser: ph = (3 ml NaOH/NaHCO 3 buffer); 2 ml heksan; 100 µl pentafluorobenzoylklorid (30 % i isooktan); hydrolyse med 10 ml 1 M NaOH; C ekstraksjon med 2 x 2 ml heksan -Signifikante parametre funnet fra actorial Screening Design-forsøk -ungerer godt for para- og meta-, mindre godt for ortho-alkylfenoler 9 9

10 Totalionkromatogram av produsert vann (GC/MS, SIM) Abundance Phenol o-,m-,p-cresol C 2 -Alkylphenols Larger alkylphenols Time, min 10 10

11 Massespektre av 4-n-oktylfenol: A) EI; B) NCI. A) 195 m/z 301 O O C = m/z 195 C 7 H 7 OH C 6 H C M M/ Z M B) - O O C = 400 Mw 400 (- H) M M/ Z 11 11

12 Linearitet for 4-n-oktylfenol med forskjellige detektorsystemer Måleområde Ikke derivatiserte forbindelser Linearitet GC-MS (EI) pg/µl R 2 =0,9934 Derivater GC-MS (EI) 0,9-760 pg/µl R 2 =0,9906 GC-ECD 1,3-260 pg/µl R 2 =0,9981 GC-MS (NCI) 0, pg/µl R 2 =0,

13 Gjenvinning av alkylfenoler p-cresol Kresol 4-n- butylfenol 4-n- oktylfenol derivatisering Oppkonsentrering (N2 ) GPC GPC Total Total analyse ordampet til tørrhet Kromatografi Total gjenvinning (%)

14 16000 R ubber stopper m /z for glass funnel Bidrag til økte blankverdier H a rd p la stic fro m m /z 414 screw caps m / z soft rubber liner from screw caps

15 ordelene og ulempene til metoden: oppsummering Pentafluorobenzoyl-derivatisering gir stabile derivater med gode kromatografiske egenskaper er en robust metode fungerer godt for para- og meta- alkylfenoler ikke ortho-alkylfenoler GC/MS (NCI) svært følsom og selektiv teknikk Hele metoden gir gode (>70%) gjenvinninger god reproduserbarhet (<15% RSD) 15 15

16 Pågående og planlagt arbeid Analyser av alkylfenoler i sjøvann Bruk av metoden i et forsøk med eksponering av fisk til produsert vann Identifisering av ukjente forbindelser i produsert vann Ukjente alkylfenol-isomerer Andre ukjente forbindelser Analyser av østrogen-forbindelser i sjøvann 16 16

17 Analyse av østrogen-forbindelser RIS Isopropylfenol-d12 17-β-østradiol Østron SIS Østron-d4 17-α-etynyløstradiol Time, min 17 17

18 Eksponering-forsøket Kontinuerlig eksponering av torsk fra gyting til avsluttet kjønnsdifferensering. Gruppe ortynningsfaktor Antatt avstand fra utslippet (m) Høy (H) 1:100 (1 %) Middels (M) 1:1000 (0,1 %) Lav (L) 1:10000 (0,01%) >2000 Positiv kontroll (P) 10 ppb 17- β-estradiol Kontroll (K)

19 Kontroll av alkylfenol-innhold av vannet i eksponeringsforsøket Konsentrajon av kortkjedete fenoler 10000,0 ug/l 1000,0 enol Sum kresoler Sum C2-fenoler 100,0 10,0 1,0 0,1 0,0 Østrogen Kontroll Lav Middels Høy Produsert Vann 19 19

20 Total hydrokarbon, mg/l Produsert vann innhold , , ,8 Alkylfenoler, µg/l 2001* Phenol Sum cresols Sum C 2 -phenols Sum C 3 -phenols ,8 224 Sum C 4 -phenols 94,5 56,8 38,1 Sum C 5 -phenols 19,1 3,0 4,5 Sum C 6 -phenols 0,58 1,79 0,30 Sum C 7 -phenols 0,28 0,09 0,06 Sum C 8 -phenols 0,15 0,04 0,03 Sum C 9 -phenols 0,20 0,00 0,03 * - data fra SINTE ,9 4,6 0,66 0,02 0,02 0,00 47,5 Ukjente C3 54,9 Ukjente C4 14,4 Ukjente C5 2,19 Ukjente C6 0,23 Ukjente C

21 Ukjente alkylfenoler i produsert vann 10000,000 ug/l 1000, ,000 10,000 1,000 0,100 0, enol Kresoler C2-fenoler Ukjente C3 Kjente C3 Ukjente C4 Kjente C4 Ukjente C5 Kjente C5 Ukjente C6 Kjente C6 Ukjente C7 Kjente C7-C9

22 Identifisering av alkylfenol-isomerer i produsert vann Ion Standard-løsning Produsert-vann prøve Time, min 22 22

23 Ion masse Identifisering av alkylfenol-isomerer i produsert vann Alkyl kjedelengde (for alkylfenoler) Antall kjente alkylfenol isomerer Antall ukjente alkylfenol isomerer 288 C C C C C C C C C C Antall ukjente forbindelser 23 23