Kromatografisk separasjon og deteksjon av legemidler

Transkript

1 Kromatografisk separasjon og deteksjon av legemidler Elisabeth Leere Øiestad Avdeling for rusmiddeltoksikologisk forskning Folkehelseinstituttet Kromatografi Kromatografi = fargeskriving (Tsvet 1903) chroma farge grafi skrive Separerte klorofyll og karotenoider Samlenavn på separasjonsmetoder 1

2 Hvorfor separere stoffer? Prøvene er komplekse blandinger interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen Kvalitetskontroll råvarer forurensninger preparater produktkontroll, holdbarhetskontroll (spaltningsprodukter) Sporanalyse stoffer i biologisk materiale fullblod, plasma, urin, spytt, vev, matvarer etc. Fordeler med kromatografiske analyser 2

3 Kan gi svært følsomme og spesifikke analyser LOQ = 0,1 nm (0,08 ng/ml) Oiestad, E.L., et al., Determination of Digoxin and Digitoxin in Whole Blood. Journal of Analytical Toxicology, (7): p Enklere å legge til stoffer 3

4 Hvordan separere stoffer? La stoffblandingen vandre en viss lengde. hvis stoffene vandrer med forskjellig hastighet vil de kunne separeres hvis forskjell i vandringshastighet er stor nok hvis veien stoffene vandrer er lang nok start mål Løypa stoffene vandrer gjennom kalles en kolonne Separasjonsprinsipper I kromatografi tvinges stoffene gjennom løypa (kolonnen) med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet væsken eller gassen kalles mobil fase Kolonnen / stasjonærfasen holder stoffene tilbake retensjon stoffene kan separeres hvis retensjonen er forskjellig 4

5 Kromatografisk separasjon 1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet 2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer Retensjon K = C s C m Fordelingskoeffisienten bestemmer hvor mye av stoffet som vil oppholde seg i stasjonær fase (BESTEMMER RETENSJONEN) 5

6 K = C s C m a. Stoffet oppholder seg bare i mobil fase og retarderes ikke av stasjonær fase b. Stoffet oppholder seg i svært stor grad i stasjonær fase og vandrer svært langsomt kraftig retensjon Båndspredning Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet Skyldes fysiske prosesser 6

7 Kromatogram Resultatet av en kromatografisk separasjon 1. Retensjonstiden t R karakteriserer retensjonen interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon) 2. Bredden av toppene t W (ved grunnlinjen) karakteriserer båndspredningen 3. t 0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen Oppløsningsevne: effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon ) R s = 1/4 ( 1) N ( k 1 + k 7

8 Analytten Lipofilisitet = fettløselighet Hydrofilisitet = vannløselighet Polare funksjonelle grupper lokalisert eller spredt ut over molekylet? Størrelsen på upolar del av molekylet Sure og basiske grupper pka verdier Analytten Flyktighet, størrelse, stabilitet Egenskaper av betydning for deteksjon UV absorbans Fluorescens Oksiderbarhet Bestemte grunnstoffer (nitrogen, fosfor, halogener) Konsentrasjon 8

9 Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige ph verdier Morfin: pka1= 8.0 pka2 =9.9 Ladet Ladet CH + 3 NH CH 3 N CH + 3 NH CH 3 N CH 3 N OH O OH OH O OH OH O OH O O OH OH O OH ph = 8 ph ~ 6 Ladet ph = 10 50% av molekylene er ladet på aminet 50% er uladet på aminet ~99% er uladet på oksygenene 99% av molekylene er ladet på aminet 100% er uladet på oksygenene 99% av molekylene er uladet på aminet ~50% er ladet på det ene oksygenet ~50% er uladet på oksygenene Figur lånt av Thomas Berg, FHI Matriks Vanlige komponenter som må vurderes Proteiner Fett Salter Endogene forbindelser Andre stoffer/metabolitter Hvordan foreligger analytten Grad av proteinbinding Konjugert Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen? 9

10 Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode) Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen) Adsorpsjon Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser Ionebytte Eksklusjon (gel) Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake retensjon Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen) Gasskromatografi (GC) Mobilfasen er en gass Teknikker Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC) Mobilfasen er en væske Kolonne preparativ eller analytisk Tynnsjikt (TLC) Superkritisk fluid kromatografi Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk CO 2 ) 10

11 Kromatografi Stasjonærfase Prøve (a,b,c) Mobilfase Separasjon av en blanding av stoffer (a,b,c) fås hvis stoffene har forskjellig interaksjon med stasjonærfasen (og evt. mobilfasen) Gasskromatografi Detektorer Flammeionisasjonsdetektor Nitrogen fosfor detektor MS Vanligvis helium 11

12 Detektorer Væskekromatografi (LC) UV Fluorescence Elektrokjemisk MS GC vs LC Forskjell i kolonnelengde betyr at man kan få bedre separasjon på en GC kolonne enn en LC kolonne GC m LC 2 30 cm I HPLC kan vi i større grad variere mobilfasen og stasjonærfasen flere muligheter Forskjellige krav til flyktighet, løselighet osv. GC må ofte derivatisere Større og mer polare molekyler > LC 12

13 Separasjonsprinsipper i LC Omvendt fase Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polare væsker slik som metanol, acetonitril eller vann. Vanlige stasjonærfaser: C18, C8 Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet. Aller mest brukte system innen LC per i dag! 13

14 I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon O Si Si O H 3 C Si O Si O H 3 C Si O Si CH 3 H 3 CO HCH 3 C COOH Hydrofob interaksjon van der Waalske krefter Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen Isokratisk eluering vs. gradient eluering Isokratisk eluering: mobilfasens sammensetning endrer seg ikke under analysen. Gradienteluering: mobilfasens sammensetning endrer seg under analysen. Brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet Topper som eluerer sent blir smalere Sparer tid! 14

15 Gradienteluering Ulike muligheter for programmering av gradienten % organic modifier convex linear concave % organic modifier block combined Time (min) Time (min) Van Deemter Figur fra Waters Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store. Høyere flow gir smalere og høyere topper. 15

16 5 μm partikel 1.7 μm partikler 60 μm menneskehår Retensjonen påvirkes av: Mobilfasens sammensetning Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir mindre retensjon ph Syrer blir minst retardert ved høy ph Baser blir minst retardert ved lav ph Tilsetning av salter Salter kan minske løseligheten i mobil fase Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser 16

17 Retensjonen påvirkes av: Stasjonær fase Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder Materialer med polare overflatergrupper gir mindre retensjon Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon Temperatur Økende temperatur gir mindre retensjon Ofte ca. 35 grader HPLC, 65 grader UPLC 17

18 UHPSFC basiske betingelser UHPLC basiske betingelser UHPSFC sure betingelser UHPLC sure betingelser 18

19 Detektorer En detektor skal gi en respons dvs. et elektrisk signal for de stoffer en ønsker å identifisere/kvantifisere Responsen skal være proporsjonal med konsentrasjon av stoff i mobilfasen mengde (massen) av stoff i mobilfasen slik at det kan utføres kvantitative analyser basert på måling av topphøyder/arealer 19

20 Flammeionisasjonsdetektor (FID) Generell detektor som registrer de aller fleste stoffer som inneholder karbon Stabil og reproduserbar Stort lineært område Lett å bruke Signal probe Signal probe Collector Flame tip Figur fra Perkin Elmer Air Column Hydrogen UV detektoren Vanlig LC detektor Svært mange legemidler absorberer UV lys UV detektoren er derfor den mest anvendte detektor i farmasøytisk analyse Filterfotometer lys Spektrofotometer Mobil fase f. eks. diodearraydetektoren gir stoffenes UV spektra Fotodetektor 20

21 Massespektrometer som detektor Mye benyttet som detektor til GC og LC Generell og spesifikk detektor «Gullstandard» innen dopinganalyse og rettstoksikologisk analyse Massespektrometre Nødvendige egenskaper: Analytt må kunne komme i gassfasen Analytt må kunne ioniseres Til sammenligning: UV: analytt må absorbere lys (kromofor) fluorescens: analytt må fluorescere elektrokjemisk: analytt må ha red/ox egenskaper 21

22 Prinsipp for MS Danner og analyserer ioner stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer) Måler masse over ladning, m/z Analyserer i vakuum (gassfase) Destruktiv teknikk Gode MS betingelser = godt vakuum Hva med mobilfasen?? GC: mobilfasen er en gass, og er derfor kompatibel med MS en. LC: mobilfasen er en væske kan ikke føres direkte inn i vakuum (0,1 ml/min væske ca. 100 ml/min gass!!) 22

23 Kvadrupol masseanalysator resonant ion non-resonant ion _ + + _ Detector Stable (resonant) ion Ion Source Quadrupole Mass Filter Prefilter Postfilter DC and AC Voltages Rejected ions Klonazepam Kan se flere stoffer samtidig ett signal per stoff (hvis forskjellig masse) Bromazepam Flunitrazepam Metadon Alprazolam Oksazepam

24 Trippelkvadrupol instrumenter MS1 Kollisjonscelle MS2 I et «trippelkvadrupol» eller tandem massespektrometer er MS1 og MS2 masseanalysatorer som filtrerer ioner Kollisjonscellen er fylt med argon, og et potensiale settes på for å fragmentere ionene. Sammenlikning av SIM og MRM Ionekromatogram av m/z=255 Fenbufen MixIso_1G14_ ng/ml Ketoprofen 60 ng/ml Fenbufen 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 5.95e6 O % O OH Ketoprofen Fenbufen Ketoprofen O OH O Time MixIso_1G14_ ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e6 Begge har MW på 254 % Ketoprofen Fenbufen?? Time 48 24

25 MixIso_1G14_ % SIM av m/z= SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e Time 60 ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen MixIso_1G14_ % MRM av m/z= 255 > MRM of 2 Channels ES > e6 Ketoprofen 0 MixIso_1G14_ MRM of 2 Channels ES > e4 % MRM av m/z= 255 > 237 Fenbufen Time 25

26 Oppsummering Kromatografiske metoder Godt egnet for legemiddelanalyse Spesifikke og følsomme analyser Identifikasjon av stoff Kan legge til nye stoffer etterhvert Kan være kvantitativ 26

27 Takk til Professor Leon Reubsaet, Farmasøytisk Institutt Åse Marit Leere Øiestad, Folkehelseinstituttet Spørsmål? 27