Hormonmålinger. Analyseprinsipper, kvalitetskontroll og referanseområder. Bjørg Almås, Dr. scient, FoU-leder Hormonlaboratoriet (HUS)

Transkript

1 Hormonmålinger Analyseprinsipper, kvalitetskontroll og referanseområder Bjørg Almås, Dr. scient, FoU-leder Hormonlaboratoriet (HUS) 1

2 Hormonlaboratoriet, Laboratoriebygget Haukeland Universitetsykehus 2

3 Hormonlaboratoriet, Haukeland Universitetsykehus Landets eldste Hormonlaboratorium Ca 50 forskjellige analyser Seksjon for FoU Utvikling av massespektrometriske analyser (LCMSMS). Massespektrometri og steroidhormoner Rutineanalyser: Seksjon for automat- og spesialanalyser Seksjon for kromatografiske analyser og massespektrometri Forskningsgruppe/UiB Fedme og metabolisme Hormoner og brystkreft Molekylær endokrinologi Vitamin D, osteoporose og hyperparathyroidisme 3

4 Hormoner proteiner og peptider Det endokrine system biogene aminer (aminosyreanaloger), metabolitter Fettløselige; steroider, vitamin D 4

5 Analyseprinsipper, metoder Immunokjemiske metoder Analyse av: LCMSMS: Kromatografi kombinert med massespektrometri Proteiner, peptidhormoner, steroider Analyse av: Biogene aminer og metabolitter, steroider 5

6 Analytter Komponenter i immunokjemiske teknikker hormoner proteiner, enzymer, vitaminer, medikamenter, tumormarkører, virus og bakterier Antistoffer polyklonale (Pab) monoklonale (Mab) rekombinante 6

7 Produserer kjemiluminescens Enzym: peroxidase eller alkalisk fosfatase 7

8 Immunoassay for intakt PTH (sandwich-metode) Coated Bead PTH PTH PTH * * Chemiluminescence Label antibody antibody * 8

9 Immunokjemiske analyser Automatiserte analyser(immulite) Benkemetoder (RIA, ELISA) F.eks fertilitet F.eks 1,25 (OH) 2 vitamind, TRAS, AMH 9

10 Immunokjemiske metoder + Kan ofte måles direkte i prøve Automatisering og kort analysetid Godt antistoff = god analyse!! Indirekte måleletode Kryssreaksjoner (nedsatt spesifisitet) Bindingsaffinitet til antistoff kan påvirkes av flere faktorer 10

11 LCMSMS: analyseprosess 1. Prøveopparbeiding/forbehandling (robotisert) 2. Kromatografisk separasjon (HPLC/UPLC) 3. Analyse/deteksjon (massespektrometer) 4. Resultatbehandling

12 HPLC-system HPLC: High Performance Liquid Chromatography 12

13 MS/MS Tandem Mass Spectrometry MS 1 MS Multiple Reaction Monitoring (MRM) Kollisjonsquadrupol Nitrogen M + F + Bare forbindelser med overgangen M + F + blir detektert 13

14 Syntese av steroidhormoner i binyrebark 14

15 Rutinemetoder LCMSMS Metoder i rutinedrift Kortisol spytt Kortisol urin S-25(OH) VD S-Testosteron S-Androstendion S-11-DOC S-17-OH-progesteron S-Progesteron S-Kortisol Under utvikling: Østradiol (Vår 2017) Aldosteron Fettløselige vitaminer Steroidpanel i spytt Katekolaminer Metanefriner (urin, plasma) 5-HIAA (døgnurin)

16 LCMSMS-metoder ++ Direkte målemetode Gullstandard!! Svært sensitiv og spesifikk Standardisering mellom laboratorier Kan ofte måle flere analytter i samme «run» (multipleksing, metabolomics) Dyrt utstyr Lang metodeutvikling, ressurskrevende Kompleks metode (fire trinn, kan være tidkrevende) Kompetansekrevende Økt kvalitet, pasientsikkerhet!!!! 16

17 Hva kan påvirke analysesvaret? Prøvetaking og prøvehåndtering Pasientforberedelse Interferens: Effekten av en eller flere substanser som forårsaker et avvik av målt verdi fra sann verdi. Immunologiske metoder: Kryssreaktivitet Heterofile antistoffer/autoantistoffer Alle metoder: Matrikseffekter Matriks = omgivelser, miljø Matrikseffekt kan bl.a. forårsakes av: Reagenser i målesystemet Proteiner i blodprøven Medikamentbruk (naturpreparater) Antikoagulanter Hemolyse, lipemi Kosthold Preanalytiske feil er hovedårsaken til feil i analysesvar!! 17

18 Bindingsproteiner Mange hormoner foreligger i serum bundet til spesifikke transport/bindingsproteiner Øker løselighet av hormonet, modulerer levetid og biologisk effekt Kan interferere med assay og tolkning! Den frie, ubundne fraksjonen er den biologisk aktive (sant eller usant.?) beregning eller måling av fri fraksjon

19 Kvalitetssikring av hormonanalyser Kvalitetssystemer, kvalitetsmål (akkreditering) Kalibratorer, sporbarhet Kontroller (daglige, langtids) Kontrollregler Eksterne kontroller Statistikk, historiske data Validering av prøvesvar

20 Referanseområder Framkommer ved analyse av antatt friske personer. Vanligst: det sentrale persentilintervallet som omfatter 95% av verdienes fordeling. Ved normalfordeling av analyseresultatene kan grensene settes som ± 2 SD 20

21 Bimodal/flermodal fordeling av måleverdier kan reflektere forskjeller mellom kjønn, alder, kosthold, døgn, årstid, etniske grupper, BMI.. Innen subgruppen kan verdiene være normalt distribuerte 21

22 Hvordan etableres et referanseområde? Anbefalt: 120 personer i hver distinkte subgruppe Forenklet: 60 personer i hver distinkte subgruppe Vanlig at laboratorier overfører referanseområdet fra leverandør av metode, fra annet laboratorium med samme metode, eller fra publikasjon. Verifiseres med 20 prøver (fra hver subgruppe). 18 av prøvene må være innenfor referanseområdet. Omfattende og ressurskrevende prosess!! 22

23 Pediatriske referanseområder overførte referanseområder benyttes ofte pga vansker med å innhente nok prøver til å etablere eller verifisere referanseområdet Vanskelig å innhente prøver fra friske barn Mange subgrupper (alder, kjønn) Volumproblematikk større frekvens av hemolyse i prøver Annen sammensetning av matrix (bilirubin, lipider), voksne referanseområder bør ikke brukes uten videre OBS! Mange referanseområder i bruk, spesielt for barn kan være utarbeidet på foreldete metoder!!!! 23

24 Strategi for vurdering/verifisering av (pediatriske) referanseområder uten prøvetaking - Omvendt Hoffmann metode: bruk av lagrede pasientdata - Benytte data fra allmennpraksis («de fleste er friske») - For LCMSMS multianalyttmetoder: benytte data fra prøver der analytten IKKE er rekvirert Ulempe: ingen informasjon om referanseindividene 24

25 Rekvirering av prøver Kliniske opplysninger viktig for validerende leger!!!!! 25

26 Takk for meg!!! 26