«Blasts?» -et nyttig flagg?

Transkript

1 «Blasts?» -et nyttig flagg? Heidi Eilertsen Høgskolen i Oslo og Akershus XE 5000 er et hematologiinstrument fra Sysmex som benytter laserteknologi (DIFF kanalen) og impedansmåling (IMI kanalen) for å analysere leukocytter. 1

2 DIFF-kanalen Leukocyttene differensieres og på grunnlag av» Cellestørrelse» DNA/RNA innhold» Granulering» Kjerneform og størrelse Diff-kanalen: Blodprøven blir automatisk aspirert og tilsatt reagenser som fjerner erytrocytter og trombocytter gjør leukocyttene permeable for fluorescerende fargestoff (polymethine) polymethine farger nukleinsyrer (RNA/DNA) og organeller i cytoplasma (granula) Det fortynnede fargede prøvemateriale blir hydrodynamisk fokuseret og ført gjennom flowcellen I flowcellen blir hver celle belyst av lyset fra laseren, som sender ut en intens monokromatisk lysstråle (633 nm). Når lyset fra lysstrålen treffer en celle blir lyset spredt, samt absorbert av de fargede cellebestanddelene som derved fluorescerer og sender ut lys av en lengre bølgelengde i alle retninger. Intensiteten til det spredte lyset måles forfra (forward scatter) og fra siden (side scatter) av henholdsvis en fotodiode og en fotomultiplikator som omdanner lyset til signaler. Intensiteten til det emitterte fluorescenslyset (side fluorescence) måles lateralt av en fotomultiplikator 2

3 Forward scattered lys gir informasjon om cellenes størrelse Side scattered lys gir informasjon om cellenes kompleksitet Fluorescens-signalet reflekterer cellens innhold av RNA/DNA signalene plottes i todimensjonale scattergrammer, analyseres ved hjelp av algoritmer og avansert databearbeiding og konverteres til: numeriske verdier for forekomst av nøytrofile granulocytter eosinofile granulocytter basofile granulocytter lymfocytter Monocytter varsler ved forekomst av morfologiske unormaliteter left shift blasts atypical lymph abnlymph/blasts IMI-kanalen Modne og umodne myeloide celler differensieres og på grunnlag av» Lipid/aminosyre sammensetningen i membranen» Cellestørrelse» Kompleksitet (granulering, kjernetetthet..)» Kjerneform og størrelse 3

4 IMI-kanalen: Blodprøven blir automatisk aspirert og tilsatt reagenser som lyserer de modne cellene og i ulik grad beskytter umodne celler Det fortynnede prøvematerialet blir ført gjennom en kapillæråpning som det står en DC/RF strømkrets over Når cellene passerer kapillæråpningen endres impedansen i strømkretsen Forandring i likestrøm-impedanse (DC) gir informasjon om cellenes størrelse Forandring i radiofrekvens-impedanse (RF) gir informasjon om cellens kompleksitet (kjernetetthet og granulering) (yttermembranen blir gjort ledende, men innerstrukturen gir motstand) Signalene plottes i todimensjonalt scatterdiagram, analyseres ved hjelp av algoritmer og avansert databehandling og konverteres til: varsler ved forekomst av morfologiske unormaliteter i myeloide celler immgran blasts 4

5 varslene genereres på grunnlag av såkalte q-verdier q-verdiene antyder sannsynligheten for at varselet er «korrekt» «q-verdiene» angis kvantitativt på en arbitrær skala fra 0 til 300, med intervaller på 10 ved en gitt terskelverdi trigges et varsel left shift immgran blasts atypical lymph abnlymph/blast. Varslene indikerer mulig forekomst av morfologiske abnormaliteter Varslene er ikke uttrykk for konkrete funn Laboratoriene må ha prosedyrer for hvordan de skal følge opp prøver med varsler Manuell vurdering av blodutstryk er mye brukt som konfirmerende tiltak The International Society for Laboratory Hematology (ISLH). ISLH has also been instrumental in standards and guidelines development in laboratory Hematology. The International Consensus Group for Hematology Review: Suggested Criteria for Action Following Automated CBC and WBC Differential Analysis. Kriteriene for oppfølging er bestemmende for ressursbruken, effektiviteten og analysekvaliteten Vesentlig å kjenne kvaliteten på varslene 5

6 Studie gjennomført på Ahus Hensikten var å undersøke inter- og intrainstrumentvariasjon med henblikk på forekomst av flagget Blasts? å kartlegge hvor godt flagget Blasts? samsvarte med forekomst av blaster i blodprøven vurdere blastflaggets sensitivitet og spesifisitet ved ulike grenseverdier (cut off) Materialer og metode Inter-instrument variabilitet 408 blodprøver som viste ett eller flere av flaggene blasts?, immature gran, atypical lymfocytes og/eller abn Ly/L-blast ved rutineanalyse ble inkludert Prøvene var fra pasienter som var innlagt i sykehuset og ble tappet på 2 eller 4 ml Vacuette K2EDTA (1,8 mg/ml blod) rør fra Greiner Prøvene ble undersøkt på nytt på tre XE-5000 instrumenter» analyseringene ble utført fortløpende» instrumentrekkefølgen ble bestemt av når instrumentene var ledige Intra-instrument variabilitet Prøver med flagg ved rutineanalyse ble målt 10 gjentatte ganger; 4 prøver pr flagg pr instrument 6

7 Resultater: Inter-instrument variabilitet; q-verdier Instrumentene viste tildels store forskjeller i verdiene som ble rapportert median q-verdi:» XE1: 70» XE2: 40»XE3: 30 Forskjellene er signifikant (Friedman, p<0.001) Scattergrammene viser q-verdiene som ble rapportert for instrumentene parvis Samsvar (agreement) mellom q-verdiene ble tallfestet med intraclass correlation coefficient (ICC) til

8 Inter-instrument variabilitet; «Blasts?» XE1, XE2 og XE3 rapporterte meldingen «Blasts» på et signifikant forskjellig antall prøver (Cochrane, p<0.001) Instrumentene rapporterte meldingen sammenfallende på 128 prøver Kappa koeffisienten for overensstemmende rapportering var 0.73 Intra-instrument variabilitet; Q-flaggverdier Gjentatte målinger viste store forskjeller i q-verdiene som ble rapportert Mean, standardavvik, variasjonskoeffisient og range for 10 gjentatte målinger i 4 prøver pr instrument Instrument Sample# n Mean* Standard deviation Coefficient of variation (%) Lowest value* Highest value* S XE1 XE2 XE3 S S S S S S S S S S S Samsvar (agreement) mellom q-flaggverdiene ble tallfestet med intraclass correlation coefficient (ICC) til 0.68, 0.62 og 0.72 for henholdvis XE1, XE2 og XE3 8

9 Oppsummering Variasjonen i q-verdiene som ble rapportert ved gjentatte målinger i samme prøve er høy (ICC ; lav repeterbarhet) Systematisk forskjell i q-verdi nivået mellom instrumentene Inter-instrumentvariabiliteten for blast flagget er betydelig XE1 meldte blaster på 12% flere prøver enn XE3 XE2 meldte blaster på 31% flere prøver enn XE3 Videre lesning Eilertsen H, Vøllestad NK, Hagve TA. The usefulness of blast flags on the Sysmex XE-5000 is questionable. Am J Clin Pathol. 2013; 139: