Håndbok for PAXgene Blood RNA Kit

Transkript

1 Håndbok for PAXgene Blood RNA Kit Versjon 2 PAXgene Blood RNA System består av et blodinnsamlingsrør (PAXgene Blood RNA Tube) og nukleinsyrerensepakke (PAXgene Blood RNA Kit). Det er beregnet for innsamling, oppbevaring og transport av blod og stabilisering av intracelle-rna i et lukket rør og etterfølgende isolering og rensing av intracelle-rna fra fullblod for RT- PCR brukt i molekylediagnostisk testing. Utførelsesegenskaper for PAXgene Blood RNA System er etablert bare med FOS- og IL1B-gentranskripter. Brukeren er ansvarlig for å etablere egnede utførelsesegenskaper for PAXgene Blood RNA System for andre måltranskripter. For in vitro-diagnostisk bruk NO PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon, Sveits Produsert av QIAGEN GmbH for PreAnalytiX R NO April 2008

2 Varemerker: PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). PAXgene Blood RNA Kits er ikke tilgjengelige i alle land. Vennligst forhør deg. Begrenset lisensavtale Bruk av dette produktet innebærer at en kjøper eller bruker av PAXgene Blod RNA Kit samtykker i følgende vilkår: 1 PAXgene Blood RNA Kit kan brukes bare i samsvar med håndboken for PAXgene Blood RNA Kit og til bruk med komponenter som er bare i pakken. PreAnalytiX gir ingen lisens i forhold til noen av sine åndsprodukter til å bruke eller innlemme vedlagte komponenter i denne pakken med noen komponenter som ikke er inkludert i denne pakken, med unntak av det som er beskrevet i håndboken for PAXgene Blood RNA Kit og flere protokoller som nå finnes på 2 PreAnalytiX gjør ingen garantier for at denne pakken og/eller bruksområdene ikke krenker rettighetene til tredjeparter bortsett fra tydelig uttrykte lisenser. 3 Denne pakken og komponentene i den er lisensiert til engangsbruk og kan ikke brukes flere ganger, modifiseres eller selges på nytt. 4 PreAnalytiX frasier seg spesifikt andre lisenser, uttrykt eller antydet, bortsett fra det som er uttrykkelig oppgitt. 5 Kjøperen og brukeren av pakken samtykker i å ikke la noen andre gjøre noe som kan føre til handlinger som er forbudt ovenfor. PreAnalytiX kan håndheve forbud i denne begrensede lisensavtalen i en hvilken som helst domstol, og skal få tilbake alle sine forskende og domstolskostnader, inkludert advokathonorarer, i noen handling for å håndheve denne begrensede lisensavtalen eller noen av sine immaterielle rettigheter i forhold til pakken og/eller komponentene. For oppdaterte lisensvilkår, se PreAnalytiX GmbH, med enerett. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Sveits Forhandlere for PreAnalytiX PreAnalytiX-produkter er produsert for PreAnalytiX av QIAGEN eller BD og distribueres for PreAnalytiX av QIAGEN eller BD. Produkter kan ikke bestilles fra PreAnalytiX GmbH. Se siste side for kontaktinformasjon for din lokale PreAnalytiX-forhandler.

3 Innhold Forklaring av symboler 4 Pakkens innhold 5 Oppbevaringsforhold 6 Beregnet bruk 6 Begrenset bruk av produktet 7 Kvalitetskontroll 7 Teknisk hjelp 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Innledning 10 Prinsipp og prosedyre 10 Stabilisering av prøveinnsamling 10 Manuell RNA-rensing 19 Automatisk RNA-rensing 27 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for 31 Viktige merknader 32 Bruke QIAcube 32 Starte QIAcube 32 Installere protokoller på QIAcube 32 Laste QIAcube 34 Protokoll: Manuell rensing av total RNA fra humant fullblod samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) 41 Protokoll: Automatisk rensing av total RNA fra humant fullblod samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) 47 Feilsøkingsveiledning 52 Vedlegg A: Generelle kommentarer om håndtering av RNA 54 Vedlegg B: Kvantifisering og måling av kvalitet på total RNA 55 Vedlegg C: Håndtere PAXgene Blood RNA-rør 57 Bestillingsinformasjon 58 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008 3

4 Forklaring av symboler i <N> Inneholder nok til <N> tester Se bruksanvisninger Brukes innen Ikke bruk flere ganger In vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Katalognummer Batchkode Materialenummer Komponenter Nummer Sterilisert med strålnigsmetode Kunitz-enheter Temperaturbegrensninger Øvre temperaturgrense Produsent Viktig merknad? EtOH Skriv ned aktuell dato etter at du har tilsatt flasken etanol Ved ankomst Legge til Inneholder Rekonstituert Deoksyribonuklease I Etanol Guanidinisotiocyanat RNase-fritt Dnase-sett Fører til 4 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

5 Pakkens innhold PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalognr Antall klargjøringer 50 BR 1 Resuspensjonsbuffer 20 ml BR 2 Bindende buffer* 18 ml BR 3 Vaskebuffer 1* 45 ml BR 4 Vaskebuffer 2 (konsentrat) 11 ml BR5 Elueringsbuffer 6 ml RNFW PK PRC PT Hemogard MCT RNFD Rnase-fri vann (flaske) Proteinase K (grønt lokk) PAXgene RNA spinnsøyler (rød) Reagensrør (2 ml) Secondary BD Hemogard -hetter Mikrosentrifugerør (1,5 ml) DNase I, RNase-fritt (lyofilisert) 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml 5 x 10 6 x x 50 1 x Kunitzenheter Tabell fortsetter på neste side * Ikke kompatibel med desinfiseringsreagenser som inneholder blekemiddel. Inneholder et guanadinsalt. Se side 7 for sikkerhetsinformasjon. Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som konsentrat. Før førstegangsbruk, tilsett 4 volumer etanol ( %, renhetsgrad p.a.) som vist på flasken for å oppnå en arbeidsløsning). Kunitz-enheter er enhetene som vanligvis brukes til å måle DNase I. Se side 42 eller 48 for definisjon. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008 5

6 PAXgene Blood RNA Kit (50) Katalognr Antall klargjøringer 50 RDD DNA oppslutningsbuffer (hvitt lokk) 2 x 2 ml DRB PSC Dnase-resuspensjonbuffer (rør, lilla lokk) PAXgene Shredder spinnsøyler (lilla) HÝndbok for PAXgene Blood RNA Kit (Versjon 2) 2 ml 5 x 10 1 Oppbevaringsforhold PAXgene RNA spinn-søyler (PRC), PAXgene Shredder spinn-søyler (PSC), proteinase K (PK) og bufre (BR1, BR2, BR3, BR4 og BR5) kan oppbevares tørt ved temperaturen som står på etiketten på pakken. Rnase-fritt Dnase-sett som inneholder DNase I (RNFD), DNA-oppslutningsbuffer (RDD) og DNase-resuspensjonsbuffer (DRB), fraktes ved omgivelsestemperatur. Oppbevar alle komponenter av det RNase-frie DNase-settet straks ved mottak ved temperaturen som står på etiketten. Beregnet bruk PAXgene Blood RNA Kit er for rensing av intracelle-rna fra fullblod samlet i PAXgene Blood RNA-røret (BRT). Når pakken brukes i sammenheng med PAXgene Blood RNA-røret (BRT), gir systemet renset intracelle-rna fra fullblod for RT-PCR brukt i molekylediagnostisk testing. Se produktskrivet for PAXgene Blood RNA-røret for informasjon om bruken av PAXgene Blood RNA-rør (BRT). Utførelsesegenskaper for PAXgene Blood RNA System er etablert bare med FOS- og IL1B-gentranskripter. Brukeren er ansvarlig for å etablere yteevnene til PAXgene Blood RNA System som egner seg for andre måltranskripter. 6 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

7 Begrenset bruk av produktet PAXgene Blood RNA Kit er beregnet på rensing av intracelle-rna fra humant fullblod (4,8 x ,1 x 10 7 leukocytter/ml) for in vitro-diagnostiske applikasjoner. Det er ikke for rensing av genom-dna eller virusnukleinsyrer fra humant fullblod. På grunn av det begrensede antallet transkripter som er validert for stabiliseringsspesifikasjoner (FOS- og IL1B-gentranskripter), er ikke yteevnene etablert for alle transkripter. Laboratoriepersonale skal gjennomgå produsentens data og egen data for å avgjøre om validering er nødvendig for andre transkripter. Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs ISO-sertifiserte kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti med PAXgene Blood RNA Kit mot forhåndsbestemte spesifikasjoner for å sikre konsekvent produktkvalitet. Teknisk hjelp Hos QIAGEN er vi stolte av kvaliteten og tilgjengeligheten av vår tekniske støtte. Våre tekniske serviceavdelinger er bemannet av erfarne vitenskapsfolk med omfattende praktisk og teoretisk ekspertise i molekylær biologi og bruken av PreAnalytiX-produkter. Hvis du har spørsmål om PAXgene Blood RNA Kit, nøl ikke med å ta kontakt med oss. For teknisk assistanse og mer informasjon, ta kontakt med QIAGE tekniske tjenester (se side 61). Sikkerhetsinformasjon Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For å unngå risiko for infeksjon (f.eks. HIV- eller hepatitt B-virus) eller skade ved arbeid med biologiske og kjemiske materialer, bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du se, vise og skrive ut MSDS for denne pakken. Bindende buffer (BR2) og vaskebuffer 1 (BR3) inneholder guanidin tiocyanat som kan danne sterkt reaktive forbindelser når kombinert med blekemiddel. Hvis bindende buffer (BR2) eller vaskebuffer 1 (BR3) søles, rengjør med egnet Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008 7

8 laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis væske som inneholder potensielt smittefarlige midler søles, renses det berørte området først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, deretter med 1 % (v/v) natriumhypokloritt. FORSIKTIG: IKKE tilfør blekemidler eller sure løsninger direkte til prøvepreparatavfall. Den RNA-stabiliserende løsningen og blodblandingen fra PAXgene Blood RNArøret (BRT) kan desinfiseres med 1 volum kommersiell blekemiddelløsning (5 % natriumhypokloritt) per 9 volumer RNA-stabiliserende løsning og blodblanding. Prøvepreparatavfall, f.eks. supernatanter, fra sentrifugeringstrinn i RNArenseprosedyren, er å anse som potensielt smittsomt. Før kasting må avfallet autoklaveres eller forbrennes for å ødelegge smittefarlig materiale. Avfallsbehandlingen må skje i henhold til offisielle forskrifter. Følgende risiko og sikkerhetsuttrykk gjelder komponenter for PAXgene Blood RNA Kit. Se produktskrivet for PAXgene Blood RNA-røret for sikkerhetsinformasjon om bruken av PAXgene Blood RNA-rør (BRT). Bindende buffer (BR2) Xn Inneholder guanidin tiocyanat: skadelig (Xn). Risiko- og sikkerhetssetninger:* R20/21/22-32, S Vaskebuffer 1 (BR3) Inneholder etanol: brannfarlig. Risikosetning:* R10 * R10: Brannfarlig: R20/21/22: Skadelig ved innånding, hudkontakt og svelging. R32: Ved kontakt med syrer utvikles svært giftig gass: R36/37/38: Irriterer øyne, luftveier og hud: R42/43: Kan føre til allergi ved inhalering og hudkontakt, S13: Må ikke oppbevares sammen med næringsmidler, drikkevarer eller dyrefôr, S22: Unngå innånding av støv, S23: Unngå innånding av sprøytetåke, S24: Unngå hudkontakt, S26: Får man stoffet i øynene; skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S36: Bruk egnede verneklær, S36/37: Bruk egnede verneklær og -hansker: S46: Ved svelging, kontakt lege omgående og vis denne beholderen eller etiketten. 8 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

9 Proteinase K (PK) Xn Inneholder proteinase K (Tritirachium album): sensibilisator, irritant. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R36/37/38-42/43, S /37 DNase I Xn Inneholder deoksyribonuklease (bovin): sensibilisator. Risiko- og sikkerhetssetninger:* R42/43, S /37 24-timers nødsinformasjon Medisinsk nødsinformasjon på engelsk, fransk og tysk kan skaffes 24 timer i døgnet fra: Poison Information Center Mainz, Tyskland Tlf.: * R10: Brannfarlig: R20/21/22: Skadelig ved innånding, hudkontakt og svelging. R32: Ved kontakt med syre utvikles giftig gass. R36/37/38: Irriterer øynene, luftveiene og huden. R42/43: Kan gi allergi ved innånding og hudkontakt, S13: Må ikke oppbevares sammen med næringsmidler. S22: Unngå innånding av støv. S23: Unngå innånding av gass/røyk/damp/sprøytetåke., S24: Unngå hudkontakt. S26: Får man stoffet i øynene; skyll straks grundig med store mengder vann og kontakt lege. S36: Bruk egnede verneklær, S36/37: Bruk egnede verneklær og -hansker: S46: Ved svelging, kontakt lege omgående og vis denne beholderen eller etiketten. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008 9

10 Innledning Innsamling av fullblod er det første trinnet i mange molekylære analyser som brukes til å studere celle-rna. En sentralt problem i slike eksperimenter er imidlertid ustabiliteten til celle-rna-profilen in vitro. Studier ved PreAnalytiX har vist at kopinumrene på individuelle mrna-arter i fullblod kan forandres mer enn 1000 ganger under oppbevaring eller transport ved romtemperatur.* Dette forårsakes både av hurtig RNA-degradering og av indusert uttrykk for visse gener etter at blod er innsamlet. Slike endringer i RNA-uttrykksprofilen gjør det umulig med pålitelige studier av genuttrykk. En metode som konserverer RNAuttrykksprofilen under og etter flebotomi er derfor avgjørende for riktig analyse av genuttrykk i humant fullblod. Prinsipp og prosedyre PreAnalytiX har utviklet et nytt system for å samle, stabilisere, lagre og transportere prøver av humant fullblod, sammen med en hurtig og effektiv protokoll for rensing av intracelle-rna. Systemet krever bruk av PAXgene Blood RNA-rør (BRT; amerikanske patenter 6,602,718 og 6,617,170) for innsamling av blod og RNA-stabilisering, etterfulgt av manuell eller automatisk rensing av RNA med PAXgene Blood RNA Kit. Både manuelle og automatiserte protokoller gir i det vesentlige lik utførelse i forhold til RNA-kvalitet og resultat. Utførelsesdata for den manuelle protokollen (side 19-26) og den automatiske protokollen (side 27-30) er inkludert i denne håndboken. Stabilisering av prøveinnsamling PAXgene Blood RNA-rør (BRT) inneholder en egen reagensforbindelse basert på en patentert RNA-stabiliseringsteknologi. Denne reagensforbindelsen beskytter RNA-molekyler fra degradering av RNaser og minimerer ex vivo-endringer i genuttrykk. PAXgene Blood RNA-rør (BRT) er beregnet på å samle humant fullblod og stabilisere celle-rna i opptil 3 dager ved C (Figur 1 og 2, side 12 og 13) eller opptil 5 dager ved 2 8 C (Figur 3 og 4, side 14 og 15). Data som er tilgjengelige, viser stabilisering av celle-rna i minst 24 måneder ved 20 C eller 70 C. For mer informasjon fra pågående studier som evaluerer stabilitet over lengre tidsperioder, ta kontakt med QIAGEN teknisk service. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

11 Varigheten av RNA-stabilisering kan variere avhengig av arten med celle-rna og nedstrømsapplikasjonen som brukes. På grunn av det begrensede antallet transkripter som er validert for stabiliseringsspesifikasjoner (FOS- og IL1Bgentranskripter), er ikke yteevnene etablert for alle transkripter. Laboratoriepersonale skal gjennomgå produsentens data og egen data for å avgjøre om validering er nødvendig for andre transkripter. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

12 RNA-stabilitet i blodprøver ved C: FOS Oppbevaring (dager) Oppbevaring (dager) Figur 1 Blod ble tatt fra 10 donorer med duplikate prøver og oppbevart ved C i det oppgitte antallet dager, etterfulgt av total RNA-rensing. Blod ble samlet og lagret i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) og total RNA ble renset med PAXgene Blood RNA Kit. Blod ble samlet og lagret i standard blodinnsamlingsrør med EDTA som antikoagulant, og total RNA ble renset med standard organisk ekstraksjonsmetode med silikamembranbasert RNArengjøring. Relative transkriptnivåer av FOS ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR, med 185 rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet med middelverdier og standardavvik for alle prøver som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (2,34 C T ). 12 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

13 RNA-stabilitet i blodprøver ved C: IL1B Oppbevaring (dager) Oppbevaring (dager) Figur 2 Blod ble samlet og total RNA-renset etter oppbevaring ved C, som beskrevet i Figur 1. Relative transkriptnivåer av IL1B ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR, med 18S rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet med middelverdier og standardavvik for alle prøver som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (1,93 C T ). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

14 RNA-stabilitet i blodprøver ved 2 8 C: FOS Oppbevaring (dager) Oppbevaring (dager) Figur 3 Blod ble tatt fra 10 donorer med duplikate prøver og oppbevart ved 2 8 C i det oppgitte antallet dager, etterfulgt av total RNA-rensing. Blod ble samlet og lagret i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) og total RNA ble renset med PAXgene Blood RNA Kit. Blod ble samlet og lagret i standard blodinnsamlingsrør med EDTA som antikoagulant, og total RNA ble renset med standard organisk ekstraksjonsmetode med silikamembranbasert RNArengjøring. Relative transkriptnivåer av FOS ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR, med 185 rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet, med middelverdier og standardavvik for alle prøver som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (2,34 C T ). 14 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

15 RNA-stabilitet i blodprøver ved 2 8 C: IL1B Oppbevaring (dager) Oppbevaring (dager) Figur 4 Blod ble samlet og total RNA-renset etter oppbevaring ved 2 8 C, som beskrevet i Figur 3. Relative transkriptnivåer av IL1B ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR, med 18S rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet med middelverdier og standardavvik for alle prøver som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (1,93 C T ). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

16 RNA-konsentrasjon og rensing PAXgene Blood RNA Kit er for rensing av total-rna fra 2,5 ml humant fullblod samlet i en PAXgene Blood RNA-rør (BRT). Prosedyren er enkel og kan utføres med manuelle eller automatiske prosedyrer (se flytdiagram). I begge protokoller starter rensing med et sentrifugeringstrinn til pellet-nukleinsyrer i PAXgene Blood RNA-rør (BRT). Pelleten vaskes og resuspenderes, etterfulgt av manuell eller automatisk RNA-rensing. I prinsipp følger begge protokoller de samme protokolltrinnene med de samme pakkekomponentene. 16 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

17 Manuell PAXgene blod-rna-prosedyre Blod Tilfør proteinase K (PK) og bindebuffer (BR2) Inkuber Overfør til PAXgene Shredder spinn-søyle (PSC) Bland Overfør supernatantet av gjennomløpsdelen til rør for mikrosentrifuge Tilfør etanol Last PAXgene RNA spinnsøyle (PRC) Vask pellet Bind total RNA Vask Suspender på nytt Nedbryt DNA Overfør til mikrosentrifugerør (MCT) Vask Eluer Oppvarm til 65 C Klargjort RNA Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

18 Automatisk PAXgene blod-rna-prosedyre Blod Add proteinase K (PK) og bindebuffer (BR2) Inkuber Bland Overfør til PAXgene Shredder spinn-søyle (PSC) Tilfør etanol til den gjennomstrømte delen Vask pellet Overfør til reagensrør (PT) og last inn i rysteren i QIAcube Suspender på nytt Last på PAXgene RNA spinn-søyle (PRC) Bind total RNA Vask Nedbryt DNA Fulautomatisk på QIAcube Vask Overfør PAXgene RNA spinn-søyle (PRC) Eluer Lukk lokkene på mikrosentrifugerørene (MCT) og overfør dem til rysteren i QIAcube Varmes opp ved 95 C Klargjort RNA 18 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

19 Manuell RNA-rensing Den resuspenderte pelleten inkuberes i optimerte buffere sammen med proteinase K (PK) for å oppnå proteinfordøyelse. En tilleggssentrifugering gjennom PAXgene Shredder spinn-søylen (PSC) utføres for å homogenisere cellelysatet og fjerne restceller, og supernatatenten av strømmen gjennom fraksjon overføres til et ferske mikrosentrifugerør. Etanol tilsettes for å justere bindingsforhold, og lysatet anvendes på en PAXgene RNA-spinn-søyle (PRC). Under en kort sentrifugering, bindes RNA selektivt til PAXgene silikamembranen når kontaminanter går gjennom den. Resterende kontaminanter fjernes i flere effektive vasketrinn. Mellom første og andre vasketrinn behandles membranen med DNase I (RNFD) for å fjerne spor av bundet DNA. Etter vasketrinnene elueres RNA i elueringsbuffer (BR5) og varmedenatureres. Total RNA som renses med PAXgene Blood RNA-system er meget ren. Med den manuelle protokollen er A 260 /A 280 -verdier mellom 1,8 og 2,2, og 1 % (w/w) genom DNA finnes i 95 % av alle prøver, som målt med kvantitativ, sanntids- PCR av en sekvens av beta-actin-genet. Minst 95 % av prøvene viser ingen hemming i RT-PCR, ved bruk av opptil 30 % av eluatet. Med den manuelle protokollen er gjennomsnittlig prøveklargjøringstid (basert på data fra 12 prøveklargjøringer) ca. 90 minutter, med bare 40 minutter praktisk arbeidtid. RNA-resultat fra 2,5 ml friskt humant fullblod er 3 μg for 95 % av prøvene som er behandlet. Siden resultater er sterkt donoravhengige, kan individuelle resultater variere. For individuelle donorer gir PAXgene Blood RNA-systemet meget reproduserbare og repeterbare resultater (Figurer 5 og 6, side 20 og 21) og reproduserbar og repeterbar RT-PCR (Figur 7 og 8, side 23 og 25), og gjør resultatet svært robust for kliniske diagnostiske tester. Figur 5 indikerer den generelle repeterbarheten og reproduserbarheten av PAXgene Blood RNA-systemet. Flere studier ble utført for å vise påvirkningen av forskjellige PAXgene Blood RNA-pakkepartier og forskjellige operatører på reproduserbarheten av RNA-resultater og sanntids-rt-pcr-ytelse. Da samlinger av blodprøver ble brukt i stedet for individuelle PAXgene Blood RNA-rør (BRT) for disse studiene, avspeilte ikke resultatene systemets repeterbarhet, inkludert svingning mellom individuelle blodprøver, men bare repeterbarheten av prøveklargjøringen (se Figur 6). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

20 Reproduserbar og repeterbar RNA-rensing Donor Gjennomsnittlig RNA-mengde (μg/2,5 ml blod) RNA mengde (μg/2,5 ml blod) Donor Figur 5 Firedoble blodprøver fra 14 donorer ble behandlet manuelt av hver av 3 teknikere (A, B, C). Tre sett med utstyr ble brukt, og alle prøver tilberedt av én tekniker ble behandlet med det samme utstyret. Middeltall og standardavvik av RNA-resultater per replikate prøver fra de samme donorene og forskjellige teknikere vises. Tolv replikate blodprøver fra hver av 14 donorer ble behandlet av de 3 forskjellige teknikerne. Middeltall og standardavvik av RNA-resultater per prøver fra de samme donorene og alle teknikere vises. For alle RNA-prøver, varierte A 260 /A 280 -forhold fra 1,8 til 2,2. 20 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

21 Repeterbarhet og reproduserbarhet av RNA-resultatet for forskjellige operatører og PAXgene Blood RNA Kit som bruker samlede blodprøver Donor-pool CV av RNA mengde (%) RNA mengde (μg/2,5 ml blod) Donor Figur 6 Blodprøver fra 30 forskjellige donorer ble samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT), 12 rør per donor, totalt 36 rør. Innholdet i rørene fra 3 donorer ble samlet og deretter alikvotert på nytt til 36 prøver. Disse 36 prøvene per 3 donor-pool ble behandlet manuelt av 3 forskjellige operatører. Hver operatør brukte 3 forskjellige PAXgene Blood RNA Kit-partier for å trekke ut og behandle kvadruplikate prøver fra hver av de 10 donor-poolene. RNAresultat og standardavvik for hver operatør-parti-kombinasjon. Kvadruplikate blodprøver fra 10 donor-pool ble behandlet av 3 forskjellige operatører (A, B, C) med hver av 3 kit-parti (1, 2, 3). Middelresultatene (kolonnene) og standardavvikene (feilsøyler) per kvadruplikate prøve fra den samme donorpoolen for forskjellige operatør og forskjellige kit-lot presenteres. CV for RNA-resultat per donorpool for alle operatør-parti-kombinasjoner (A, B, C, 1, 2, 3) som beregnet fra middelresultatet og standardavviket for resultatet vises i Figur 6A. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

22 Tabell 1A. Reproduserbarhet innen hvert parti (Lot) og hver bruker Kombinert data Lot 1, bruker A Donorpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 8,03 SD (μg) 0,42 CV (%) 5 Donorpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 9,55 SD (μg) 0,99 CV (%) 10 Donorpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,52 SD (μg) 0,41 CV (%) 6 Lot 1, bruker B 7,98 1, ,38 1, ,82 1,72 19 Lot 1, bruker C 7,87 0, ,71 0, ,14 1,46 14 Lot 2, bruker A 7,32 0, ,78 1, ,92 0,27 4 Lot 2, bruker B 6,09 1, ,82 2, ,20 0,71 10 Lot 2, bruker C 6,87 0, ,37 0,74 7 9,14 1,52 17 Lot 3, bruker A 7,04 0, ,96 0,68 8 8,18 0,76 9 Lot 3, bruker B 6,98 1, ,73 0, ,41 0,88 14 Lot 3, bruker C 8,78 0, ,59 1, ,78 0,56 5 Tabell 1B. Reproduserbarhet innen hver bruker og mellom alle partier (Lots) Kombinert data Bruker A, alle lots Donorpool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,46 SD (μg) 0,85 CV (%) 11 Donorpool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 9,43 SD (μg) 1,22 CV (%) 13 Donorpool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,54 SD (μg) 0,72 CV (%) 10 Bruker B, alle lots 7,02 1, ,98 2, ,48 1,50 20 Bruker C, alle lots 7,84 0, ,56 1, ,02 1,34 13 Donor pool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,96 SD (μg) 0,49 CV (%) 6 8,90 0, ,22 1, ,63 1, ,00 0, ,56 1, ,85 0, ,88 2, ,88 0,37 3 Donorpool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,81 SD (μg) 0,82 CV (%) 11 8,26 1, ,89 1, Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

23 Tabell 1C. Reproduserbarhet innen hvert parti (Lot) og mellom alle brukere Kombinert data Lot 1, alle brukere Donor pool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,96 SD (μg) 0,69 CV (%) 9 Donor pool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 9,88 SD (μg) 1,34 CV (%) 14 Donor pool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 8,83 SD (μg) 1,63 CV (%) 19 Donor pool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 9,02 SD (μg) 1,27 CV (%) 14 Lot 2, alle brukere 6,76 0, ,99 1, ,75 1, ,73 2,31 26 Lot 3, alle brukere 7,60 1, ,09 1, ,46 1, ,20 1,80 20 Tabell 1D. Reproduserbarhet mellom alle partier (Lots) og brukere Kombinert data Alle lots og alle brukere Donor pool 1 5,1 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 7,44 SD (μg) 1,09 CV (%) 15 Donor pool 6 6,5 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 9,66 SD (μg) 1,65 CV (%) 17 Donor pool 9 8,4 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 8,35 SD (μg) 1,70 CV (%) 20 Donor pool 10 10,2 x 10 6 celler/ml Middels mengde (μg) 8,99 SD (μg) 1,80 CV (%) 20 Detaljert analyse av 4 representative donorpool. Valg av poolene var basert på leukocyttantallet og reflekterte øvre, mellomste og nedre verdiene for normalområdet for leukocyttantall (4,8 x ,1 x 10 7 leukocytter/ml). Leukocyttantallet representerer gjennomsnittet for 3 leukocyttellinger fra 3 donorer per donorpool. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

24 Reproduserbarheten av RT-PCR mellom brukere Bruker Bruker Figur 7 RNA renset i eksperimentet beskrevet i Figur 6 ble brukt i sanntids-rt-pcr. Relative transkriptnivåer av FOS og IL1B ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR med 18S rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet inn, i forhold til verdiene for bruker 1 (10 donorpool x 3 kit-parti x 4 replikater = 120 datasett for hvert gen), med middelverdier (røde linjer) og standardavvik (svarte søyler) for alle prøve som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 24 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

25 Reproduserbarheten av RT-PCR mellom Kit-parti Parti Parti Figur 8 RNA renset i eksperimentet beskrevet i Figur 6 ble brukt i sanntids-rt-pcr. Relative transkriptnivåer av FOS og IL1B ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR med 18S rrna som intern standard. Verdiene for alle prøver er plottet inn, i forhold til verdiene for kit-parti 1 (10 donorpool x 3 brukere x 4 replikater = 120 datasett for hvert gen), med middelverdier (røde linjer) og standardavvik (svarte søyler) for alle prøve som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

26 Tabell 2. Sammendrag av RT-PCR-data fra figurer 7 og 8 Testsystem Sammenligning av data FOS/18S rrnaanalyse Middel ( C T ) ±SD ( C T ) IL1B/18S rrnaanalyse Middel ( C T ) ±SD ( C T ) Reproduserbarhet innen hver bruker og mellom alle partier Alle brukere, parti 1 parti 1 Alle brukere, parti 2 parti 2 Alle brukere, parti 3 parti 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Reproduserbarhet innen hver parti og mellom alle brukere Alle parti, bruker A bruker A Alle parti, bruker A bruker B Alle parti, bruker A bruker C 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 0,44 0,06 0,69 0,31 0,60 0,05 0,71 Bruker: Tekniker, utførte studien. Parti: Nummer på kitparti som er brukt i denne studien. SD: Standardavvik. Middel C T -verdier (N = 120) og standardavvik vises for data som presenteres i Figur 7 og Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

27 Automatisk RNA-rensing Prøveklargjøring med QIAcube følger de samme trinnene som den manuelle prosedyren, slik at du kan fortsette å bruke PAXgene Blood RNA Kit for å rense RNA av høy kvalitet. Se brukerhåndboken for QIAcube og for mer informasjon om QIAcube. Den automatiske RNA-rensingsprotokollen består av 2 deler (eller protokoller), PAXgene Blood RNA Del A og PAXgene Blood RNA Del B, med en kort manuell intervensjon mellom de 2 delene. Den sentrifugerte, vaskede og resuspenderte nukleinsyrepelleten (se RNAkonsentrasjon og -rensing, side 16) overføres fra PAXgene Blood RNA Tube (BRT) i reagensrør, som settes i termo/rysterenheten på QIAcube-arbeidsbordet. Operatøren velger og starter PAXgene Blood RNA Del A -protokollen fra menyen. QIAcube utfører trinnene i protokollen frem til eluering av RNA i elueringsbufferen (BR5). Operatøren overfører mikrosentrifugerørene som inneholder renset RNA i termo/rysterenheten til QIAcube. Operatøren velger og starter PAXgene Blood RNA Del B -protokollen fra menyen, og varmedenatureringen utføres av QIAcube. Gjennomsnittlig prøveklargjøringstid (basert på data fra 12 prøveklargjøringer) ca. 125 minutter, med bare 20 minutter praksistid. RNA-resultat fra 2,5 ml friskt humant fullblod er 3 μg for 95 % av prøvene som er behandlet. Figur 9 viser RNA-resultatene fra totalt 288 prøver klargjort med den automatiske protokollen med 3 kit-parti av 3 operatører. Da poolede blodprøver ble brukt til disse studiene i stedet for individuelle PAXgene Blood RNA-rør, viser ikke resultatene RNA-resultatet som er forventet av enkeltprøver fra individuelle blodprøver. Siden resultater er sterkt donoravhengige, kan individuelle resultater variere (Figur 9). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

28 RNA-resultat Automatisk behandling RNA mengde (μg/2,5 ml blod) Figur 9 Blodprøver fra 48 forskjellige donorer ble samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT, 6 rør per donor, totalt 288 rør). Innholdet i rørene fra 6 donorer ble samlet og deretter alikvotert på nytt til 36 prøver. Disse 36 prøvene per 6 donor-pool ble behandlet av 3 forskjellige operatører (A, B, C). Hver operatør brukte 3 forskjellige parti (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit for å trekke ut og behandle kvadruplikate prøver fra hver av de 8 donor-poolene. RNA-resultater av alle individuelle prøver vises for hver operatør-parti-kombinasjon. Minst 95 % av prøvene viser ingen hemming i RT-PCR, ved bruk av opptil 30 % av eluatet. Krysskontaminasjon mellom prøvene kan ikke detekteres med den automatiske protokollen, målt med kvantitativ, sanntids-rt-pcr av sekvensene av betaglobin og FOS-transkripter i RNA-negative prøver (vann) paret med RNA-positive prøver (humant fullblod) i samme kjøring. RNA renset med PAXgene Blood RNA System og den automatiske protokollen er meget ren, som vist av manglende RT-PCR-hemming (se ovenfor) og A 260 /A verdier mellom 1,8 og 2,2. Genomt DNA finnes i 1 % (w/w) i 95 % av alle prøver, målt med kvantitativ, sanntids-pcr for en sekvens av beta-actin-genet. Figur 10 og 11 viser A 260 /A 280 -verdiene-og det relative genome DNA av totalt 288 prøver klargjort med den automatiske protokollen med 3 kit-partier av 3 operatører. 28 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

29 RNA-renhet (A 260 /A 280 -verdier) Automatisk behandling Figur 10 RNA ble renset av 3 forskjellige operatører (A, B, C) med 3 forskjellige partier (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit i eksperimentet beskrevet i Figur 9. A 260 /A 280 -verdiene av alle individuelle prøver vises for hver operatørparti-kombinasjon. RNA-renhet (% Genom DNA-kontaminasjon) Automatisk behandling Genom-DNA (v/v) (%) RNA renhet (A 260 /A 280 ) Figur 11 RNA ble renset av 3 forskjellige operatører (A, B, C) med 3 forskjellige partier (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit i eksperimentet beskrevet i Figur 9. Genome DNA-mengder (w/w) i alle individuelle prøver vises for hver operatør-parti-kombinasjon. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

30 Den automatiske protokollen av RNA-rensing med PAXgene Blood RNA System gir meget lett reproduserbare og repeterbare RT-PCR-resultater, som vist i Figur 12, og gjør resultatet meget robust for kliniske diagnostiske tester. Reproduserbarheten av RT-PCR mellom automatiske og manuelle protokoller Figur 12 RNA ble renset av 3 forskjellige operatører (A, B, C) med 3 forskjellige partier (1, 2, 3) av PAXgene Blood RNA Kit med den automatiske protokollen i eksperimentet beskrevet i Figur 9. Parallelt, ble RNA renset fra tilsvarende replikatrør med den manuelle protokollen. Relative transkriptnivåer av FOS og IL1B ble bestemt i sanntid, dupleks RT-PCR med 18S rrna som intern standard. Mulige forskjeller i transkriptnivåer mellom RNA klargjort fra parede blodprøver med begge ekstraksjonsprotokoller (automatisk og manuell protokoll) ble beregnet med C T - metoden. Individuelle C T -verdier for alle prøvepar (4 replikater x 8 donorpool x 3 kit-partier x 3 operatører = 288 par for hvert gen) plottes som enkeltprikker med middelverdier (større prikker) og standardavvik (svarte søyler) for alle prøver som vises. De stiplede linjene viser ±3x total presisjon av analysen (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 30 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

31 Utstyr og reagenser som bruker må sørge for Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangsfrakk og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende HMS-datablad (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. For alle protokoller PAXgene Blood RNA-rør (BRT; kat. nr ) Etanol ( %, renhetsgrad p.a.) Pipetter* (10 μl 4 ml) Steril, aerosolbarriere, RNase-frie pipettespisser Gradert sylinder Sentrifuge* som kan oppnå x g, og er utstyrt med en svingbar rotor og beholdere for PAXgene Blood RNA-rør (BRT) Vorteks-blander* Knust is Permanent penn for merking For den manuelle protokollen Mikrosentrifuge* med variabel hastighet som kan oppnå x g, og er utstyrt med en rotor for 2 ml mikrosentrifugerør Ryster/inkubator* som kan inkubere ved 55 C og 65 C og ryste ved 400 opm, ikke over 1400 opm (for eksempel, Eppendorf Thermomixer Compact eller tilsvarende) For den manuelle protokollen QIAcube* (QIAGEN, kat. nr [110 V], kat. nr [230 V]) QIAcube-forbruksvarer Filterspisser, 1000 μl (1024) (QIAGEN, kat. nr ) Reagensflasker, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. nr ) Rotoradaptere (10 x 24) (QIAGEN, kat. nr ) * Pass på at instrumentene er sjekket, vedlikeholdt og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens anbefalinger. Pass på at du er godt kjent med retningslinjene for håndtering av RNA (Vedlegg A, side 54). For tilsetning av etanol til Buffer BR4-konsentrat. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

32 QIAcube-tilbehør Reagensflaskestativ (QIAGEN, kat. nr ) Rotoradapterholder (QIAGEN, kat. nr ) Saks Viktige merknader Bruke QIAcube Sørg for at du er kjent med bruken av QIAcube. Les QIAcube-brukerhÝndboken og eventuell tilleggsinformasjon som er levert med QIAcube, og vær spesielt oppmerksom på sikkerhetsinformasjon, før du starter de automatiske PAXgene Blood RNA-protokollene. Starte QIAcube Lukk døren til QIAcube, og slå på QIAcube med strømbryteren (se Figur 13). En pipelyd avgis og oppstartskjermbildet vises. Instrumentet utfører initialiseringstester automatisk. Installere protokoller på QIAcube En protokollinstallasjon må først utføres før den første RNA-forberedende kjøringen på QIAcube kan utføres. Installer både PAXgene Blood RNA Del A og PAXgene Blood RNA Del B -protokollene. Protokoller fås på og må lastes ned til USB-pinnen som leveres sammen med QIAcube og overføres til QIAcube via USB-porten. Med USB-porten som sitter bak frontpanelet (se Figur 13), kan QIAcube kobles til en USB-pinne (leveres med QIAcube). Datafiler, f.eks. loggfiler eller rapportfiler, kan også overføres via USB-porten fra QIAcube til USB-pinnen. USB-porten er kun til bruk med USB-pinnen som er levert av QIAGEN. Ikke koble andre enheter til denne porten. Ikke ta ut USB-pinnen når du laster ned protokoller eller overfører datafiler eller under en protokollkjøring. Også inkludert i startpakken, QIAcube (QIAGEN, kat. nr ). 32 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

33 QIAcube sett forfra Figur 13 Berøringsskjerm Dør RS232-serieporten bak panelet (kun til bruk av QIAGEN instrumentservicespesialister) USB-port bak panelet Strømbryter Avfallsskuff Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

34 Laste QIAcube For å spare tid, kan lasting utføres under ett eller begge 10-minutterstrinn (trinn 3 og 5) i Protokoll: Automatisk rensing av total RNA fra humant fullblod samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT), side 47. Reagensflasker Fyll 4 QIAcube-reagensflasker forsiktig med reagensene som står i Tabell 3 (fyll flaskene opp til indikatornivået på reagensflaskene). Merk flaskene og lokkene tydelig med buffernavn og sett i riktig posisjon i reagensflaskestativet (se Figur 14 og 15). Før hver kjøring på QIAcube, pass på at reagensflaskene er fylt opp til indikatornivåene (restvolumer i de originale kit-bufferflaskene skal brukes til å fylle reagensflaskene). Plasser reagensstativet med fylte reagensflasker på QIAcube-arbeidsbordet som vist (Figur 14 og 15). Pass på at lokkene fjernes fra flaskene før de settes på arbeidsbordet. Buffervolumer som er gitt i PAXgene Blood RNA Kit (50) er nok for maks. 7 kjøringer av RNA-preparater på QIAcube. Flere kjøringer med få prøver skal unngås for at det skal være nok buffervolumer for behandling av alle 50 prøvene. Tabell 3. Posisjoner i reagensflaskestativet Posisjon Reagens 1 Bindende buffer (BR2) % etanol 3 Vaskebuffer 1 (BR3) 4 Vaskebuffer 2 (BR4)* 5 (la stå tomt) 6 (la stå tomt) * Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som konsentrat. Før førstegangsbruk, tilsett 4 volumer etanol ( %, renhetsgrad p.a.) som vist på flasken for å oppnå en arbeidsløsning). 34 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

35 Laste reagensflaskestativet Posisjon 1 Bindebuffer (BR2) Posisjon % etanol Etikett Posisjon 3 Vaskebuffer 1 (BR3) Posisjon 4 Vasksbuffer 2 (BR4) Etikett Posisjon 5 Posisjon 6 Tom Tom Figur 14 Oversikt over posisjoner og innhold i flaskene i reagensflaskestativet. Laste stativet på QIAcube. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

36 QIAcube sett innenfra Figur 15 Sentrifugelokk Sentrifuge Ryster Reagensflaskestativ Spiss-sensor Plasser for mikrosentrifugerør Spiss-stativer Engangsplasser for spisser og søyler Robotarm 36 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

37 Spinn-søyler (PRC, PSC), mikrosentrifugerør (MCT) og QIacube-plastvare Sett 2 spisstativer fylt med filterspisser 1000 μl i QIAcube (se Figur 15). Fyll på stativene med spisser ved behov. Bruk bare 1000 μl filterspisser utviklet til bruk med QIAcube. Merk rotoradaptere og mikrosentrifugerør (MCT) for hver prøve med permanent penn. Åpne PAXgene Shredder spinn-søyler (PSC) som skal brukes, og klipp toppene helt av med saks (se Figur 16). For riktig bruk av QIAcube robotgrep, ta helt av (klipp av) toppene og alle plastdeler som kobler lokket til PAXgene Shredder spinn-søyler (PSC, se Figur 16). Ellers kan ikke robotgrepet ta tak i spinn-søylene (PSC, PRC) på riktig måte. Last PAXgene RNA spinn-søylen (PRC), PAXgene Shredder spinn-søylen (PSC, uten lokk) og merket mikrosentrifugerør (MCT) i riktige posisjoner i hver merkede rotoradapter som vist i Tabell 4 og Figur 17 (side 50). Pass på at spinn-søylen (PRC) og mikrosentrifugerørlokkene (MCT) er trykt helt ned i bunnen av plassene på kanten av rotoradapteren, ellers vil de brekkes av under sentrifugering. Laste en PAXgene Shredder spinn-søyle (PSC) Søylens (PSC) lokk tatt av riktig Søylens (PSC) lokk er tatt av feil, en del av lokket sitter igjen Figur 16 PAXgene Shredder spinn-søylen (PSC) lastes i midtre posisjon. Klipp av toppen før kolonnen lastes (PSC). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

38 Tabell 4. Labware i rotoradapteren Posisjon Labware Lokkposisjon 1 PAXgene RNA spinn-søyle (rød, PRC) L1 2 PAXgene Shredder spinn-søyle (lilla, PSC) (klipp av toppen før den plasseres i rotoradapteren) 3 Mikrosentrifugerør (MCT)* L3 * Bruk mirkosentrifugerørene (1,5 ml, MCT) som er inkludert i PAXgene Blood RNA Kit. Figur 17 Rotoradapteren har tre rørposisjoner (1-3) og tre lokkposisjoner (L1-L3). Laste sentrifugen Last de monterte rotoradapterne i sentrifugebeholderne som vist i Figur 18. Ved behandling av færre enn 12 prøver, pass på at du laster sentrifugerotoren balansert radialt (se Figur 19). Alle sentrifugebeholdere må monteres før en protokoll kjøres, selv om det skal behandles færre enn 12 prøver. Én enkelt prøve eller 11 prøver kan ikke behandles. Laste sentrifugen Figur 18 Last de monterte rotoradapterne i sentrifugebeholderne. 38 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

39 Laste sentrifugen og rysteren 2 prøver 3 prøver 4 prøver 5 prøver 6 prøver 7 prøver 8 prøver 9 prøver 10 prøver Figur 19 Sentrifuge- og rysterposisjoner vises for behandling fra to (2) til ti (10) prøver. Én eller 11 prøver kan ikke behandles. Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

40 Reagensrør (PT) Ta ut reagensrør (PT) som sitter igjen i mikrosentrifugerørplassene fra tidligere kjøringer (se Figur 15, side 36). Fyll 3 behandlinsgrør (PT) med mengden reagenser som står i Tabell 5. Merk rørene (PT) tydelig med reagensnavnene og plasser dem i riktig posisjon i mikrosentrifugerørplassene, som indikert i Tabell 6. Pipeter det indikerte volumet av DNA-fordøyelsesbufferen (RDD) i et reagensrør (PT), og legg til indikert volum av DNase I (RNFD) stockløsning. Bland ved å pipettere forsiktig hele blandingen opp og ned 3 ganger med en 1000 μl pipettespiss. Bruk 2 ml-reagensrørene (PT) som er inkludert i PAXgene Blood RNA Kit. Pas på at du bare pipetterer nødvendig volum som indikert i Tabell 5. Tabell 5. Volum av reagenser som kreves i reagensrør for mikrosentrifugerørplassene Antall prøver Volum av reagens som kreves for det indikerte antallet prøver (μl) Proteinase K (PK) DNase I inkubasjonsblanding Elueringsbuffer (BR5) (23 DNase I [RNFD] RDD) (33 DNase I [RNFD] RDD) (42 DNase I [RNFD] RDD) (51 DNase I [RNFD] RDD) (60 DNase I [RNFD] RDD) (69 DNase I [RNFD] RDD) (78 DNase I [RNFD] RDD) (88 DNase I [RNFD] RDD) (97 DNase I [RNFD] RDD) (115 DNase I [RNFD] RDD) 1177 Tabell 6. Plasser i mikrosentrifugerør Innhold Posisjon A B C Proteinase K (PK) DNase I inkubasjonsblanding Elueringsbuffer (BR5) Kar Reagensrør (PT)* Reagensrør (PT)* Reagensrør (PT)* *Bruk 2 ml-reagensrørene (PT) som er inkludert i PAXgene Blood RNA Kit. 40 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

41 Protokoll: Manuell rensing av total RNA fra humant fullblod samlet i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) Viktige poeng før du starter Pass på at esken er intakt og uskadet, og at bufrene ikke har lekket. Ikke bruk en pakke som er skadet. Når du bruker en pipette, pass på at den er stilt til riktig volum og at væsken er forsiktig og fullstendig aspirert og dispensert. For å unngå å overføre prøver til feil rør eller spinn-søyle, pass på at alle rør og spinn-søyler er riktig merket med permanent penn. Merk toppen og hoveddelen av hvert rør (PT, MCT). For spinn-søyler, merk hoveddelen av reagensrøret (PT). Lukk hvert rør eller spinn-søyle etter at væske er overført i den. Hvis prøver og buffere søles under prosedyren, kan det redusere RNAresultat og renhet. Med mindre noe annet er oppgitt, skal alle trinn i denne protokollen, inkludert sentrifugeringstrinn, utføres ved romtemperatur (15-25 C). På grunn av sensitiviteten til nukleinsyreforsterkningsteknologi, er det viktig å følge disse forholdsreglene ved håndtering av prøver for å unngå krysskontaminering: Pipetter prøven forsiktig i spinn-søylen (PRC, PSC) uten å fukte kanten på søylen. Skift alltid pipettespissene ut mellom væskeoverføringer. Bruk pipettespisser med aerosolbarriere. Unngå å komme i kontakt med spinn-søylemembranen (PRC, PSC) med pipettespissen. Etter rysting eller oppvarming av et mikrosentrifugerør (MCT), sentrifuger kort for å fjern dråpene fra innsiden av lokket. Bruk hansker gjennom hele prosedyren. Bytt hansker straks hvis de kommer i kontakt med prøven. Lukk spinn-søylen (PRC, PSC) før den legges i mikrosentrifugen. Sentrifuger som beskrevet i prosedyren. Åpne bare én spinn-søyle (PRC, PSC) om gangen, og vær forsiktig så du unngår å generere aerosoler. For effektiv parallell behandling av flere prøver, fyll et stativ med reagensrør (PT) som spinn-søylene (PRC, PC) kan overføres til etter sentrifugering. Kast de brukte reagensrørene (PT) som inneholder Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

42 gjennomstrømning, og legg de nye reagensrørene (PT) som inneholder spinn-søyler (PRC, PSC) direkte i mikrosentrifugen. Ting du skal gjøre før du starter Blod må samles i PAXgene Blood RNA-rør (BRT) i henhold til instruksjonene i produktskrivet for PAXgene Blood RNA Tube. Om nødvendig, se Vedlegg C (side 57) for anbefalinger om håndtering av PAXgene Blood RNA-rør (BRT). Pass på at PAXgene Blood RNA-rørene (BRT) er inkubert i minst 2 timer ved romtemperatur etter at blodet er tatt for å sikre riktig lyse av blodcellene. Inkubasjon av PAXgene Blood RNA-røret (BRT) over natten kan føre til bedre resultat. Hvis PAXgene Blood RNA-røret (BRT) ble oppbevart ved 2 8 C eller 20 C eller 70 C etter at blodet er tatt, la det først nå romtemperatur og oppbevar deretter ved romtemperatur i 2 timer før prosedyren startes. Les sikkerhetsinformasjonen på side 7. Les retningslinjene om håndtering av RNA (Vedlegg A, side 54). Pass på at instrumentene, som pipetter og ryster/inkubatoren, er sjekket og kalibrert regelmessig i henhold til produsentens anbefalinger. En ryster/inkubator trengs til trinn 5 og 20. Still inn temperaturen på ryster/inkubatoren til 55 C. Bindingsbuffer (BR2) kan denne et presipitat ved oppbevaring. Om nødvendig, varm opp til 37 C for å løse opp. Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som konsentrat. Før førstegangsbruk, tilsett 4 volumer etanol ( %, renhetsgrad p.a.) som vist på flasken for å oppnå en arbeidsløsning). Hvis du bruker RNase-fritt DNase-settet for første gang, klargjør DNase 1 stamløsning. Oppløs det faste DNase I (RNFD; 1500 Kunitz-enheter)* i 550 μl av DNase resuspensjonsbuffer (DRB) som leveres med settet. Pass på at ingen DNase I (RNFD) går tapt når flasken åpnes. Ikke ryst den rekonstituerte DNase I (RNFD). DNase I er spesielt følsom for fysisk denaturering. Blanding skal kun utføres ved forsiktig invertering av røret. * Kunitz-enheter er enhetene som vanligvis brukes til å måle DNase I, definert som mengden av DNase I som fører til en økning i A 260 på 0,001 per minutt per milliliter ved 25 C, ph 5,0, med sterkt polymerisert DNA som substratet (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 og 363). 42 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008

43 Gjeldende data viser at rekonstituert DNase I (RNFD) kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 6 uker. For langsiktig oppbevaring av DNase I (RNFD), fjern stamløsningen fra glassflasken, fordel den i enkelalikvoter (bruk 1,5 mlmikrosentrifugerør [MCT] som følger med pakken. Det er nok til 5 alikvoter) og oppbevar ved 20 C i opptil 9 måneder. Tinte alikvoter kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 6 uker. Ikke frys alikvotene på nytt etter tining. Når du rekonstituerer og alikvoterer DNase I (RNFD), pass på at du følger retningslinjene for håndtering av RNA (Vedlegg A, side 54). Prosedyre 1. Sentrifuger PAXgene Blood RNA-røret (BRT) i 10 minutter ved x g med en svingbar rotor. Pass på at blodprøven har vært inkubert i PAXgene Blood RNA-røret (BRT) i minst 2 timer ved romtemperatur (15 25 C), for å oppnå fullstendig lyse av blodceller. Rotoren må inneholde røradaptere for rør med rund bunn. Hvis andre typer røradaptere brukes, kan rørene knuses under sentrifugering. 2. Fjern supernatanten ved å dekantere eller pipettere. Tilsett 4 ml RNase-fritt vann (RNFW) til pelleten, og lukk røret med en fersk, sekundær BD Hemogard-hette (følger med pakken). Hvis supernatanten er dekantert, pass på så ikke pelleten forstyrres, og tørk av kanten på røret med rent tørkepapir. 3. Ryst til pelleten er synlig oppløst, og sentrifuger i 10 minutter ved x g med en svingbar rotor. Ta av og kast hele supernatanten. Smårester som er liggende igjen etter supernatanten etter rysting, men før sentrifugering, vil ikke påvirke prosedyren. Ufullstendig fjerning av supernatant vil hemme lysen og fortynne lysatet, og derfor påvirke forholdene for binding av RNA til PAXgenmembranen. 4. Tilsett 350 μl resuspensjonsbuffer (BR1) og ryst til pelleten er synlig oppløst. 5. Pipetter prøven i et 1,5 ml mikrosentrifugerør (MCT). Tilsett 300 μl bindingsbuffer (BR2) og 40 μl proteinase K (PK). Bland ved å ryste i 5 sekunder og inkuber i 10 minutter ved 55 C med en ryster/inkubator ved opm. Etter inkubasjon, still inn temperaturen på ryster/inkubatoren til 65 C (for trinn 20). Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/

44 Ikke bland bindingsbuffer (BR2) og proteinase K (PK) sammen før de tilsettes prøven. 6. Pipetter lysatet direkte i en PAXgene Shredder spinn-søyle (PSC; lilla) plassert i et 2 ml reagensrør (PT), og sentrifuger i 3 minutter ved maks. hastighet (men ikke mer enn x g). Pipetter lysatet forsiktig i spinn-søylen (PSC) og sjekk visuelt at alt lysatet er overført til spinn-søylen (PSC). For å forhindre at søylene (PSC) og rørene (PT) skades, ikke overstig x g. Noen prøver kan strømme gjennom PAXgene Shredder spinn-søylen (PSC) uten sentrifugering. Dette skyldes lav viskositet av noen prøver og bør ikke oppfattes som en indikasjon på produktdefekt. 7. Overfør forsiktig hele supernatanten av gjennomstrømningsfraksjonen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør (MCT) uten å forstyrre pelleten i reagensrøret. 8. Tilsett 350 μl etanol ( %, renhetsgrad p.a.) Bland ved rysting, og sentrifuger en kort stund (1-2 sekunder ved x g) for å fjerne dråper fra innsiden av rørlokket. Det må ikke sentrifugeres i mer enn 1-2 sekunder, da dette kan resultere i pelletering av nukleinsyrer og svakere resultat av det totale RNA. 9. Pipetter 700 μl prøve i PAXgene RNA spinn-søylen (PRC; rød) i et 2 ml reagensrør (PT), og sentrifuger i 1 minutt ved x g. Legg spinn-søylen (PRC) i et nytt 2 ml reagensrør (PT), og kast det gamle reagensrøret (PT) som inneholder gjennomstrømningen. 10. Pipetter resten av prøven i PAXgene RNA spinn-søylen (PRC) og sentrifuger i 1 minutt ved x g. Legg spinn-søylen (PRC) i et nytt 2 ml reagensrør (PT), og kast det gamle reagensrøret (PT) som inneholder gjennomstrømningen. Pipetter prøven forsiktig i spinn-søylen (PRS) og sjekk visuelt at prøven er overført helt til spinn-søylen (PRC). 11. Pipetter 350 μl vaskebuffer 1 (BR3) i PAXgene RNA spinn-søylen (PRC). Sentrifuger i 1 minutt ved x g. Legg spinn-søylen (PRC) i et nytt 2 ml reagensrør (PT), og kast det gamle reagensrøret (PT) som inneholder gjennomstrømningen. 12. Tilsett 10 μl DNase I (RNFD) stamløsning til 70 μl DNAfordøyelsesbuffer (RDD) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør (MCT). Blant ved å slå forsiktig på røret, og sentrifuger kort for å samle resterende væske fra sidene av røret. 44 Mediehåndbok for PAXgene Blood RNA Kit 04/2008