Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria

Transkript

1 Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria Dr scient. Cathrine Fladeby Seksjon for utvikling, Ullevål Avdeling for mikrobiologi Oslo universitetssykehus

2 Leishmaniasis

3 WHO, Control of the leishmaniases

4 Dagens diagnostikk Dyrkning Mikroskopi kinetoplast kjerne CDC Centers for Disease Control and Prevention Leishmania real-time PCR for mer sensitiv påvisning av Leishmaniasis for artsidentifikasjon

5 Prøver Biopsi (10 20 mg) Benmargsaspirat (200 µl med EDTA) Fullblod (350 µl med EDTA) EZ1 Biorobot (Qiagen) Analyse 1. Påvisning av Leishmania genus (påvist/ikke påvist) 2. Artsidentifikasjon

6 1. Påvisning av Leishmania genus real-time PCR med 18S rdna som target kopier/genom Primere: Foulet et al JCM (45) p produkt: 149 bp probe: hydrolyse-probe (TaqMan) med fluorochrome

7 positiv prøve positiv kontroll negativ prøve/negativ kontroll Tidsbruk: Biopsi: 3 timer + 15 min + 1 time 40 min = ca 5 timer Benmargsaspirat/blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer

8 Deteksjonsgrense 10 fg DNA/PCR-reaksjon (L.major) < 1 parasitt/pcr-reaksjon 3-10 parasitter i prøve Interferens Ingen kryssreaksjon med Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Mycobacterium intracellulare Mycobacterium avium complex Mycobacterium tuberculosis complex Staphylococcus aureus Plasmodium falciparum

9 2. Artsidentifikasjon real-time PCR med Hsp70 som target sekvensering Primere: Van der Auwera et al Euro Surveill. 18 (30)

10 Sekvensanalyse og typing 203 referansesekvenser ( Genbank (NCBI)

11 Positive kliniske prøver (2015) Prøve Smittested Materiale Ct 18S PCR Sekvensering Hsp70 1 Belize biopsi, hud 22,68 L.mexicana 2 Belize biopsi, hud 24,25 L.braziliensis 3 Belize biopsi, hud 26,4 L.naiffi (99%) 4 Belize biopsi, hud 25,81 L.mexicana 5 Israel biopsi, hud 30,5 L.major 6 Spania benmargsaspirat 33,5 L.infantum 7 Spania benmargsaspirat 35,18 L.infantum 8 Peru biopsi, hud 20,99 L.braziliensis Referansemateriale Species (ATCC) Materiale Ct 18S PCR Sekvensering Hsp70 L.donovani DNA, 2 ng/µl 16,3 L.donovani L.major DNA, 2 ng/µl 15,6 L.major L.infantum DNA, 2 ng/µl 17,9 L.infantum L.braziliensis cellekultur 21,2 L.panamensis L.mexicana cellekultur 24,2 L.mexicana L.donovani cellekultur 20,7 L.donovani

12 P.falciparum P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi CDC Centers for Disease Control and Prevention

13 Dagens diagnostikk Mikroskopi Hurtigtest Malaria real-time PCR forbedre sensitivitet og spesifisitet av malariadiagnostikk verifisere mistenkte og påviste tilfeller av malaria usikker artsbestemmelse ved mikroskopi og hurtigtest klinisk mistanke tross negativ mikroskopi og hurtigtest Prøver Fullblod (350 µl) EZ1 Biorobot (Qiagen)

14 Primere og prober Art Target Amplikon lengde Probemodifikasjon Publikasjon P.vivax AMA1 (apical membrane antigen-1) 157 bp VIC MGB-NFQ Reller et al. (2013) JCM 51 P.ovale plasmepsin 4 81 bp 6-FAM MGB-NFQ Reller et al. (2013) P.malariae plasmepsin bp VIC MGB-NFQ Reller et al. (2013) P.knowlesi plasmepsin 117 bp 6-FAM MGB-NFQ Reller et al. (2013) Human kontroll ACTB HEX BBQ Reller et al. (2013) P.falciparum Cytochrome b (mitokondrie-dna) 240 bp 6-FAM LNA BBQ Farrugia et al. (2011) JCM 49 P.genus Cytochrome b (mitokondrie-dna) 203 bp 6-FAM LNA BBQ Farrugia et al. (2011)

15 Deteksjonsgrense Mikroskopi: 100 parasitter/µl blod (5-50 parasitter/µl blod) BINAX NOW ICT test: P.falciparum >100 parasitter/µl blod P.vivax >1000 parasitter/µl blod (Farcas et al Am J Trop Med Hyg) CareStart Malaria HRP-2/pLDH (Pf/pan) Combo Test: Sensitivity: P.falciparum 88,8%, P.vivax 77,6%, P.ovale 18,4%, P.malariae 30,4% (Maltha et al Malaria J) Real-time PCR: P.fal: 0,06 parasitter/µl blod (20 parasitter/350 µl blod) P.vivax: < 5 parasitter/µl blod Interferens: Ingen kryssreaksjon med Toxoplasmose gondii, E.coli, S.aureus, L.infantum, L.donovani

16 Oppsett 1. for verifisering av påvist Malaria Mix 1: P.fal Mix 2: P.vivax + P.knowlesi Mix 3: P.ovale + P.malariae 2. for påvisning av mistenkt Malaria Mix 1-3 Mix 4: P.genus Mix 5: ACTB Stratagene Mx3005P

17 Tidsbruk: Blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer

18 Resultat validering 39 positive prøver fra infeksjonsmedisin Ullevål (mikroskopi+hurtigtest) P.fal P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi benign Sum Mikroskopi vår PCR Resultat Resultat PCR (Ct) Resultat Prøve Mikroskopi P.fal P.viv P.ova P.mal P.kno sekvensering 1 P.malariae? No Ct No Ct 35 No Ct No Ct P.ovale 3 P.malariae? No Ct 25,08 No Ct No Ct No Ct P.vivax 6 benign 21,2 No Ct No Ct No Ct No Ct P.fal 9 P.malariae? No Ct 25,87 No Ct No Ct No Ct P.vivax 11 P.fal 18,46 No Ct 36,19 No Ct No Ct P.fal 25 P.vivax No Ct No Ct 26,93 No Ct No Ct P.ovale

19 Samarbeidspartnere Avdeling for mikrobiologi, Ullevål Fagbioingeniør Gunilla Løvgården Spesialbioingeniør Hilde Kleven Overlege Lumnije Dedi Overlege Fredrik Müller Infeksjonsmedisinsk avdeling, Ullevål Fagbioingeniør Mette Sannes Overlege Frank Olav Pettersen Overlege Mogens Jensenius