Oversikt over kap.10. Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet. Splitt og overvinn strategien imøtekommer de fleste utfordringer

Transkript

1 Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylær analyse Oversikt over kap.10 Utfordringer og strategier ved genomanalyse Genomstørrelse Egenskaper må også analyseres Problemer med DNA polymorfismer Utvikling av hel-genom kart Innsikt kommer fra fullstendig genomsekvensering Antall og type gener Grad av repeterte sekvenser Genom organisering og struktur Evolusjon og lateral genoverføring Høyeffektive verktøy for å analysere genomer og deres proteinprodukter DNA sekvensatorer DNA arrays (mikromatriser) Massespektrofotometere Høgskolen i Oslo Genomene til levende organismer varierer enormt i størrelse Genomikere ser på to hovedtrekk ved genomer: sekvens og polymorfisme Hovedutfordring å bestemme sekvensen til hvert kromosom i genomet og identifisere mange polymorfismer Hvordan kan man sekvensere et 500 Mb kromosom med 600 bp på en gang? Hvor nøyaktig skal en genomsekvens være?» DNA sekvenseringsfeil er på omkring 1% per 600 bp Hvordan kan en skille sekvensfeil fra polymorfismer?» Forekomst av polymorfismer i diploide humane genomer er omkring 1 av 500 bp Gjentatte sekvenser kan være vanskelige å plassere Uklonbart DNA kan ikke sekvenseres» Opp til 30% av genomet er heterokromatisk DNA som ikke kan klones Splitt og overvinn strategien imøtekommer de fleste utfordringer Kromosomer blir brutt ned i små overlappende biter og klonet Endene til klonene blir sekvensert og satt sammen til de opprinnelige kromosomtrådene Hvert stykke blir sekvensert mange ganger for å redusere feilmarginen 10-gangers sekvensdekning gir en feilmargin på mindre enn1/ Fig

2 Teknikker for kartlegging og kloning Kloning Bibliotek med DNA fragmenter på 500 1,000,000 bp Innskudd inn i diverse vektorer Hybridisering Lokalisering av spesielle DNA sekvenser innen biblioteket av fragmenter PCR oppformering Direkte oppformering av et spesielt område som spenner over fra 1 bp to > 20kb DNA sekvensering Automatisert DNA sekvensering som bruker Sanger metoden, bestemmer sekvenser på opptil 600 bp på en gang Dataassistert verktøy Programmer for å identifisere sammentreff mellom en spesiell sekvens og en stor populasjon av tidligere sekvenserte fragmenter Programmer for å identifisere overlapp av DNA fragmenter Programmer fro å estimere feilmargin Programmer for å identifisere gener i kromosomale sekvenser Lage storskala koblingskart Typer av DNA polymorfismer brukt til storskala kartlegging Single nukleotide polymorfismer (SNPs) 1/500 1/1000 bp gjennom genomet Enkle (Simple) sekvens repetisjoner (SSRs) 1/20-1/40 kb gjennom genomet 2-5 nukleotides blir repetert 4-50 eller flere ganger De fleste SNP'er og SSR'er har liten eller ingen effekt på organismen Fungerer som DNA markører gjennom kromosomene Må være i stand til å raskt identifisere og analysere populasjoner fra 100vis til 1000vis av individer Fig Genetiske markører identifiserer hele genomer De første genetiske kart brukte SSR'er som er høyt polymorfe Identifisert ved screening av DNA biblioteker med SSR prober Oppformert ved PCR og lengdeforskjeller analysert SNP'er millioner flere i det siste identifisert ved sammenligning av ortologe områder av cdna kloner fra ulike individer Homologer gener med tilstrekkelig sekvenslikhet til å være beslektet til en viss grad i evolusjonshistorien Ortologer gener i to forskjellige arter som oppsto fra det samme genet i de to artenes felles stamfar Paraloger oppsto ved duplisering innen sammen art Ortologe gener er alltid homologe, men homologe gener er ikke alltid ortologe SNP er og SSR er ved genom dekning Inntil nylig ble kart konstruert fra omkring 500 SSR er jevnt spredd tvers gjennom genomet (1 SSR for hver 6 Mb) SNP er gir mer enn 500,000 DNA markører tvers gjennom genomet Typing av genetiske markører over hele Genomet To trinns analyse for enkle sekvens repetisjoner PCR oppformering Størrelses separasjon Fig

3 Langtrekkende fysiske kart: karyotyper og genomiske bibliotek posisjonerer markører på kromosomene Fysiske kart Overlappende DNA fragmenter ordnet og orientert over hele spennet av kromosomene Basert på direkte analyse av DNA istedet for rekombinasjon som koblingskart er basert på Kartlegger virkelig antall bp, kb, eller Mb som skiller et lokus fra sine naboer Koblings- kontra fysiske kart» 1 cm = 1 Mb i mennesker»1 cm= 2 Mb i mus Vektorer brukt til å klone store inskudd til fysisk kartlegging YAC er (yeast artificial chromosomes) Innskudd størrelse 100-1,000,000 Mb BAC er (bacterial artificial chromosomes) Innskudd størrelse kb Mer stabile og lettere å rense fra verts DNA enn YAC er Hvordan bestemme rekkefølgen av kloner gjennom genomet Overlappende innskudd hjelper til med å sette sammen klonede fragmenter Ovenfra og ned tilnærming innskudd blir hybridisert mot karyotype av hele genomet Nedenfra og opp tilnærming overlappende sekvenser av titusenvis av kloner bestemmes ved restriksjonsseteanalyse eller sekvensmerkede (tag) seter (STS er) Human Karyotype (a) Fullstendig sett med humane kromosomer farget med Giemsa fargestoff viser bånd (b) Ideogrammer viser idealiserte båndmønstre Fig a Kromosom 7 ved tre oppløsningsnivåer FISH protokoll for ovenfra og ned tilnærming Fig b 3

4 DNA hybridisering og restriksjonskartlegging en nedenfra og opp tilnærming Fig Identifisering og isolering av ett sett med overlappende fragmenter fra et bibliotek To tilnærminger Koblingskart brukes til å utvikle fysiske kart» Sett av markører mindre enn1 cm fra hverandre» Bruk markører til å gjenfinne fragmenter fra biblioteker ved hybridisering» Konstruer kontiger to eller flere delvis overlappende klonede fragmenter» Kromosomvandring ved å bruke ender av usammenhengende kontiger til å probe fragmenter i ukartlagte områder Fysiske kartleggingsteknikker» Direkte analyse av DNA» Overlappende kloner settes sammen ved restriksjonskartlegging» Sekvens merkede (tagged) segmenter (STS er) Høyoppløselig koblings kartlegging til å bygge overlappende sett av genomiske kloner Fysisk kartlegging av overlappende genomiske kloner uten koblingsinformasjon Fig Fig Fysisk kartlegging ved analyse av STS er Fig Hver STS representerer et unikt segment av genomet som er oppformert ved PCR. Sekvenskart viser rekkefølgen av nukleotider i et klonet stykke DNA To strategier for å sekvensere det humane genom Hierarkisk shotgun tilnærming Hel-genom shotgun tilnærming Shotgun tilfeldig genererte overlappende innskutte fraagmenter Fragmenter fra BAC er Fragmenter fra oppkutting av hele genomet» Oppkutting av DNA ved sonikering» Delvis fordøying med restriksjonsensymer 4

5 Hierarkisk shotgun strategi Brukt av den offentlig støttede innsats for å sekvensere det humane genom Kutt 200 kb BAC kloner i ~2 kb fragmenter Sekvenser endene 10 ganger Nødvendig med omkring 1700 plasmid innskudd per BAC og omkring 20,000 BAC er for å dekke genomet Data fra kobling og fysiske kart brukes til å sette sammen sekvenskart av kromosomene Betydelig arbeid i å lage Fig bibliotek av hver BAC og fysisk kartlegge BAC kloner Hel-genom shotgun sekvensering Brukt av det private firma Celera til å sekvensere hele det humane genom Hel-genom tilfeldig kuttet tre ganger Plasmid bibliotek konstruert med ~ 2kb innskudd Plasmid bibliotek ~10 kb innskudd BAC lbibliotek med ~ 200 kb innskudd Dataprogram setter sammen sekvenser inn i kromosomer Ingen fysisk kartkonstuering Bare et BAC bibliotek Overvinner vanskelighetene med repeterte sekvenser Fig Begrensninger ved hel-genom sekvensering Noe DNA kan ikke klones F.eks. heterokromatin Noen sekvenser omarrangeres eller opprettholder delesjoner når de klones Fremtidig stor-genom sekvensering vil bruke begge typer shotgun tilnærming Sekvensering av det humane genom Det meste av prosessen skjedde iløpet av det siste året av prosjektet Instrumentforbedringer 3545,600 bp/dag Automatisert fabrikkmessig produksjonslinje skaffet tilstrekkelig DNA til å forsyne sekvensatorene daglig Store sekvenseringssentra med instrumenter 103,680,000 bp/dag Integrering av koblings-fysiske- og sekvenskart Gir en kontroll av den riktige rekkefølgen av hvert kart mot de to andre SSR og SNP DNA koblingsmarkører ble raskt integrert inn i fysiske kart ved PCR analyser gjennom innsatte kloner i fysiske kart SSR, SNP (koblingskart), og STS markører (fysiske kart) har unike sekvenser på 20 bp eller mer og tar hensyn til plassering på sekvenskart Forandringer i biologi, genetikk og genomiks fra den humane genomsekvens Genetikkens viktige punkter så langt Fremskynder gen-finning og gen-funksjons analyse Sekvensidentifisering i andre organismer gjennom homologi Gen funksjon i en organisme hjelper til med å forstå funksjon i en annen med hensyn på ortologe og paraloge gener Gener koder ofte for ett eller flere protein domener Tillater gjetning på funksjon av nye proteiner ved sammenligning av protein sekvenser i databaser over alle kjente domener Rask tilgang til identifisering av kjente humane polymorfismer Fremskynder kartlegging av nye organismer ved sammenligning F-eks. Mus og mennesker har høy likhet i geninnhold og rekkefølge 5

6 Hvordan transkripsjonsfaktor-proteindomener har utbredd seg i spesielle slekter Konserverte segmenter i sammensatte blokker i humane og musegenomer Fig Fig Hovedinnsikt fra human- og modellorganismesekvenser Omkring 40,000 humane gener Gener koder for ikke-kodende RNA eller proteiner Repeterte sekvenser utgjør > 50% av genomet Tydelige typer av genorganisering Kombinasjonsstrategier gir øket genetisk informasjon og øker mangfoldet Evolusjon ved lateral overføring av gener fra en organisme til en annen Menn har dobbelt så høy mutasjonsgrad som kvinner Humane raser har veldig få unike kjennetegnende gener Alle levende organismer stammer fra en felles stamfar Gjenstående spørsmål omkring det Humane Genomet Vanskelig å presist anslå antall gener på nåværende tidspunkt» Det fullstendige genom er ikke nøyaktig sekvensert»smågenerervanskeligeå identifisere» Noen gener blir sjelden uttrykt og har ikke normalt kodon bruksmønster derfor vanskelige å påvise Ikke-kodende RNA gener Transport RNA er (trnas) tilretteleggere som oversetter triplett koder fra RNA til aminosyresekvenser av proteiner Ribosomal RNA er (rrnas) komponenter av ribosomet Small nucleolar RNA er (snornas) RNA bearbeiding og basemodifisering i kjernen Small nuclear RNA er (sncrnas) - spleisosomer Protein kodende gener danner proteomet Proteome kollektiv translation av 30,000 proteinkodende gener over i proteiner Kompleksiteten i proteomet øker fra gjær til mennesker Fleregener Lurere kobling, økning eller minsking av funksjoneller moduler Flere paraloger Alternativ RNA spleising mennesker innehar betydelig mer Kjemisk modifikasjon av proteiner er høyere i mennesker 6

7 Repeterte sekvenser faller inn i fem klasser Gen organisering av genomet Transposon-avledete repetisjoner Bearbeidede pseudogener SSRs Segmentielle duplikasjoner på kb Blokker av repeterte sekvenser ved sentromerer, telomererer og andre kromosomale særtrekk Gen familier Nært beslektede gener gruppert eller spredd Gen-rike områder Funksjonelle eller tilfeldige hendelser? Gen ørkener Utgjør144 Mb eller3% avgenomet Inneholder regioner som er vanskelige å identifisere?» F.eks store gener nukleære transkripter utgjør 500 kb eller mer med veldig store introns (exons < 1% of DNA) Lateral overføring av gener > 200 humane gener kan ha oppstått ved overførsel fra organismer som bakterier Lateral overførsel er direkte overførsel fra gener fra en art til kjønnscellene til en annen Dobbelt så høy mutasjonsgrad i menn Sammenligning av X og Y kromosomer Det samme kan være tilfelle i autosomer, men vanskelig å måle Hovedmengden av humane mutasjoner skjer i menn Menn gir opphav til flere feil, men også mer mangfold Menneskeraser har tilsvarende gener Genom sekvenssentra har sekvensert betydelige deler av minst tre raser Variasjonsbredden av polymorfismer innen en rase kan være mye større enn variasjonsbredden mellom to individer av forskjellig rase Veldig få gener er rasespesifikke Genetisk er mennesker en enkelt rase Alle levende organismer er en enkelt rase Alle levende organismer har bemerkelsesverdige like genkomponenter Livet oppstod en gang og vi er etterkommere av den hendelsen Analyse av passende biologiske systemer i modellorganismer gir grunnleggende innsikt i de tilsvarende humane systemer 7

8 Høyeffektive instrumenter DNA sekvensator Høyeffektive instrumenter eks, mikromatriser (arrays) Fig Fig Tofarget DNA mikromatrise To separate cdna prøver, en fra normalgjær, og en fra mutantgjær merket med rød og grønn fluorescerende farge og hybridisert til PCR mikromatriser Massespektrometer Fig Fig Sosiale, etiske, og rettslige spørsmål Privatisering av genetisk informasjon Begrensninger ved genetisk testing Patentering av DNA sekvenses Samfunnets syn på eldre mennesker Opplæring av leger Human genetisk ingeniørkunst Somatisk gen terapi innsetting av erstatningsgener Kjønnscelle terapi modifikasjon på de humane kjønnsceller 8