(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 14/70 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , US, P , US, 121 P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR Utpekte samarbeidende stater AL BA MK RS (73) Innehaver Perseid Therapeutics LLC, 1 Galveston Drive, Redwood City CA 94063, USA (72) Oppfinner KARRER, Erik, E., 2466 Alvin Street, Mountain View, CA 94043, USA PAIDHUNGAT, Madan, M., th Avenue, San Francisco, CA 94116, USA BASS, Steven, H., 90 Parrott Drive, Hillsborough, CA 940, USA NEIGHBORS, Margaret, 80 Polk Lane, San Jose, CA 9117, USA PUNNONEN, Juha, 6 Pine Knoll Drive, Belmont, CA 94002, USA CHAPIN, Steven, J., 39 Pacheco Street, San Francisco, CA 94116, USA VISWANATHAN, Sridhar, 4 Sunset Court, Menlo Park, CA 9402, USA LARSEN, Brent, R., 824 Aries Lane, Foster City, CA 94404, USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Immunundertrykkende polypeptider og nukleinsyrer (6) Anførte publikasjoner WO-A-02/02638 WO-A-0/ WO-A-08/047

2 1 Beskrivelse Oppfinnelsens område Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt nye polypeptider som binder CD80 og/eller CD86, nukleinsyre som koder for slike polypeptider, og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av slike polypeptider og nukleinsyrer. 1 Bakgrunn for oppfinnelsen T-celler spiller en hovedrolle ved initiering og regulering av immunresponser. For at fullstendig aktivering av T-celler skal skje, kreves minst to distinkte signaleringshendelser. Et første signal produseres ved interaksjon av T-cellereseptorer (TCR) uttrykt på T-celler med spesifikke antigener (Ag) presentert i sammenheng med hovedvevsforlikelighetsantigenkomplekset ( major histocompatibility complex, MHC) molekyler uttrykt på antigenpresenterende celler (APC). Et andre (ko-stimulering) signal resulterer fra interaksjonen mellom ko-stimulerende ligander uttrykt på APC er og deres tilsvarende reseptorer uttrykt på T-celler. Et dominant ko-stimuleringsspor involverer interaksjonen mellom CD80 (B7-1 eller B7.1) og CD86 (B7-2 eller B7.2) ligander uttrykt på APC er med CD28 og CTLA-4 (også kjent som CD12) uttrykt hovedsakelig på T-celler. CTLA-4 (cytotoksisk T-lymfocyttantigen 4) og CD28 tjener som reseptorer for CD80- og CD86-ligander. 2 Positiv signalering medieres gjennom CD28-reseptoren. Binding av CD80-ligand og/eller CD86-ligand(er) til CD28 nedsetter grenseverdien for T-celleaktivering ved å fremme dannelsen av immunologiske synapser (Viola A. et al., Science 283: (1999)). I tillegg aktiverer eller øker CD28 ko-stimulering produksjonen av faktorer som er sentrale for T-celleproliferasjon og overlevelse, slik som interleukin-2 (IL-2), NF-κB og Bcl-XL (Norton S.D. et al., J. Immunol. 149: (1992); Vella A. T. et al., J. Immunol. 18: (1997)). In vivo, er CD28-defisiente mus alvorlig immunkompromitterte, og viser dårlig antigenspesifikke T-celleresponser (Green, J. M. et al., Immunity 1:01-08 (1994)). T-celleanergi eller toleranse kan resultere når T- celler aktiveres i fravær av det ko-stimulerende signal. 3 Negativ signalering medieres gjennom CTLA-4-reseptoren. CD80- og CD86-ligandene binder hver med høy aktivitet til CTLA-4, og stabiliserer immunproliferative responser avledet fra CD28-signalering. Potensielle mekanismer for CTLA-4-signalering inkluderer kompetitiv binding av ko-stimulerende molekyler CD80/CD86 (Masteller, E. M. et al., J. Immunol. 164: 319 (00)), inhibering av TCR-signalering ved induksjon av fosfataser overfor immunsynapsen (Lee K. M. et al., Science 282: 2263 (1998)), og

3 2 nedbrytning av den immunologiske synapsen (Pentcheva-Hoang T. et al., Immunity 21:401 (04); Chikuma S. et al., J. Exp. Med 197: 129 (03); Schneider H. et al., Science 313: 1972 (06)). In vivo, viser CTLA-4 defisiente mus inngående autoimmune fenotyper karakterisert ved massiv vevsinfiltrasjon og organdestruksjon (Waterhouse P. et al., Science 270: 98 (199)). Terapeutiske midler som er utformet til å antagonisere CD80/CD86 kostimuleringssporet, slik som oppløselig humant CTLA-4-Ig, gir løfte om behandling av autoimmune sykdommer og lidelser. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fordelaktig molekyler med forbedrede evner til å modulere eller undertrykke signalering gjennom CD80/CD86 ko-stimuleringssporet, og fremgangsmåter for anvendelse av slike molekyler for valgt og differensiert manipulasjon av T- celleresponser. Slike molekyler har fordelaktig bruk i en rekke anvendelser som diskutert detaljert nedenfor. 1 Oppfinnelsen tilveiebringer et isolert eller rekombinant polypeptid som omfatter en polypeptidsekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 36 med høyst seks aminosyrerester, og som inkluderer rester i posisjoner 24,, 32, 41, 0, 4,, 6, 64, 6, 70, 8, 4 og 6, som er identiske med aminosyrerestene i de tilsvarende posisjoner i SEKV. ID nr. 36, hvor polypeptidet binder humant CD80 eller humant CD86, eller et ekstracellulært domene av begge, og har en evne til å inhibere en immunrespons som er større enn evnen hos LEA29Y-polypeptid som omfatter polypeptidsekvensen vist i SEKV. ID nr. 168 for å inhibere en immunrespons. 2 Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert eller rekombinant polypeptiddimer som omfatter to polypeptider ifølge oppfinnelsen, hvor dimeren har en større evne til å undertrykke en immunrespons enn en dimer som omfatter to LEA29Y-polypeptider, hvor hvert LEA29Y-polypeptid omfatter polypeptidsekvensen vist i SEKV. ID nr Oppfinnelsen tilveiebringer også et polypeptid ifølge oppfinnelsen, som er et isolert eller rekombinant fusjonsprotein omfattende (a) et polypeptid som omfatter en polypeptidsekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 36 med høyst seks aminosyrerester som inkluderer rester i posisjoner 24,, 32, 41, 0, 4,, 6, 64, 6, 70, 8, 4 og 6, som er identiske med aminosyrerester i de tilsvarende posisjoner i SEKV. ID nr. 36, og (b) et annet polypeptid, hvor det andre polypeptidet er et Ig Fc-polypeptid, hvor fusjonsproteinet har en større evne til å undertrykke en immunrespons enn et

4 3 LEA29Y-Ig fusjonsprotein, hvor LEA29Y-Ig fusjonsproteinet omfatter polypeptidsekvensen SEKV. ID nr Oppfinnelsen tilveiebringer også en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen, som er en isolert eller rekombinant fusjonsproteindimer som omfatter to monomere fusjonsproteiner koblet via minst én disulfidbinding dannet mellom to cysteinrester tilstede i hvert monomere mutante fusjonsprotein, hvor hvert monomere fusjonsprotein omfatter (a) et polypeptid som omfatter en polypeptidsekvens som avviker fra SEKV. ID nr. 36 med høyst seks aminosyrerester, og som inkluderer rester i posisjoner 24,, 32, 41, 0, 4,, 6, 64, 6, 70, 8, 4 og 6, som er identisk med aminosyrerestene i de tilsvarende posisjoner i SEKV: ID nr. 36, og (b) et Ig Fc-polypeptid, og hvori fusjonsproteindimeren har en større evne til å undertrykke en immunrespons enn en LEA29Y-Ig fusjonsproteindimer, hvor LEA29Y-Ig fusjonsproteindimeren omfatter to monomere LEA29Y-Ig fusjonsproteiner som hver omfatter polypeptidsekvensen SEKV. ID nr Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert eller rekombinant nukleinsyre som omfatter en polynukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen, et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, en fusjonsproteindimer ifølge oppfinnelsen, eller en komplementær polypeptidsekvens derav. Oppfinnelsen tilveiebringer også en vektor som omfatter en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. 2 Oppfinnelsen tilveiebringer også en isolert eller rekombinant vertscelle som omfatter: (a) et polypeptid ifølge oppfinnelsen; (b) en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen; (c) et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen; (d) en fusjonsproteindimer ifølge oppfinnelsen; (e) en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen; og/eller (f) en vektor ifølge oppfinnelsen. 3 Oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som omfatter en farmasøytisk aksepterbar eksipiens eller farmasøytisk aksepterbar bærer, og én eller flere av de etterfølgende: (a) et polypeptid ifølge oppfinnelsen;

5 4 (b) en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen; (c) et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen; (d) en fusjonsproteindimer ifølge oppfinnelsen; (e) en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen; (f) en vektor ifølge oppfinnelsen; og/eller (g) en vertscelle ifølge oppfinnelsen. 1 Oppfinnelsen tilveiebringer også et polypeptid ifølge oppfinnelsen, en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen, et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, en fusjonsproteindimer ifølge oppfinnelsen, en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, en vektor ifølge oppfinnelsen, eller en celle ifølge oppfinnelsen, for anvendelse i: (i) en profylaktisk eller terapeutisk behandling for å inhibere eller undertrykke en immunrespons i et pattedyr; (ii) behandlingen av en immunsystemsykdom eller lidelse; eller (iii) en behandling av transplantatavstøtning av vev eller et organ i et pattedyr. 2 Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, en polypeptiddimer ifølge oppfinnelsen, et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, en fusjonsproteindimer ifølge oppfinnelsen, en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, en vektor ifølge oppfinnelsen, eller en celle ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for: (i) en profylaktisk eller terapeutisk behandling for å inhibere eller undertrykke en immunrespons i et pattedyr; (ii) behandlingen av en immunsystemsykdom eller lidelse; eller (iii) en behandling av transplantatavstøtning av vev eller et organ i et pattedyr. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter dyrking av en vertscelle ifølge oppfinnelsen i et dyrkingsmedium, og utvinning av polypeptidet uttrykt ved cellen. 3 Kort beskrivelse av figurene Fig. 1 er et skjematisk diagram av plasmidekspresjonsvektor pcdna-mutanten CTLA- 4-Ig, som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein. I fig. 1 omfatter hvert mutante CTLA-4-Ig fusjonsprotein et mutant CTLA-4-ECD-polypeptid fusjonert i sin C-terminus til N-terminusen av et humant IgG2 (higg2) Fc-polypeptid.

6 1 Fig. 2A-2D er skjematiske diagrammer på eksempler på henholdsvis hcd80-ig, hcd86-ig, LEA29Y-Ig og hctla-4-igg2 fusjonsproteiner. Signalpeptidet, ekstracellulært domene (ECD), linker (om noen), og Ig Fc-domene til hvert fusjonsprotein er vist skjematisk. Aminosyreresten tilstede i forbindelsene mellom signalpeptidet, ECD, linker (om noen), og Ig Fc er også vist. Signalpeptidet for hvert fusjonsprotein er typisk spaltet under prosessering, og således vil det utskilte (modne) fusjonsproteinet typisk ikke inneholde signalpeptidsekvensen. Fig. 2D viser et skjematisk diagram av et humant CTLA-4-IgG2 ( hctla-4-igg2 ) fusjonsprotein, som omfatter et humant CTLA-4 ekstracellulært domene ( hctla-4 ECD ) kovalent fusjonert i C-terminusen til N-terminusen av et humant IgG2-polypeptid. Den forutsagte polypeptidsekvensen til dette hctla-4-igg2 fusjonsproteinet er vist i SEKV. ID nr. 161, og omfatter de etterfølgende segmenter: hctla-4-signalpeptid (aminosyrerester 1-37), hctla-4 ECD-polypeptid (aminosyrerester ), og humant IgG2 Fc-polypeptid (aminosyrerester ). Ingen linker (f.eks. ingen aminosyrerest/aminosyrerester) er inkludert mellom C-terminusen til hctla-4 ECDpolypeptidet og N-terminusen til humant IgG2 Fc. Det humane IgG2 Fc-polypeptidet omfatter en hengsel, CH2-domene og CH3-domene av humant IgG2. I fig. 2D, er aminosyreresten i forbindelsene mellom disse forskjellige segmenter vist. Spesifikt, er de siste fire aminosyrerestene til signalpeptidet, de første fem og de siste fem aminosyrerestene til hctla-4 ECD-polypeptidet, og de første fem og de siste fem aminosyrerestene til humant IgG2 Fc-polypeptid vist. 2 Signalpeptidet spaltes typisk under prosessering, og det utskilte fusjonsprotein (modne fusjonsprotein) av hctla-4-igg2 vil således typisk ikke inneholde signalpeptidsekvensen. Polypeptidsekvensen av den modne eller utskilte formen av dette hctla-4-igg2 fusjonsprotein er vist i SEKV. ID nr Sekvensen til hctla-4 ECD-polypeptidet omfatter aminosyrerester av SEKV. ID nr. 162, og sekvensen til humant IgG2 FC-polypeptidet omfatter aminosyrerester av SEKV. ID nr I et annet aspekt, vil dette modne hctla-4-ig fusjonsprotein ikke inkludere den C-terminale lysin (K) resten, og omfatter således aminosyrerester 1-31 av SEKV: ID nr Det modne hctla-4-igg2 fusjonsproteinet, som har totalt 32 aminosyrer, omfatter aminosyrerester av polypeptidsekvensen av fullengde WT hctla-4-proteinet vist i SEKV. ID nr. 160, begynner med aminosyresekvensen: metionin-histidin-valinalanin. Om ønskelig kan aminosyrene i den modne formen nummereres begynnende med Met i Met-His-Val-Ala-sekvensen, hvor Met betegnes som den første resten

7 6 (f.eks. ECD omfatter aminosyrerester nummerert 1-124), som i SEKV. ID nr En moden hctla-4-igg2-dimer er formen på fusjonsproteinet som typisk anvendes i analysen i eksemplene som beskrevet nedenfor, dersom annet ikke er angitt. En DNAsekvens som koder for hctla-4-igg2 fusjonsproteinet, som omfatter hctla-4 ECD fusjonert til higg2 Fc-polypeptidet, vist i SEKV. ID nr Fig. 3 representerer SDS/PAGE-analyser av de etterfølgende proteiner: molekylvektmarkører med forskjellig masse (kilodaltons (kda) (spor 1); et eksempel på et mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein basert på klon D3 (dvs. D3-IgG2); (spor 2); et eksempel på mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein basert på klon D4 (dvs. D4-IgG2) (spor 3); og Orencia (Abatacept) fusjonsprotein (spor 4) (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ). 1 Fig. 4 representerer en elueringsprofil av et eksempel på et mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein (dvs. D3-IgG2) fra SEC-analyser, som viser at mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner er homogene i størrelse når renset fra transiente COS-celler. 2 Fig. viser en typisk Biacore TM -analyse av bindingen av de etterfølgende fusjonsproteiner til hcd86-ig: Orencia fusjonsprotein, LEA29Y-Ig, og D3-IgG2. Dissosiasjonsfasen for analysen begynner på tidspunktet markert med pilen. Orencia fusjonsproteinet, som er sammensatt av villtype humant CTLA-4 ECD-polypeptidet fusjonert til et mutant IgG1 Fc-domene polypeptid, tjener effektivt som en villtype human CTLA-4-Ig-kontroll. Et mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein, slik som D3-IgG2, som har en høyere aviditetsbinding til CD86-Ig enn Orencia fusjonsproteinet, har en saktere dissosiasjonshastighet fra CD86-Ig enn Orencia protein. Fig. 6 er en grafisk fremstilling av resultatene av PBMCproliferasjonsinhiberingsanalyser (med anti-cd3 antistoffstimulering) som involverer eksempler på mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner (D3-04-IgG2, D3-11-IgG2, D3-12- IgG2, D3-14-IgG2). Disse analyser viser at mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner er signifikant mer potente enn Orencia og LEA29Y-Ig i å inhibere T-celleproliferasjon in vitro. 3 Fig. 7 er en grafisk fremstilling av CD4 + T-celle proliferasjonsinhibieringsanalyser (med anti-cd3-stimulering og hb7.2-avhengig kostimulering) som involverer et eksempel på en gruppe av mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner. Orencia og LEA29Y-Ig fusjonsproteinene ble inkludert som kontroller for å sammenligne.

8 7 Fig. 8 er en grafisk fremstilling av PBMC-proliferasjonsinhiberingsanalyser (med PPDantigenstimulering) som involverer et eksempel på en gruppe av mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner. Orencia og LEA29Y-Ig ble inkludert som kontroller for å sammenligne. Fig. 9 er en grafisk fremstilling av enveisblandet lymfocyttreaksjon (MLR) proliferasjonsinhiberingsanalyser som involverer et eksempel på mutant CTLA-4-Ig fusjonsprotein D3-IgG2. Orencia og LEA29Y-Ig fusjonsproteiner var inkludert som kontroller for sammenligning. 1 2 Fig. er et skjematisk diagram som viser strukturen til et eksempel på mutant CTLA- 4-Ig fusjonsprotein. To identiske monomere mutante CTLA-4-Ig fusjonsproteiner er vist skjematisk, som hver omfatter et modent mutant CTLA-4 ECD fusjonert i sin C- terminus til N-terminusen av et humant IgG2 Fc-polypeptid. Hvert humane IgG2- polypeptid inkluderer en IgG2-hengsel, CH2-domene og CH3-domene. Eksempler på aminosyrerester tilstede i forbindelsen mellom ECD og Ig Fc-polypeptidene er også vist. Aminosyrerestene i forbindelsen mellom disse komponentene kan avvike avhengig av mutant CTLA-4 ECD-polypeptidsekvensen og/eller Igpolypeptidsekvensen. Det dimere fusjonsproteinet resulterer fra dannelsen av minst én disulfidbinding mellom cysteinrester i analoge stillinger i de to monomerer. Cystein (C) restene som eventuelt er involvert i danning av disulfidbindinger mellom de to monomerer markert med stjerner. Signalpeptidet av hvert monomere fusjonsprotein spaltes typisk under prosessering, og det utskilte (modne) fusjonsprotein vil således typisk ikke inkludere signalpeptidsekvensen. Fig. 11 er en grafisk fremstilling av CD4 + T-celleproliferasjonsanalyser (med anti-cd3- stimulering og hb7.2-avhengig ko-stimulering) som involverer hctla-4-igg2, Orencia og LEA29Y-Ig-fusjonsproteiner. 3 Fig. 12A-12F angir en sammenstilling av polypeptidsekvensen av villtype humant CTLA-4 ekstracellulært domene (angitt i figurene som hctla4ecd ), polypeptidsekvensen av LEA29Y-polypeptidet (angitt i figurene som LEA29YECD ), og polypeptidsekvensene til eksempler på mutant CTLA-4 ECD-polypeptider. Klonenavn til disse mutante CTLA-4 ECD-polypeptider er indikert til venstre. Aminosyrerester som er identisk med dem i villtype humant CTLA-4 ECD indikert med et punktum (.).

9 8 Fig. 13 angir en BLOSUM62-matrise. Fig. 14A-14D viser eksempler på sammenstillinger og sammenstillingsskårer bestemt ved manuell beregning for to aminosyresekvenser. Fig. 1A-1B viser farmakokinetikk (PK) profiler for Orencia fusjonsprotein, humant CTLA-4-IgG2, og representative mutante CTLA-4-IgG2 fusjonsproteiner administrert med 1 mg/kg som en enkel (A) intravenøs (IV) bolus eller (B) subkutan (SC) injeksjon i rotter. 1 Detaljert beskrivelse Definisjoner Det skal også forstås at terminologien som anvendt her er for formålet å beskrive kun særlige utførelsesformer, og skal ikke anses som begrensende. Dersom annet ikke er definert, skal alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som er anvendt her ha den samme betydning som vanligvis forstås av en fagkyndig på området som oppfinnelsen er beregnet for. 2 Betegnelsene nukleinsyre og polynukleotid anvendes om hverandre for å referere til en polymer av nukleinsyrerester (f.eks. deoksyribonukleotider eller ribonukleotider) i enten enkelt- eller dobbelttrådet form. Dersom ikke spesifikt begrenset, omfatter betegnelsen en nukleinsyre som inneholder kjente analoger av naturlige nukleotider, som har tilsvarende bindingsegenskaper som referansenukleinsyren, og metaboliseres på en måte som er tilsvarende naturlig forekommende nukleotider. Dersom annet ikke er indikert, omfatter en spesiell nukleinsyresekvens også underforstått konservativt modifiserte varianter derav (f.eks. degenererte kodonsubstitusjoner) og komplementære nukleotidsekvenser, så vel som sekvensen som eksplisitt er indikert. Spesifikt kan degenererte kodonsubstitusjoner være oppnådd ved å danne sekvenser hvor den tredje stillingen til ett eller flere valgte (eller alle) kodoner er substituert med blandet-base og/eller deoksyinosinrester (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:081 (1991); Ohtsuka et al.,, J. Biol. Chem. 260: (198); og Cassol et al. (1992); Rosslini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 98 (1994)). Betegnelsen nukleinsyre eller polynukleotid anvendes om hverandre med cdna eller mrna kodet for av et gen. 3 Betegnelsen gen refererer i store trekk til et hvilket som helst nukleinsyresegment (f.eks. DNA) assosiert med en biologisk funksjon. Et gen kan inkludere en kodesekvens og/eller regulerende sekvens nødvendig for deres ekspresjon. Et gen kan

10 9 også inkludere ett eller flere ikke-uttrykte DNA-nukleinsyresegmenter som f.eks. danner gjenkjenningssekvenser for ett eller flere andre proteiner (f.eks. promoter, enhancer eller annen regulerende region). Et gen kan oppnås fra en rekke kilder, som inkluderer kloning fra en kilde av interesse, eller syntetisering fra kjente eller forutsagt sekvensinformasjon, og kan inkludere én eller flere sekvenser som er designet til å ha deres parametere. 1 Betegnelsene polypeptid, peptid og protein anvendes om hverandre for å referere til en polymer av aminosyrerester. Betegnelsene gjelder for aminosyrepolymerer hvor én eller flere aminosyrerester er et kunstig kjemisk mimetikum av en tilsvarende naturlig forekommende aminosyre, så vel som naturlig forekommende aminosyrepolymerer og ikke-naturlig forekommende aminosyrepolymerer. Som anvendt her omfatter betegnelsen aminosyrekjeder av en hvilken som helst lengde som inkluderer fullengdeproteiner (dvs. antigener), hvor aminosyrerestene er koblet ved kovalente peptidbindinger. 2 Nummerering av en gitt aminosyrepolymer eller nukleinsyrepolymer tilsvarer eller vedrører nummereringen av en valgt aminosyrepolymer eller nukleinsyrepolymer når stillingen til en hvilken som helst gitt polymerkomponent (f.eks. aminosyre, nukleotid, også generisk omtalt som en rest ) med betegnelser ved henvisning til den samme eller en ekvivalent stilling i den valgte aminosyre- eller nukleinsyrepolymer, heller enn ved den reelle nummeriske stillingen til komponenten i den gitte polymer. Således tilsvarer f.eks. nummereringen av en gitt aminosyrestilling i en gitt polypeptidsekvens den samme eller ekvivalent aminosyrestilling i en valgt polypeptidsekvens anvendt som en referansesekvens. 3 En ekvivalent stilling (f.eks. en ekvivalent aminosyrestilling eller ekvivalent nukleinsyrestilling eller ekvivalent reststilling ) defineres her som en stilling (slik som en aminosyrestilling eller nukleinsyrestilling, eller reststilling) av en testpolypeptid (eller testpolynukleotid) sekvens som er sammenstillet med en tilsvarende stilling av en referansepolypeptid eller referansepolynukleotidsekvens, når sammenstillet (foretrukket optimalt sammenstillet) ved anvendelse av en sammenstillingsalgoritme som beskrevet her. Den ekvivalente aminosyrestillingen til testpolypeptidsekvensen behøver ikke ha det samme nummeriske stillingsnummeret som den tilsvarende stilling til et testpolypeptid. Likeledes behøver den ekvivalente nukleinsyrestillingen til testpolynukleotidsekvensen å ha det samme nummeriske stillingstallet som den tilsvarende stilling i testpolynukleotidet.

11 1 Et mutant polypeptid omfatter en polypeptidsekvens som avviker i én eller flere aminosyrerester fra polypeptidsekvensen av et moderpolypeptid eller referansepolypeptid (slik som f.eks. en villtype (WT) polypeptidsekvens). I ett aspekt, omfatter et mutant polypeptid en polypeptidsekvens som avviker fra polypeptidsekvensen til et moderpolypeptid eller referansepolypeptid, med fra omtrent 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 1 %, %, %, 40 %, 0 % eller mer av det totale antall rester i moderpolypeptidsekvensen eller referansepolypeptidsekvensen. I et annet aspekt omfatter mutantpolypeptidet en polypeptidsekvens som har minst omtrent 0 %, 60 %, 70 %, 80 %, 8 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 9 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med polypeptidsekvensen av et moderpolypeptid eller referansepolypeptid. I et annet aspekt omfatter et mutantpolypeptid en polypeptidsekvens som avviker fra polypeptidsekvensen av et moderpolypeptid eller referansepolypeptid med fra 1 til 0 eller flere aminosyrerester, f.eks. 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, eller flere aminosyrerester). Et mutant polypeptid kan omfatte en polypeptidsekvens som avviker fra polypeptidsekvensen til et moderpolypeptid eller referansepolypeptid med f.eks. delesjon, addisjon eller substitusjon av én eller flere aminosyrerester (f.eks. 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, eller flere aminosyrerester) i moderpolypeptidet eller referansepolypeptidet, eller en hvilken som helst kombinasjon av én eller flere slike delesjoner, addisjoner og/eller substitusjoner. Referansepolypeptidet eller moderpolypeptidet kan som sådan være et mutant polypeptid. 2 Naturlig forekommende anvendt på et objekt betyr at objektet er funnet naturlig til forskjell fra å være kunstig fremstilt av mennesket. Ikke-naturlig forekommende som anvendt for et objekt, betyr at objektet ikke er naturlig forekommende (dvs. at objektet ikke finnes naturlig). Et ikke-naturlig forekommende polypeptid refererer f.eks. til et polypeptid som er fremstilt av mennesker, slik som f.eks. at det er syntetisert in vitro eller fremstilt kunstig. En subsekvens eller fragment av en sekvens av interesse er en hvilken som helst del av hele sekvensen, opp til men som ikke inkluderer hele sekvensen av interesse. 3 En nukleinsyre, protein eller annen komponent er isolert når den er delvis eller fullstendig separert fra komponenter med hvilken den normalt er assosiert (andre

12 11 proteiner, nukleinsyrer, celler, syntetiske reagenser, osv.). På en molar basis, er en isolert art mer rikelig enn andre arter i en sammensetning. F.eks. kan en isolert art omfatte minst omtrent 0 %, 70 %, 80 %, 8 %. 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 9 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99 % eller 0 % (på en molar basis) av alle makromolekylarter tilstede. Artene av interesse er foretrukket blitt renset til essensiell homogenitet (dvs. kontaminerende arter kan ikke detekteres i sammensetningen ved konvensjonelle deteksjonsmetoder). Renhet og homogenitet kan bestemmes ved å anvende en rekke teknikker som er velkjente innen teknikken, slik som agarosegelelektroforese eller polyakrylamidgelelektroforese av en proteinprøve eller en nukleinsyreprøve, etterfulgt av visualisering ved farging. Om ønsket kan en høyoppløsende teknikk slik som høyytelses væskekromatografi (HPLC) eller en tilsvarende metode anvendes for å rense materialet. 1 Betegnelsen renset som anvendt for nukleinsyrer eller polypeptider betyr generelt en nukleinsyre eller polypeptid som er i alt vesentlig fri for andre komponenter som bestemte ved analyseteknikker som er vel kjent innen teknikken (f.eks. et renset polypeptid eller polynukleotid danner et adskilt bånd i en elektroforetisk gel, et kromatografieluat og/eller et medie underkastet densitetsgradientsentrifugering). En nukleinsyre eller polypeptid som fører til i alt vesentlig ett bånd i en elektroforesegel er f.eks. renset. En renset nukleinsyre eller polypeptid er omtrent 0 % ren, vanligvis omtrent 7 %, 80 %, 8 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 9 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99, %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % eller mer ren (f.eks. vektprosent på en molar basis). 2 En nukleinsyre eller polypeptid er rekombinant når det ar kunstig eller manipulert, eller avledet fra et kunstig eller manipulert protein eller nukleinsyre. 3 Betegnelsen rekombinant når anvendt under henvisning til en celle indikerer typisk at cellen replikerer en heterolog nukleinsyre eller uttrykker et polypeptid kodet for av en heterolog nukleinsyre. Rekombinante celler kan omfatte gener som ikke er funnet i nativ (ikke-rekombinant) form i cellen. Rekombinante celler inkluderer også dem som omfatter gener som er funnet i den native formen i cellen, men som er modifisert eller reintrodusert i cellen ved hjelp av kunstige midler. Betegnelsen omfatter også celler som omfatter en nukleinsyre som er endogen for cellen som er blitt modifisert uten å fjerne nukleinsyren fra cellen; slike modifikasjoner inkluderer dem oppnådd ved generstatning, setespesifikk mutasjon og beslektede teknikker som er kjent for de fagkyndige på området. Rekombinant DNA-teknologi inkluderer teknikker for

13 12 fremstilling av rekombinant DNA in vitro, og overføring av det rekombinante DNA inn i celler hvor det kan uttrykkes eller propageres, for derved å fremstille et rekombinant polypeptid. 1 En rekombinant ekspresjonskassett eller simpelthen ekspresjonskassett er et nukleinsyrekonstrukt, som er dannet rekombinant eller syntetisk, med nukleinsyreelementer som er i stand til å gjennomføre ekspresjon av et strukturelt gen i verter som er kompatible med slike sekvenser. Ekspresjonskassetter inkluderer i det minste promoterer og eventuelt transkripsjonstermineringssignaler. Den rekombinante eksprsjonskassetten inkluderer typisk en nukleinsyre som skal transkriberes (f.eks. en nukleinsyre som koder for et ønsket polypeptid) og en promoter. Ytterligere faktorer som er nødvendige eller nyttige for å bevirke ekspresjon, kan også anvendes som beskrevet her. En ekspresjonskassett kan f.eks. også inkludere nukleotidsekvenser som koder for en signalsekvens som styrer sekresjonen av et uttrykt protein fra vertscellen. Transkripsjonstermineringssignaler, enhancere og andre nukleinsyresekvenser som innvirker på genekspresjon kan også være inkludert i en ekspresjonskassett. 2 En eksogen nukleinsyre, eksogent DNA-segment, heterolog sekvens eller heterolog nukleinsyre som anvendt her, er én/ett som stammer fra en kilde som er fremmed for den spesielle vertscellen, eller, dersom den er fra den samme kilde, er modifisert fra sin opprinnelige form. Et heterologt gen i en vertscelle inkluderer således et gen som er endogent for den spesielle vertscellen, men som er blitt modifisert. Modifikasjon av en heterolog sekvens i søknaden beskrevet her forekommer typisk gjennom bruken av direkte molekylære utviklingsmetoder. Betegnelsene refererer således til et DNA-segment som er fremmed eller heterologt overfor cellen, eller homologt for cellen, men i en posisjon i vertscellenukleinsyren hvori elementet ikke finnes ordinært. Eksogene nukleinsyrer eller eksogent DNA uttrykkes til å gi eksogene polypeptider. 3 En vektor kan være et hvilket som helst middel som er i stand til å avlevere eller opprettholde en nukleinsyre i en vertscelle, og inkluderer for eksempel, men er ikke begrenset til, plasmider (f.eks. DNA-plasmider), nakne nukleinsyrer, virale vektorer, virus, nukleinsyrer kompleksdannet med ett eller flere polypeptider eller andre molekyler, så vel som nukleinsyrer som er immobilisert på fastfasepartikler. Vektorer er beskrevet i detalj nedenfor. En vektor kan være anvendbar som et middel for å avlevere eller opprettholde et eksogent gen og/eller et protein i en vertscelle. En

14 13 vektor kan være i stand til transduksjon, transfeksjon eller transformering av en celle, for derved å bevirke at cellen replikerer eller uttrykker nukleinsyrer og/eller proteiner annet enn dem som er nativ for cellen, eller på en måte som ikke er nativ for cellen. En vektor kan inkludere materialer for å understøtte oppnåelse av inntreden av en nukleinsyre i cellen, slik som en viral partikkel, liposom, proteinkappe eller liknende. En hvilken som helst metode for å transferere nukleinsyre inn i cellen kan anvendes; dersom annet ikke er indikert omfatter betegnelsen vektor ikke noen spesiell metode for avlevering av en nukleinsyre i en celle, eller innebærer at en hvilken som helst spesiell celletype er formålet for transduksjon. Den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til noen spesifikk vektor for avlevering eller opprettholdelse av en hvilken som helst nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, som inkluderer f.eks. en nukleinsyre som koder for et mutant CTLA-4-polypeptid ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav (f.eks. mutant CTLA-4 ECD) som binder CD80 og/eller CD86 eller et fragment derav (f.eks. et CD80 ECD eller CD86 ECD). 1 Betegnelsen ekspresjonsvektor refererer typisk til et nukleinsyrekonstrukt eller sekvens, dannet rekombinant eller syntetisk, med en serie av det spesifikke nukleinsyreelementet som tillater transkripsjon av en spesiell nukleinsyre i en vertscelle. Ekspresjonsvektoren inkluderer typisk en nukleinsyre som skal transkriberes operabelt koblet til en promoter. Betegnelsen ekspresjon inkluderer et hvilket som helst trinn som er involvert i fremstillingen av polypeptidet som inkluderer, men som ikke er begrenset til, transkripsjon, posttranskripsjonsmodifikasjon, translasjon, post-translasjonsmodifikasjon og/eller sekresjon. 2 Et signalpeptid er en peptid (eller aminosyre) sekvens som typisk kommer foran et polypeptid av interesse, og som translateres sammen med polypeptidet og leder polypeptidet til det sekretoriske system, eller gjør dette lettere. Et signalpeptid er typisk kovalent festet eller fusjonert til aminoterminusen av polypeptidet av interesse, og forenkler sekresjonen av polypeptidet av interesse fra en vertscelle. Signalpeptidet spaltes typisk fra polypeptidet av interesse etter translasjon. 3 Betegnelsen kode for refererer til en nukleotidsekvens sin evne til å kode for én eller flere aminosyrer. Betegnelsen krever ikke et start- eller stoppkodon. En aminosyresekvens kan kodes for i hvilken som helst ene av seks ulike leserammer tilveiebrakt ved en polynukleotidsekvens og dens komplement.

15 14 Betegnelsen kontrollsekvens er definert her og inkluderer alle komponentene, som er nødvendig eller fordelaktig for ekspresjonen av et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Hver kontrollsekvens kan være nativ eller fremmed for nukleinsyresekvensen som koder for polypeptidet. Slik kontrollsekvens inkluderer, men er ikke begrenset til, en leder, polyadenyleringssekvens, propeptidsekvens, promoter, signalpeptidsekvens og transkripsjonsterminator. Som et minimum inkluderer en kontrollsekvens en promoter og transkripsjons- og translasjonsstoppsignaler. Kontrollsekvensene kan utstyres med linkere for det formål å introdusere spesifikke restriksjonsseter som forenkler ligering av kontrollsekvensene med koderegionen av nukleotidsekvensen som koder for et polypeptid. 1 Betegnelsen kodesekvens refererer til en nukleotidsekvens som direkte spesifiserer aminosyresekvensen av dens proteinprodukt. Grensene for kodesekvensen bestemmes generelt ved en åpne leseramme (ORF), som kan begynne med et ATGstartkodon. En nukleinsyre er operabelt koblet til en annen nukleinsyresekvens når den er basert i en funksjonell sammenheng med en annen nukleinsyresekvens. En promoter eller en enhancer er f.eks. operabelt koblet til en kodesekvens dersom den leder transkripsjonen av kodesekvensen. Operabelt koblet betyr at DNA-sekvenser som er koblet typisk er tilstøtende, og hvor nødvendig for å forene to proteinkoderegioner, tilstøtende og i leseramme. Da enhancere imidlertid generelt virker når separert fra promoteren ved en rekke kilobaser og introniske sekvenser kan ha variable lengder, kan noen polynukleotidelementer være operabelt koblet, men ikke tilstøtende. 2 En vertscelle er en hvilken som helst celle som er tilbøyelig til transformasjon med en nukleinsyre. 3 Et antigen refererer til en substans som reagerer med produktet/produktene av en immunrespons stimulert ved et spesifikt immunogen. Se f.eks. JULIUS CRUSE ET AL., ATLAS OF IMMUNOLOGY 60 (1999); RICHARD COICO ET AL., IMMUNOLOGY: A SHORT COURSE 27- (. utgave, 03). En immunrespons kan omfatte en humoral respons og/eller en cellemediert immunrespons (f.eks. cytotoksisk T-lymfocytter (CTL er)). Produkter av en immunrespons kan inkludere antistoffer og/eller CTL er. Antigener er typisk makromolekyler (f.eks. polypeptider, nukleinsyrer, komplekse karbohydrater, fosfolipider, polysakkarider) som er fremmede for verten; den delen av antigenet som er kjent som den antigeniske determinant reagerer med (f.eks. binder til)

16 1 produktet/produktene av immunresponsen, slik som et antistoff eller en spesifikk T- cellereseptor eller en T-lymfocytt. Et antigen kan, men ikke nødvendigvis, indusere en immunrespons, så vel som reagere med produktet/produktene av immunresponsen. Antigenitet hører til tilstanden eller egenskapen av å være antigenisk, dvs. som har egenskapen til et antigen. Spesifisiteten til et antigen kan vises i forbindelse med et antigen overfor dets antistoff eller vice versa; et antigen reagerer typisk på en svært spesifikk måte med dets tilsvarende antistoff, og ikke med samme grad av spesifisitet med andre antistoffer som er fremkalt ved immungenet. En antigenisk mengde er en mengde av et antigen som på detekterbar måte reagerer med produktet/produktene av en immunrespons stimulert ved et spesifikt immunogen. 1 Et immunogen er en substans som er i stand til å indusere en immunrespons heller enn immunologisk toleranse. Se f.eks. JULIUS CRUSE ET AL., supra ved 60-61; RICHARD COICO, supra ved 27-. Immunogener reagerer også med (f.eks. binder) produktet/produktene av den induserte immunrespons som har, eller som er blitt spesifikt indusert mot dem. Således er alle immunogener antigener. Immunogenitet refererer til tilstanden eller egenskapen av det å være immunogen, dvs. har egenskapen til et immunogen. En immunogen mengde er en mengde av et immunogen som er effektivt for å indusere en detekterbar immunrespons. Et immunogen kan utløse en sterk immunrespons i et individ, slik som minst delvis eller fullstendig beskyttende immunitet overfor minst ett patogen. 2 Et immunmodulator eller immunomodulerende molekyl, slik som et immunomodulerende polypeptid eller nukleinsyre, modulerer en immunrespons. Med modulsajon eller modulering av en immunrespons menes at immunresponsen endres. Modulasjon av eller modulering av en immunrespons i et individ betyr f.eks. generelt at en immunrespons stimuleres, induseres, inhiberes, nedsettes, undertrykkes, økes, forsterkes, eller på annen måte endrer sitt individ. Slik modulering av en immunrespons kan bestemmes ved midler som er kjent for fagkyndige på området, og som inkluderer dem som er beskrevet nedenfor. En immunsupressor eller immunsupresjonsmiddel er et molekyl, slik som et polypeptid eller nukleinsyre, som undertrykker en immunrespons. 3 En Fc-region eller domene av et immunoglobulin eller antistoffmolekyl (også betegnet et Ig Fc-polypeptid eller Fc-polypeptid) svarer i stor grad til den konstante regionen av immunoglobulintungkjeden, og er ansvarlig for forskjellige funksjoner som inkluderer antistoffets effekt og funksjon(er). Ig Fc-regionen av IgG-molekylet omfatter f.eks.

17 16 immunoglobulindomenene CH2 og CH3, og den N-terminale hengselregionen leder til CH2. Hengselregionen er en del av den tunge kjeden mellom Fc og CH1 inneholdende inter-tungkjededisulfidbindinger og gir fleksibilitet til antistoffmolekylet. De konstante domenene av Fc-regionen interagerer med celler i immunsystemet. Fc-reseptorer er proteiner som binder Fc-regionen til antistoffet. En signifikant familie av Fc-reseptorer for IgG-antistoffklassen inkluderer Fc-gamma reseptorer (FcγR). Bindingen av antistoffet til Fc-reseptorer og celler medierer en rekke antistoffunksjoner. Forskjellige IgG-subklasser utviser forskjellige affiniteter for Fc-gamma reseptorer. Generelt binder IgG1 og IgG3 til reseptorene med en større affinitet enn IgG2 og IgG4. Fcreseptorer er uttrykt på en rekke celler som inkluderer f.eks. B-celler, monocytter, dendrittiske celler, nøytrofiler og visse lymfocytter. Binding av et Ig Fc til dens reporter bringer disse effektorceller til stede i det bundne antigenet, som til sist resulterer i signalering og immunresponser som inkluderer B-celleaktivering, inflammatoriske responser, cytotoksiske responser, og fagocyttiske responser. 1 2 En Ig Fc-fusjon er et molekyl som omfatter ett eller flere polypeptider (eller ett eller flere små molekyler) som er operabelt koblet til en Fc-region av et immunoglobulin eller antistoff. Se f.eks. Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol. 14:2-60. Følgelig er et Ig Fc-fusjonsprotein et molekyl som omfatter ett eller flere polypeptider som er operabelt koblet til en Ig Fc-region. Et Ig Fc-fusjonsprotein kan omfatte f.eks. Fcregionen av et antistoff (som forenkler effektorfunksjoner og farmakokinetikker) og bindingsregionen eller bindingsdomenet av et reseptorprotein eller ligandprotein eller annet protein eller fragment derav. Bindingsregionen eller bindingsdomenet medierer gjenkjenning av målreseptoren eller liganden (sammenlignet med den til antistoff variabel region av et antistoff for et antigen). En Ig Fc-region kan være indirekte eller direkte koblet til ett eller flere polypeptider eller småmolekyler (fusjonspartner). Forskjellige linkere som er kjent innen teknikken som beskrevet mer detaljert nedenfor, kan anvendes for å koble et Ig Fc til en fusjonspartner for å generere en Ig Fc-fusjon. Et Ig Fc-fusjonsprotein omfatter typisk en Ig Fc-region som er kovalent koblet direkte eller indirekte til minst ett polypeptid, hvilket polypeptid typisk binder en målligand eller reseptor. 3 En spesifikk bindingsaffinitet mellom to molekyler, f.eks. en ligand og en reseptor, betyr en foretrukket binding av ett molekyl fremfor et annet. Bindingen av molekyler betraktes typisk som spesifikk dersom likevektsbindingsassosieringskonstanten (f.eks. K A ) er omtrent 1 x 2 M -1 til omtrent 1 x 13 M -1 eller større, inkludert omtrent 4 til 13 M -1, omtrent 6 til 12 M -1, omtrent 8 M -1 til 11 M -1 eller omtrent 8 til

18 17 1 M -1. Verdier for K A for bindingsinteraksjonen mellom et antigen og et antistoff vil typisk variere fra omtrent M -1 til omtrent 12 M -1, vanligvis omtrent 7 M -1 til omtrent 11 M -1, og ofte omtrent 8 M -1 til omtrent M -1. K A (M -1 ) bestemmes ved å beregne k a /k d, hvor k a er assosiasjonsratekonstanten, og k d er dissosiasjonsratekonstanten. Enheten til k a og k d er henholdsvis M -1 s -1 og s -1. Likevektsdissosiasjonskonstanten, K D, er den resiproke verdien av K A. K D = k d /k a. For reaksjonen A + B <=> AB (som representerer en enkelt ligandbinding til et enkelt protein av interesse (f.eks. reseptor)), er K D lik ([A][B])/[AB]. Ikke-begrensende eksempler på velkjente teknikker for å måle bindingsfaffiniteter og/eller aviditeter av molekyler inkluderer f.eks. Bacore TM teknologi (GE Healthcare) som omtalt annet sted her, isotermisk titreringsmikrokalorimetri (MicroCal LLC, Northampton, MA USA), ELISA, og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) metoder. FACS eller andre sorteringsmetoder kan f.eks. anvendes for å selektere populasjoner av molekyler (slik som f.eks. celleoverflatedisplayligander) som spesifikt binder til det assosierte bindingsparmedlem (slik som en reseptor, f.eks. en oppløselig reseptor). Ligandreseptorkomplekser kan detekteres og sorteres ved f.eks. fluorescens (f.eks. ved å reagere komplekset med fluorescerende antistoff som gjenkjenner komplekset). Molekyler av interesse som binder et assosiert bindingsparmedlem (f.eks. reseptor) samles og resorteres i nærvær av lavere konsentrasjoner av reseptor. Ved å gjennomføre multiple runder av sortering i nærvær av fallende konsentrasjoner av reseptor (et typisk konsentrasjonsområde er i størrelsesorden 6 M ned til -13 M, dvs. 1 mikromolar (μm) ned til 1 nanomolar (nm), eller mindre (f.eks. -11 M eller - 12 M), avhengig av naturen til ligandreseptorinteraksjonen), kan populasjoner av molekylet av interesse som utviser spesifikk bindingsaffinitet for reseptoren isoleres. 2 3 Uttrykket spesifikt (eller selektivt) binder til et antistoff eller spesifikt (eller selektivt) immunoreaktivt med, når man refererer til et protein, refererer til en bindingsreaksjon som er bestemmende for tilstedeværelsen av proteinet i en heterogen populasjon av proteiner og andre biologiske materialer. Under designerte immunoassaybetingelser, binder således de spesifiserte antistoffer til et spesielt protein minst to ganger bakgrunnen, og binder i alt vesentlig ikke i en signifikant mengde til andre proteiner tilstede i prøven. Spesifikk binding til et antistoff under slike betingelser kan kreve et antistoff som er valgt for dets spesifisitet for et spesielt protein. En rekke immunoassayformater kan anvendes for å velge antistoffer som er spesifikt immunoreaktive med et spesielt protein. Fast-fase ELISA immunoassays er f.eks. rutinemessig anvendt for å velge antistoffer som er spesifikt immunoreaktive med et protein (se f.eks. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), for

19 18 en beskrivelse av immunoassayformater og betingelser som kan anvendes for å bestemme spesifikk immunreaktivitet). En spesifikk eller selektiv reaksjon vil vanligvis være minst to ganger bakgrunnssignalet eller bakgrunnsstøyen, og vil typisk være mer enn til 0 ganger bakgrunnssignalet. Betegnelsen cytokin inkluderer, f.eks., men er ikke begrenset til, interleukiner, interferoner (IFN), kjemokiner, hematopoetiske vekstfaktorer, tumornekrosefaktorer (TNF), og transformerende vekstfaktorer. Generelt er disse proteiner med lav molekylvekt som regulerer maturasjon, aktivering, proliferasjon og differensiering av celler i immunsystemet. 1 2 Betegnelsen screening beskriver generelt en prosess som identifiserer optimale molekyler ifølge oppfinnelsen, slik som f.eks. som inkluderer polypeptider ifølge oppfinnelsen, og beslektede fusjonsproteiner som omfatter de samme, og nukleinsyrer som koder for alle slike molekyler. En rekke egenskaper for de respektive molekyler kan anvendes for seleksjon og screening, f.eks. en evne for et respektivt molekyl til å indusere eller endre en ønsket immunrespons i et testsystem, eller i en in vitro, ex vivo eller in vivo anvendelse. Seleksjon er en form av screening hvor identifikasjon og fysisk separasjon oppnås samtidig ved ekspresjon av en seleksjonsmarkør, som i forbindelse med noen genetiske forhold, tillater celler som uttrykker markørene å overleve, mens andre celler dør (eller vice versa). Screeningmarkører inkluderer f.eks. luciferase, beta-galaktosidase og grønt fluorescerende protein, reaksjonssubstrater og liknende. Seleksjonsmarkører inkluderer legemiddel- og toksinresistensgener og liknende. En annen seleksjonsmåte involverer fysisk sortering basert på en detekterbar hendelse, slik som binding av en ligand med en reseptor, reaksjon av et substrat med et enzym, eller en hvilken som helst annen fysisk prosess som kan generere et detekterbart signal enten direkte (f.eks. ved å benytte et kromogenisk substrat eller ligand) eller indirekte (f.eks. ved å reagere med et kromogenisk sekundært antistoff). Seleksjon ved fysisk sortering kan gjennomføres ved en rekke metoder som inkluderer, men som ikke er begrenset til, f.eks. y FACS i helcelle eller mikrodråpeformater. 3 På grunn av begrensninger med hensyn til å studere primære immunresponser in vitro, er in vivo studier særlig anvendbare screeningmetoder. I noen slike studier, blir et polynukleotid eller polypeptid ifølge oppfinnelsen først introdusert i et testindivid (f.eks. et pattedyr, slik som et dyr), og en indusert immunrespons studeres deretter ved å analysere typen av immunrespons i det immuniserte dyret (f.eks.

20 19 antistoffproduksjon i serumet til det immuniserte dyret, proliferasjon av T-celler), eller ved å studere kvaliteten eller styrken på den induserte immunresponsen i det immuniserte dyret (f.eks. indusert antistofftiternivå). Betegnelsen individ som anvendt her inkluderer, men er ikke begrenset til, en organisme eller dyr, som inkluderer pattedyr og ikke-pattedyr. Et pattedyr inkluderer f.eks., men er ikke begrenset til, et menneske, et ikke-humant primat (f.eks. bavian, orangutang, ape, gorilla), mus, hund, gris, ku, geit, katt, kanin, rotte, marsvin, hamster, hest, sau, eller annet ikke-humant pattedyr. Et ikke-pattedyr inkluderer f.eks., men er ikke begrenset til, et ikke-pattedyrinvertebrat og ikke-pattedyr virveldyr, slik som en fugl (f.eks. en høne/kylling eller and) eller en fisk. 1 Betegnelsen farmasøytisk preparat refererer til et preparat som er egnet for farmasøytisk bruk i et individ, som inkluderer et dyr eller menneske. Et farmasøytisk preparat omfatter typisk en effektiv mengde av et aktivt middel og en bærer, eksipiens eller fortynningsmiddel. Bæreren, eksipiensen eller fortynningsmidlet er typisk henholdsvis en farmasøytisk aksepterbar bærer, eksipiens eller fortynningsmiddel. 2 Betegnelsen effektiv mengde refererer til en dosering (eller dose) eller mengde av en substans som er tilstrekkelig for å produsere et ønsket resultat. Det ønskede resultatet kan omfatte en objektiv eller subjektiv forbedring i resipienten av doseringen eller mengden. Det ønskede resultat kan f.eks. omfatte en målbar, detekterbar eller testbar induksjon, fremgang, økning eller modulering av en immunrespons i et individ, til hvilket en dose eller mengde av et spesielt antigen eller immunogen (eller sammensetning derav) er blitt administrert. En dosering (eller dose) eller mengde av et immunogen som er tilstrekkelig til å produsere et slikt resultat kan beskrives som en immunogenisk dosering (eller dose) eller mengde. 3 En profylaktisk behandling er en behandling administrert til et individ som ikke utviser tegn eller symptomer på, eller som utviser kun tidlige tegn eller symptomer på en sykdom, patologi eller lidelse, slik at behandling administreres for det formål å forebygge eller nedsette risikoen for å utvikle sykdommen, patologien eller lidelsen. En profylaktisk behandling virker som en preventiv behandling mot en sykdom, patologi eller lidelse, eller som behandling som inhiberer eller reduserer ytterligere utvikling eller forsterkning av en sykdom, patologi eller lidelse. En profylaktisk aktivitet er en aktivitet av et middel som, når administrert til et individ som ikke

21 utviser tegn eller symptomer på, eller som utviser kun tidligere tegn eller symptomer på, en patologi, sykdom eller lidelse, forhindrer eller nedsetter risikoen for at individet skal utvikle patologien, sykdommen eller lidelsen. Et profylaktisk anvendbart middel (f.eks. nukleinsyre eller polypeptid) referer til et middel som er anvendbart for å forebygge behandling av en sykdom, patologi eller lidelse, som er anvendbar for å inhibere eller redusere ytterligere utvikling eller forsterkning av en sykdom, patologi eller lidelse. 1 En terapeutisk behandling er en behandling administrert til et individ som utviser symptomer eller tegn på patologi, sykdom eller lidelse, hvilken behandling administrert til individet for det formål å svekke eller eliminere de tegn eller symptomer. En terapeutisk aktivitet er en aktivitet av et middel som eliminerer eller svekker tegn eller symptomer på patologi, sykdom eller lidelse når administrert til et individ som lider av slike tegn eller symptomer. Et terapeutisk anvendbart middel betyr at midlet er anvendbart for å nedsette, behandle eller eliminere tegn eller symptomer på en sykdom, patologi eller lidelse. 2 Generelt er nomenklaturen som anvendes her og mange av laboratorieprosedyrene i cellekultur, molekylær genetikk, molekylær biologi, nukleinsyrekjemi og proteinkjemi beskrevet nedenfor er velkjent og vanlig benyttet av de fagkyndige på området. Standard teknikker, slik som beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manul (2. utgave), bind 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (heretter Sambrook ) og CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel et al., red., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. og John Wiley & Sons, Inc. (1994, supplemented through 1999) (heretter Ausubel ), anvendes for rekombinante nukleinsyremetoder, nukleinsyresynteser, celledyrkingsmetoder og transgen innlemmelse, f.eks. elektroporering, injeksjon, genkanon, impresjon gjennom huden og lipofeksjon. Generelt vil oligonukleotidsyntese og rensetrinn gjennomføres i henhold til spesifikasjoner. Teknikkene og prosedyrene utfører generelt i henhold til konvensjonelle metoder innen teknikken og forskjellige generelle referanser som er tilveiebrakt gjennom dette dokumentet. Prosedyrer deri menes å være vel kjent for en fagkyndig på området, og er tilveiebrakt for å gjøre det lettere for leseren. 3 Forskjellige ytterligere betegnelser er definert, eller på annen måte karakterisert her.