(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 076 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 16/46 (06.01) C07K 16/ (06.01) C07K 16/24 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , US, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Janssen Biotech, Inc., 800/80 Ridgeview Drive, Horsham, PA 19044, USA (72) Oppfinner Raghunathan, Gopalan, 32 Merryfield Row, San Diego, CA 92121, USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Fremgangsmåter for bruk av monoklonale antistoffer for tilpasning til mennesker (6) Anførte publikasjoner WO-A-04/0069 WO-A-0/ WO-A-0/11264 KHEE HWANG W Y ET AL: "Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization" METHODS : A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS INC., NEW YORK, NY, US, vol. 36, no. 1, 1 May 0 (0-0-01), pages 3-42, XP ISSN: TAN P ET AL: "SUPERHUMANIZED ANTIBODIES: REDUCTION OF IMMUNOGENIC POTENTIAL BY COMPLEMENTARITY-DETERMINING REGION GRAFTING WITH HUMAN GERMLINE SEQUENCES: APPLICATION TO AN ANTI-CD28" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol. 169, no. 2, 1 July 02 ( ), pages , XP ISSN:

2 1 FREMGANGSMÅTER FOR BRUK AV MONOKLONALE ANTISTOFFER FOR TILPASNING TIL MENNESKER Oppfinnelsesområde Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for å selektere humane variable rammeverk for anvendelse i human tilpasning av ikke-humane monoklonale antistoffer slik som gnagerantistoffer. Rammeverkene kan være av kimlinje eller somatisk opprinnelse. 1 Bakgrunn for oppfinnelsen Human tilpasning av antistoff er en generisk betegnelse som beskriver konstruksjonen av xenogeneiske monoklonale antistoffer (mab er) mot humane terapeutiske mål for maksimalt å erstatte de xenogeneiske sekvenser med humane antistoffsekvenser mens man opprettholder deres antigenbindingsspesifisiteter. Målet er å redusere immunogeniteten til disse antistoffer for å forbedre deres terapeutiske egenskaper. De konstruerte antistoffene som er dannet er også kjent innen teknikken som humaniserte eller CDR-podede antistoffer. 2 For nærværende er den mest omfattende anvendte teknikken for human tilpasning av antistoff kjent som CDR poding. Den vitenskapelige basis i denne teknologi er at bindingsspesifisiteten til et antistoff ligger primært i de tre hypervariable sløyfer som er kjent som de hypervariable områder (CDR er) i dets lett og tung kjede variable regioner (V-regioner), mens de mere konserverte rammeregioner (rammeverk, FW; rammeverkregion, FR) tilveiebringer strukturunderstøttelsesfunksjon. Ved poding av CDR er til en passende selektert FW, kan noe eller all antistoffbindingsaktiviteten overføres til det resulterende rekombinante antistoff. Den førte demonstrasjon på overføringen av spesifisitet ved CDR poding var for en hapten-nitrofenol (Jones et al., Nature 321:22-2 (1986)). 3 Da metodologien for å definere CDR er er godt etablert, er nøkkelen til CDR poding seleksjonen av en mest passende human antistoff akseptor for podingen. Forskjellige strategier er blitt utviklet for å selektere humane antistoff akseptorer med de høyeste likheter med aminosyresekvensene til donor CDR er eller donor FW, eller til donor strukturene. Alle disse beste tilpasning strategier, mens de synes som svært rasjonelle, er i realiteten basert på en antakelse, dvs. at et resulterende rekombinant antistoff som er mest tilsvarende (i aminosyresekvens eller i struktur) med det originale antistoff vil best bevare den opprinnelige antigenbindingsaktivitet. Mens disse

3 2 strategier alle er blitt vellykket anvendt for å danne terapeutiske antistoffer (f.eks. WO 0/11264), Tempest et al., Biotechnology 9: (1991), Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), Co et al., J. Immunol. 12: (1994)), har den underliggende hypotesen aldri blitt seriøst testet. Et potensielt problem for beste tilpasning strategiene er at kriteriene til beste tilpasninger er matematiske, men ikke nødvendigvis biologiske. Skikkethet målt ved graden av homologi er f.eks. summen av numeriske verdier som overføres til identiske, homologe og forskjellige aminosyrerester eller nukleinsyresekvenser. Skjønt disse fastsatte verdier i stor grad er blitt validert i mange andre homologi evalueringssystemer, vil de fine forskjellene som ikke vil være signifikante for andre systemer kunne være viktige for å beregne de beste tilpasninger i human antistoff tilpasning. 1 Et beslektet problem er, gitt to akseptorer med identisk eller svært nærliggende grad av total skikkethet for donoren, deres lokale skikkethet i forskjellige FR er som kan være forskjellig. Kort fortalt, har en matematisk modell ennå ikke blitt validert til å tilfredsstille kravet for beregning av de beste tilpasninger i donor- akseptor sammenheng i antistoffkonstruksjon. 2 En ytterligere komplikasjon vedrører interaksjonene mellom de to kjedene til et antistoff: en beste tilpasning tung kjede akseptor og en beste tilpasning lett kjede akseptor vil eventuelt ikke passe med hverandre for best å bevare bindingsaktiviteten til donoren. Ikke noe verktøy er tilgjengelig for å evaluere interkjede skikkethet. Forskere har paret tunge og lette kjeder til en rekke antistoffer mot den samme epitopen for å forsøke å finne en bedre paring. Dette har imidlertid ikke blitt forsøkt ved human antistofftilpasning. 3 Teoretisk er alle kimlinje sekvensene blitt sekvensert og er tilgjengelige for antistoff FW søk. I praksis er imidlertid størstedelen av humane V regioner som til nå er blitt anvendt i antistoffhumanisering fra modne antistoffgener, ofte dem av myelom proteiner. De vil sannsynlig inneholde somatiske mutasjoner. Disse mutasjoner er unike for individet hvorfra de rearrangerte genene ble avledet, og vil følgelig bli sett på som fremmede av andre individer. Kimlinje databasesekvenser er generelt mere egnet for antistoffhumanisering ut fra dette perspektiv. Der er imidlertid kun noen få dusin V gener og færre J gener tilgjengelige. Således, i noen tilfeller, kan det være vanskelig å finne et kimlinje rammeverk som er svært kompatibelt med den ikkehumane sekvensen. I motsetning, er antallet tilgjengelige modne humane antistoff

4 3 gensekvenser noen få størrelsesordner høyere enn de humane kimlinje sekvensene. Det er således svært sannsynlig at man kan oppnå en kompatibel sekvens i dette større datasett. 1 Et problem med å anvende modne antistoffgener for akseptor FW er at ikke alle av de potensielle V-J kombinasjonene for lett kjede eller V-D-J kombinasjonene for tung kjede er representert i de modne genene. Således kan det oppstå situasjoner hvor et nær matchende V gen kobles til et dårlig matchende J segment. Humaniseringen av mus anti-tac monoklonalt antistoff beskrevet av Queen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)) er et eksempel. Sammenlikning av anti-tac VH regionen med NBRF-PIR databasen ( indikerer at VH regionen av det humane myelom protein Eu hadde den høyeste grad av homologi (7 % identisk over VDJ H ). Rammeverk 4 i Eu V H regionen har imidlertid en rekke aminosyrer, antakelig kodet for av Eu J H segmentet, som er atypiske for humane J H segmenter. Dette resulterte i en dårlig match mellom Eu rammeverket 4 og det til anti-tac. Separat sammenligning av anti-tac J H regionen (rammeverk 4 og rammeverket 4 proksimal ende av CDR3) med aminosyresekvensen til de kjente funksjonelle humane J H segmentene (hvorav der er 6) indikerer at human J H 4 er en mye bedre match enn Eu J H. Dette eksempel foreslår at separate sammenligninger av V og J elementer er mere fordelaktig enn sammenligning av samtlige variable regioner mellom gnager og humane antistoffsekvenser. For nærværende, er et verktøy for denne typen av separat sammenligning ikke lett tilgjengelig. 2 Ikke alle aminosyrer i CDR ene er involvert i antigen binding. Det er således blitt foreslått at podingen av kun de rester som er kritiske i antigenantistoff interaksjon den såkalte spesifisitetsbestemmende restpoding (SDR-poding) ytterligere vil øke innholdet av humane antistoffsekvenser i det resulterende rekombinante antistoff (Kashmiri et al., Methods 36:2-34 (0); Gonzales et al., Mol Immunol. 40: (04)). Anvendelsen av denne strategi krever informasjon om antistoffstrukturen så vel som antistoff-antigen kontaktrester, som ganske ofte er utilgjengelig. Selv når slik informasjon er tilgjengelig, er der ingen systematisk metode for pålitelig identifisering av SDR ene, og SDR-poding forblir så langt for det meste på grunnforskningsnivået. 3 Nylig er en ny strategi som betegnes human framework shuffling blitt utviklet (Dall Acqua et al., Methods 36:43-60 (0)). Denne teknikk arbeider ved ligering av DNA fragmenter som koder for CDR er til DNA fragmenter som koder for human FR1,

5 4 FR2, FR3 og FR4, og danner således et bibliotek av alle kombinasjoner mellom donor CDR er og humane FR er. Mens denne strategi er blitt vellykket anvendt, er der to potensielle problemer. For det første, vil FR ene i det resulterende antistoff, mens alle er av humane kilder, sannsynligvis være fra ikke-tilgrensende FW er, og derfor unaturlige. Det gjenstår å se om disse unaturlige FW er vil være immunogene i mennesker. For det andre kan biblioteket teoretisk være uoverkommelig stort, og stiller et høyt krav til resurser når det gjelder screening og analyse. Der eksisterer således et behov for forbedrede metoder for å fremstille human-tilpassede antistoffer Kort beskrivelse av tegningene Figur 1 viser et flytskjema for den humane tilpasning av en museantistoff tung kjede ved anvendelse av en database av human kimlinje tunge kjeder. Figur 2 viser et flytskjema for den humane tilpasning av en museantistoff lett kjede ved anvendelse av en database av human kimlinje lette kjeder. Figur 3 illustrerer antistoffgen rekombinering for tung og lett kjede variable regioner. Figur 4 viser et flytskjema for en antistoffutformingsalgoritme. Dersom et vanlig strukturelt templat ikke er tilgjengelig, blir kjedene utformet individuelt og kombinert. pdb betegner protein databank databasen ( Figur viser en sammenligning av VH regioner mellom human-tilpasset C7 og kimerisk infliksimab (mus VH). Tankestreker angir identiske rester. Figur 6 viser en sammenligning av VL regioner mellom human-tilpasset C7 og kimerisk infliksimab (mus VL). Tankestreker angir identiske rester. Figur 7 viser ELISA bindingstitreringskurver for full lengde human-tilpasset C7, infliksimab syntetisert på huset (C3) og kommersiell REMICADE, varemerke for infliksimab. Figur 8 viser en sammenligning av VH regioner mellom det human-tilpassede M21M og mus anti-rsv F1 antistoff. Tankestreker angir identiske rester. Figur 9 viser en sammenligning av VL regioner mellom det human-tilpassede B21M og mus anti-rsv F1 antistoffet. Tankestreker angir identiske rester. Figur viser F proteinbinding ELISA for kimerisk anti-rsv F1 antistoff, SYNAGIS som er varemerket til pavilizumab og human-tilpasset B21M. Figur 11 viser sammenligning av F proteinbinding ELISA for de fem human-tilpassede molekyler B26A, B26, B28A, B28B og B21M.

6 1 2 3 Oppsummering av oppfinnelsen Et aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å selektere humane kimlinje antistoffsekvenser for anvendelse i fremstillingen av human-tilpassede antistoffmolekyler som omfatter trinnene med: a. oppnåelse av en peptidsekvens for en ikke-humant antistoff variabel region; b. beskrivelse av de hypervariable områdene (CDR er) og rammeverkregioner (FR er) av ikke-humant antistoff variabel region peptidsekvensen; c. tilveiebringelse av et bibliotek av human kimlinje antistoff gen peptidsekvenser som omfatter VH, V, V, JH, J og J gen sub-biblioteker; d. selektering av en undergruppe av peptidsekvenser fra det humane kimlinje genbibliotek som har maksimum CDR og FR sekvenslikheter med det ikkehumane antistoffet; e. selektering av en undergruppe av human kimlinje antistoff tung kjede sekvensen valgt i trinn d basert på: e1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter av CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og e2. sekvenslikheter for CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; f. selektering av en undergruppe av human kimlinje antistoff lett kjede sekvensene valgt i trinn d baser på: f1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter for CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og f2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; g. selektering av en undergruppe av tung kjede J gen peptidsekvenser fra det humane kimlinje JH gen subbiblioteket basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 i det ikke-humane antistoffet og JH gen regioner; h. selektering av en undergruppe av J gen peptidsekvenser for den lette kjeden fra human kimlinje J og J gen sub-biblioteker basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 i det ikke-humane antistoffet og J og J genregioner; i. kombinering av en seleksjon av FR 1, 2 og 3 fra trinn e og en seleksjon av FR4 fra trinn g for humane tunge kjeder for å velge humant antistoff tung kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer; og j. kombinering av en seleksjon av FR 1, 2 og 3 fra trinn f og en seleksjon av FR4 fra trinn h for humane lette kjeder for å selektere humant antistoff lett kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer.

7 6 1 2 Et annet aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å selektere humane antistoffsekvenser som inneholder somatisk mutasjon for anvendelse i fremstillingen av human-tilpassede antistoffmolekyler som omfatter trinnene med: a. oppnåelse av en peptidsekvens for en ikke-humant antistoff variabel region; b. beskrivelse av de hypervariable områder (CDR er) og rammeverk regioner (FR er) til ikke-humant antistoff variabel region peptidsekvensen; c. tilveiebringelse av et bibliotek av humant somatisk antistoff gen-peptidsekvenser; d. selektering av en undergruppe av peptidsekvenser fra det humane somatiske genbibliotek som har maksimum CDR og FR sekvenslikheter med tunge og lette kjeder til det ikke-humane antistoffet; e. selektering en undergruppe av humant somatisk antistoff tung kjede sekvensene valgt i trinn d for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer basert på: e1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og e2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikkehumane antistoffet; og f. selektering av en undergruppe av humant somatisk antistoff lett kjede sekvensene valgt i trinn d for anvendelse i fremstillingen av human-tilpassede antistoffer basert på: f1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og f2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikkehumane antistoffet. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Som anvendt heri og i kravene, inkluderer entallsformene en, ett, og og den/det flertallform dersom sammenhengen klart ikke indikerer noe annet. Referansen til et human-tilpasset antistoff er således f.eks. en referanse til ett eller flere humantilpassede antistoffer. 3 Dersom ikke definert på annen måte, vil alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som anvendt heri ha den samme betydning som det er vanlig forstått av en fagkyndig på området som denne oppfinnelse er tilegnet. Skjønt metoder som er tilsvarende eller ekvivalente med dem som er beskrevet heri kan anvendes i utføring eller testing av oppfinnelsen, er typiske metoder beskrevet heri.

8 7 1 Betegnelsen antistoff betyr immunoglobulin- eller antistoff-molekyler og antistofffragmenter. Generelt er antistoffer proteiner eller polypeptider som utviser bindingsspesifisitet for et spesifikt antigen. Intakte antistoffer er heterotetramere glykoproteiner, sammensatt av to identiske lette kjeder og to identiske tunge kjeder. Hver lette kjede er typisk koblet til en tung kjede med kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom de tunge kjedene med forskjellige immunoglobulin isotyper. Hver tung og lett kjede har også interkjede disulfidbroer i regelmessig avstand. Hver tung kjede har i en ende et variabelt domene (VH) etterfulgt av en rekke konstante domener. Hver lett kjede har et variabelt domene i en ende (VL) og et konstant domene i den andre enden; idet det konstante domenet til den lette kjeden er sammenstilt med det første konstante domenet til den tunge kjeden og lett kjede variabel domenet er sammenstilt med det variable domenet til den tunge kjeden. Antistoff lette kjeder til hvilke som helst virveldyrarter kan tilskrives en eller to klart distinkte typer, nemlig kappa ( ) og lambda ( ) basert på aminosyresekvensene til deres konstante domener. Immunoglobuliner kan plasseres i fem hovedklasser, nemlig IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, avhengig av tung kjede konstant region aminosyresekvensen. IgA og IgG er videre sub-klassifiserte som isotypene IgA 1, IgA 2, IgG 1, IgG 2, IgG 3 og IgG 4. 2 Antistoffer er utskilte proteiner som konstitutivt uttrykkes og utskilles av plasmaceller. Antistoffer kan også produseres ved å anvende plasmaceller som er udødeliggjorte ved standard metoder slik som hybridom generering eller ved transfeksjon av antistoff tung og/eller lett kjede gener til en udødeliggjort B celle slik som en myelomcelle eller andre celletyper, slik som kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, planteceller og insektceller. Betegnelsen antistoff-fragmenter betyr en del av et intakt antistoff, generelt antigen bindingsregionen eller variabel region av det intakte antistoff. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab, F(ab ) 2 og Fv fragmenter, diabodies, enkeltkjede antistoffmolekyler, slik ScFv molekyler hvor de variable tunge og lette kjedene er koblet som en enkelt polypeptidkjede ved en linker og multispesifikke antistoffer er dannet fra minst to intakte antistoffer. 3

9 8 Humaniserte, human-tilpassede og CDR-podede antistoffer er kimære monoklonale antistoffer som inneholder CDR er fra en ikke-human art og variabel region rammeverkregioner og konstante regioner fra et humant antistoff. 1 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny strukturbasert human tilpasningsmetode basert på molekylstrukturer, modellering og sekvenser for human konstruksjon av antistoffmolekyler. Metoden resulterer i humane antistoffmolekyler hvis sekvenser er svært like humane sekvenser (for å redusere potensiell immunogenitet) og hvis affiniteter til antigen er sammenlignbare med det ikke-humane, typisk mus, moderantistoffet. Trinnene i prosessen omfatter å sammenligne en musesekvens med en database av humane sekvenser for total homologi av hele sekvensen overfor forskjellige lokale regioner og anvende en rekke filtre for å identifisere humane kandidatsekvenser. Seleksjonskriterier for slike filtre inkluderer preservering av sløyfelengder til mus CDR er i humane sekvenser, sekvenshomologi-sløyfer og eventuelt anvendelsen av en rekke eksplisitte og avledbare gjenkjenningstrekk som bestemt ved å konstruere molekylmodeller av antistoffer. 2 Det er vanlig kjent at overføring av CDR er fra et ikke-humant antistoff til et humant rammeverk resulterer i en reduksjon i binding til antigenet. Den reduserte affinitet skyldes tap i den molekylære gjenkjenning mellom antigenet og det human-tilpassede antistoffet. Den underliggende årsaken for tapet i fri energi er de strukturelle endringene i antistoffoverflaten i den endrede antistoff-antigen grenseflaten. Denne grenseflate involverer alle 6 CDR er, 3 hver i VL og VH og induserte også strukturelle forandringer i regionen som skyldes endret pakking av den nye VL og VH. For å oppnå noe av den tapte affiniteten, har en rekke grupper muterte rester i de humane rammeverkene til muserester, som i litteraturen omtales som tilbakemutasjoner. Den humane tilpasningsmetoden som beskrevet i denne søknad krever ikke introduksjon av tilbakemutasjoner. Retensjon av affinitet av de human-tilpassede antistoffer skyldes rasjonale anvendt i seleksjonen av rammeverk. Rammeverket er valgt ikke bare på grunnlag av totale sekvensidentiteter over hele molekylet men også basert på sløyfelengden og sekvensidentiteter til alle 6 CDR sløyfer, 3 hver i VL og VH. Et slikt rasjonale sikrer minimale perturbasjoner i gjenkjenningsoverflaten til antistoffet og følgelige affiniteten av antistoffet til antigenet, når man beveger seg fra et ikkehumant til et human-tilpasset antistoff. 3 En kombinasjon av sekvens og strukturbaserte kriterier anvendes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen inkluderer metoder for å

10 9 ekstrahere og analysere sekvenser og strukturer i databaser slik som human immunoglobulin database ved NCBI ( og human kimlinje immunoglobulin database ( vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) og proteinstruktur database ( 1 Kimlinje V og J gensekvenser ble nedlastet fra VBase ( vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) database. VBase er et omfattende register for alle human kimlinje variabel region sekvensene som er sammenstilt for over tusen publiserte sekvenser, som inkluderer dem i de for nærværende frigivelser av Genbank og EMBL data bibliotekene. Databasen er blitt utviklet over en rekke år ved MRC Centre for Protein Engineering som en forlengelse av arbeid på sekvenseringen og kartleggingen av humane antistoffgener. Databasen inneholder sekvenser for tung og lett kjede V og J gener. Et rammeverk består av fire korte rammeverkregioner (FR). Som man ser i figur 3, er FR1, FR2 og FR3 sammen med CDR1, CDR2 og en del av CDR3 kodet for av kimlinje V genfragmentet, mens FR4 er kodet for av kimlinje J genfragmentet. For å søke ikke-human sekvens mot humane antistoffsekvenser som inneholder somatiske mutasjoner, kan den humane immunologidatabasen fra NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) anvendes. 2 3 Der er to systemer av CDR anvisninger for antistoffer som er omfattende anvendt for sekvensbeskrivelse. Kabat CDR definisjonen er basert på antistoffsekvens variabilitet. Chothia CDR definisjonen er basert på tredimensjonale strukturer av antistoffer og topologier av CDR sløyfene. I framgangsmåten ifølge oppfinnelsen, anvendes en konsensus av de to metodene for å definere CDR er. I tilfellet av lett kjede CDR ene, anvendes Kabat definisjonen. I tilfellet av tung kjede CDR3, er både Kabat og Chothias definisjon identiske og begge kan anvendes. I tilfellet av tung kjede CDR1, starter Kabat definisjonen åtte rester etter det første cysteinet, mens Chothias definisjon starter tre rester etter dette cystein. I dette tilfellet, ble Chothia definisjonen anvendt. Kabat definisjonen anvender et sluttmønster for CDR1 som er en W etterfulgt av en hydrofob aminosyre slik som V, I eller A. Chothias definisjon ender 4 rester tidligere for dette CDR. I dette tilfellet, ble Kabat mønsteret for CFR2 ende definisjonen anvendt. I tilfellet av VH-CDR2, ble Kabats definisjon anvendt. I de fleste antistoffstrukturer, vil imidlertid denne sekvensbaserte definisjonen plassere en del av FR3 som å tilhøre CDR2. Således kan en kortere versjon av dette CDR, som ender 7 rester tidligere på den C-terminale regionen av dette CDR, også anvendes. I noen tilfeller konstrueres en molekylær modell av mus variabel regionen. Modellen anvendes som

11 en guide for CDR sløyfe utpekinger. Tabell 1 viser typiske CDR utpekinger som kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Tabell 1 CDR sløyfer Startdefinisjon Endedefinisjon VL-CDR1 Kabat Kabat VL-CDR2 Kabat/Chothia Kabat VL-CDR3 Kabat Kabat VH-CDR1 Chothia Kabat VH-CDR2 Kabat Kabat, Kabat-7 VH-CDR3 Kabat/Chothia Kabat(Chothia) De ovennevnte definisjoner av CDR er anvendes for å identifisere humane sekvenser som har de beste totale likheter og også maksimal lengde kompatibiliteter og sekvenslikheter i CDR sløyfene til den ikke-humane sekvensen. Flytskjemaer over fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for seleksjon av human kimlinje tung og lett kjede er vist i figurer 1 og 2. 1 Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer seleksjon av humane sekvenser som tilfredsstiller de etterfølgende kriterier: 1. De humane sekvensene har signifikant identitet med musesekvens over hele molekylets lengde, som dekker alle 4 rammeverk og 3 CDR er. 2. De humane sekvensene har maksimal preservering av lengder av CDR er 1, 2 og 3, dvs. en sammenstilling av humane sekvenser og musesekvenser har det minste antall delesjoner og insersjoner i 3 CDR ene. 3. Blant sekvenser i den humane databasen, har selekterte sekvenser signifikant homologi med musesekvensen i CDR er 1, 2 og 3. 2 I en utførelsesform av fremgangsmåten for å selektere humane antistoffsekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffmolekyler, omfatter trinnene det etterfølgende: a. Oppnåelse av en peptidsekvens for en ikke-humant antistoff variabel region, idet det ikke-humane antistoffet typisk er fra en gnager slik som en mus eller en rotte. Peptidsekvensinformasjon kan utledes fra nukleotidsekvensene til ikke-humant antistoff variabel region genene. Disse genene kan isoleres, klones og sekvenseres ved teknikker som er vel kjent for de fagkyndige på området.

12 b. Beskrivelse av CDR ene og FR ene til ikke-humant antistoff variabel region peptidsekvensen. c. Tilveiebringelse av et bibliotek av human kimlinje antistoff gen peptidsekvenser som omfatter VH, V, V, JH, J og J gen sub-biblioteker. d. Selektering av en undergruppe av peptidsekvenser fra det humane kimlinje gen- biblioteket som har maksimale CDR og FR likheter med det ikke-humane antistoffet, idet ikke-humane sekvenser søkes for likheter mot kimlinje gen databasen over hele lengden ved anvendelse av BLAST programmet (Altschul et al., J. Mol. Biol. 21:403-4 (1990)) og toppkandidater med beste BLAST skår, velges. Dette trinn gjennomføres for tunge og lette kjeder. Ikke-human tung kjede søkes mot human kimlinje VH gener; ikke-human lett kjede søkes mot human kimlinje V og V gen sub-biblioteker. e. Selektering av en undergruppe av humant antistoff tung kjede sekvensene selektert i trinn d basert på sammenligning av lengdekompatibiliteter av CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoff, og sekvenslikheter for CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoffet, idet en komposittskår anvendes for å vurdere de ovennevnte to kriterier. En standard mutasjonsmatriks, slik som BLOSUM 62 substitusjonsmatriksen (Hemikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: (1992)) anvendes for skår-sammenstillinger for CDR regionene til ikkehumane og humane sekvenser, og en stor straff pålegges dersom der er en insersjon og/eller delesjon i CDR sløyfene. Prosessen er blitt automatisert ved å anvende Pipeline Pilot TM protokoller ( modular software development enviroment som er tilgjengelig fra Accelrys, Inc., San Diego, CA). En bruker kan eventuelt vurdere skår og sekvenssammenstillinger og velge en gruppe av humane kimlinjegener for anvendelse for FR er 1, 2 og 3. f. Selektering av en undergruppe av humant antistoff lett kjede sekvensene valgt i trinn d basert på sammenligning av lengdekompatibiliteter for CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet og sekvenslikheter av CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet, idet en komposittskår anvendes for å vurdere de ovennevnte to kriterier som omtalt ovenfor i trinn e. g. Selektering av en undergruppe av tung kjede J gen peptidsekvenser fra human kimlinje JH gen sub-biblioteket basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 av det ikke-humane antistoffet og JH gen regioner. h. Selektering av en undergruppe av J gen peptidsekvenser for den lette kjeden fra human kimlinje J og J gen sub-bibliotekene basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 av det ikke-humane antistoffet og J og J gen regioner.

13 12 i. Kombinering av en seleksjon av FR1, 2 og 3 fra trinn e og en seleksjon av FR4 fra trinn g for humane tunge kjeder for å selektere humant antistoff tung kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer. j. Kombinering av en seleksjon av FR1, 2 og 3 fra trinn f og en seleksjon av FR4 fra trinn h for humane lette kjeder for å selektere humant antistoff lett kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer. Hele prosessen kan automatiseres ved å anvende Pipeline Pilot TM skriftsystemer i et visuelt arbeidsflytmiljø. Brukeren kan anvende bestemte brukerdefinerte kriterier i prosessen slik som fremvising av skår, tilsvarende sammenstillinger og navn av kimlinje gener eller innstilling av antall utbyttesekvenser. 1 Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes med databaser av humant antistoff kimlinjegen eller databaser av humant antistoffgen som inneholder somatiske mutasjoner. I tilfellet av anvendelse en database for humant antistoffgen med somatiske mutasjoner, involverer trinn e) og f) lengdekompatibiliteter og sekvenslikheter til alle tre CDR er og der er ikke behov for trinn g) og h). Variabel lett og tung kjede sekvensene som oppnås kan anvendes for å danne et Fab eller flere Fab er. Ved å kombinere disse Fab er med passende konstante regioner, kan man oppnå fulllengde monoklonalt antistoff sekvenser. 2 I tillegg til sekvensbaserte metoder, kan struktur/modell-baserte tilnærminger også anvendes. Molekylære modeller av ikke-humant antistoff V regionene er svært anvendbare for å utlede strukturelle trekk for molekylet og følgelig for konstruksjon for å forbedre egenskaper av interesse. Kvalitet for modellen er svært viktig og i tilfellet av modeller basert på et homologt strukturelt templat, er pålitelig sammenstilling av targetsekvenser og templatsekvenser svært kritisk. Se f.eks. Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234:779 (1993). Flytskjemaet som er blitt vist i figur 4 anvendes for å selektere et strukturelt templat for modellering. Figuren viser at et templat velges basert på total homologi av den fulle sekvens av VL eller VH som inkluderer alle 4 rammeverk og alle 3 CDR er og deretter rangerer topptreff basert på sløyfelengde og også sekvenslikheter for 3 CDR ene. 3 Anvendelsen av molekylmodeller i kombinasjon med sekvenssammenligninger er en nyttig mulighet da sekvensbaserte metoder i seg selv eventuelt ikke gir et bilde av funksjonelle egenskaper som oftest skyldes 3-dimensjonale trekk som involverer romlig nærliggende rester som i sekvens er separert. Sekvensbasert Kabat klassi-

14 13 fisering utpeker del av rammeverk i antistoffstrukturen som tilhørende til CDR. Molekylære modeller anvendes for korrekt å beskrive rammeverk og CDR regioner og således korrigere de sekvensbaserte tildelinger. En kombinasjon av strukturell modellering og sekvensanalysemetoder anvendt her er anvendbar for seleksjonen av humane rammeverk og også for affinitetsmodning av et humantilpasset antistoff. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny antistoff human tilpasningsmetode. Metoden anvender human kimlinje V og J gener som en kilde for akseptor FW sekvenser, rangerer alle akseptormolekylene basert på FW likheter og andre kriterier mellom ikke-humant antistoff og humane kimlinjesekvenser, og danner et bibliotek av representative human-tilpassede antistoffer. 1 Algoritmen som definert ovenfor kan modifiseres for å forandre størrelsen av FW bibliotek for å matche våt-lab screeningkapasitet. For gnagerantistoff tunge og lette kjeder, vil de tilsvarende FW bibliotekene henholdsvis dannes, og alle de humantilpassede tunge og lette kjeder vil kombineres for screening. Således øker den totale FW bibliotekstrategi-algoritmen til oppfinnelsen sannsynligheten for å finne gunstige par av humane tunge og lette kjeder med optimale interkjede interaksjoner som sannsynlig er viktig for affinitetretensjon. 2 Etter seleksjon av gunstige par av human tung og lett kjede rammeverk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan et humantilpasset nytt molekyl konstrueres som inkluderer hver av CDR regionene fra ikke-human variabel region og rammeverk regionene fra minst ett medlem av human tung og lett kjede representative rammeverk som er valgt, hvor det nye molekylet er et human-tilpasset antistoff eller antistoffragment som binder det samme antigenet som det som bindes ved det ikkehumane antistoffet. Rekombinante DNA teknikker som er vel kjent for de fagkyndige på området kan anvendes for å konstruere de human-tilpassede molekylene. De nye molekylene kan deretter velges ved screening av hvert molekyl for bindingsaffinitet til antigen, og det optimale human-tilpassede antistoff eller antistoff-fragment kan velges. 3 Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en rekke fordeler fremfor nåværende humane tilpasningsteknikker. I motsetning til alle andre strukturbaserte strategier, slik som SDR-poding, krever f.eks. fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke detaljert antistoff eller antigen-antistoff kompleks strukturinformasjon. En annen fordel med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at den kan tilveiebringe en rekke

15 14 sammenlignbare, men likevel distinkte humaniserte antistoffer for den samme CDR donoren. Dette er særlig anvendbart for terapeutisk antistoffutvikling, som muliggjør forskere å velge en lederkandidat og ha en eller flere etterfølgende eller backup kandidater. En annen beslektet fordel med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at disse sammenlignbare kandidater, med deres distinkte sekvenser, kan han forskjellige kjemiske, fysiologiske og farmasøytiske egenskaper. Dette kan anvendes i andre aspekter av terapeutisk antistoff-forbedring. CDR ene til antistoff med lav solubilitet kan f.eks. tilpasses et humant rammeverk bibliotek, og et godt bindemiddel med forbedret solubilitet kan velges fra de resulterende antistoffene. Den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives med henvisning til de etterfølgende eksempler. 1 Eksempel 1 2 Human tilpasning av et kimært monoklonalt antistoff Infliksimab er et kimært IgG monoklonalt antistoff med en omtrentlig vekt på 149 kda. Infliksimab binder spesifikt til human tumor nekrosefaktor-alfa (TNF ) og er sammensatt av humane konstant og murine variable regioner (se figur 16A & 16B i US patent nr for infliksimab aminosyresekvenser (ca2)) og selges under handelsnavnet REMICADE. Infliksimab har en tung kjede variabel region på 119 aminosyrer (SEK ID NR: 1) og lett kjede variabel region på 7 aminosyrer (SEK ID NR: 2). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble anvendt for infliksimab tung og lett kjede variabel region sekvensene for å selektere human kimlinje VH og VL. Den valgte VH region er identisk med human kimlinjesekvens VH og JH4. Den sammenlignes med infliksimab rammeverkregioner i figur. Rammeverkdelen av den valgte VL regionen, vist i figur 6, er identisk med den humane kimlinje sekvens VK1 A og JK3. Den valgte VH region sekvens ble kombinert med en human konstant kjede IgG H, CAA70 (med A236V substitusjon). Den valgte VL region sekvens ble kombinert med en human konstant kjede IgG, CAA Antistoffer ble evaluert for binding til human TNF ved anvendelse av ELISA format. Kort ble human TNF belagt i brønner av en 96 brønns plate, og kandidat mab er ble

16 1 inkubert ved forskjellige konsentrasjoner ( til 0,2 ng/ml) og bundet antistoff ble detektert med HRP-merket anti-human kappa lett kjede IgG (Jackson, ImmunoResearch, West Grove, PA). ELISA titreringskurve for full-lengde klonet (betegnet C7) er vist i figur 7 og indikerte sammenlignbarhet med full-lengde syntetisk infliksimab (C3) og REMICADE. Bindingsmålinger av TNF binding til C7 og REMICADE ved BIACOR (3 par av forsøk) er vist i tabell 2 og viser også sammenlignbarhet for de to antistoffene. Tabell 2 Antistoff K ass (1/Ms) K diss (1/s) Beregnet K D (pm) REMICADE,47 1,37x 9,68,64x Strukturbasert 8,03 0,93x,63 0,94x - 70 humantilpasset C7 Eksempel 2 1 Human tilpasning av et murint monoklonalt antistoff Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble anvendt på et murint nøytraliserende respiratorisk syncytialvirus (RSV) F proteinantistoff betegnet anti-rsv 1F for å selektere human kimlinje VH og VL for å konstruere humantilpasset anti-rsv antistoff B21M. 1F antistoff har en tung kjede variabel region på 1 aminosyrer (SEK ID NR: 3) og en lett kjede variabel region på 112 aminosyrer (SEK ID NR: 4). 2 Rammeverket av den valgte VH region er identisk med human kimlinjesekvens VB_2-0 og JH4. Det sammenlignes med mus anti-rsv F1 rammeverkregionene i figur 8. Den valgte VH region sekvens ble kombinert med en human konstant kjede P0187- IgG 1 (med V234A substitusjon). Rammeverket av den valgte VL region er identisk med human kimlinje sekvens VB_B3 og JK1. Det sammenlignet med mus anti-rsv F1 rammeverkregionene i figur 9. Den valgte VL region sekvens ble kombinert med en human konstant kjede P01834-IgG k (med S227L substitusjon). Antistoffene ble vurdert for binding til det ekstracellulære domenet av rekombinant uttrykt RSV F protein ved anvendelse av et ELISA format. Kort, ble humant RSV F protein belagt i brønnene til en 96-brønns plate og kandidat mab er ble inkubert ved forskjellige konsentrasjoner ( til 0,2 ng/ml) og bundet antistoff ble detektert med HRP merket anti-humant kappa lett kjede antistoff (Jackson, ImmunoResearch, West

17 16 Grove, PA). ELISA titreringskurve for det human-tilpassede full-lengde B21M klonet er vist sammen med den for 1F antistoff og det kommersielle produkt SYNAGIS, varemerket til pavilizumab i figur. Det human-tilpassede B21M indikerte sammenlignbarhet med mus 1F antistoffet og SYNAGIS. Bindingsmålinger som målt ved BIACOR for RSV F proteinbinding er vist i tabell 3 og viser også sammenlignbarhet for de to antistoffer. B21M utviser også virusnøytralisering som er sammenlignbar med kimært anti-1f antistoff og SYNAGIS (se tabell 3). Tabell 3: Overflate Plasmon resonansdata og virusnøytraliseringsdata for B21M, Synagis og Numax Synagis NumaxTM** B21M KD (mm) 0,4 (+/- 0,007) 0,24 (+/- 0,09) 1,7 (+/- 0,1) (Biacore) Kon 8,7 x,2 x 9,2 x Koff 3, x -4 1,2 x x -4 IC 0 for 4,0 0,01, 0,01 13,9 0,01 virusnøytralisering (n=3) (N=3) (n=3) (ng/ml) 1 For å teste gyldigheten av metoden ble fire ytterligere lette kjeder som var selektert som topp-treff i den humane tilpasningsmetode anvendt for å konstruere humantilpassede anti-rsv antistoffer. De fire rammeverk er identiske med humane sekvenser VB_A17, VB_A, gi:10128 og VB_A3. De første to sekvensene og den fjerde sekvensen er fra human kimlinje database og den tredje er en HuIg sekvens. Disse fire VL er i kombinasjon med ovennevnte VH omtales som B21M, B26A, B26B, B28A og B28B. Alle disse fire molekyler har bindingsprofiler tilsvarende B21M (se figur 11).

18 17 PATENTKRAV Fremgangsmåte for å selektere humane antistoffsekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffmolekyler som omfatter trinnene med: a. oppnåelse av en peptidsekvens for en ikke-humant antistoff variabel region; b. beskrivelse av de hypervariable områder (CDR er) og rammeverkregioner (FR er) til ikke-humant antistoff variabel region peptidsekvensen; c. tilveiebringelse av et bibliotek av human kimlinje antistoff gen peptidsekvenser omfattende VH, V, V, JH, J og J gen sub-biblioteker; d. selektering av en undergruppe av peptidsekvenser fra det humane kimlinje genbiblioteket som har maksimum CDR og FR sekvenslikheter med tung og lett kjede av det ikke-humane antistoffet; e. selektering av en undergruppe av human kimlinje antistoff tung kjede sekvensene valgt i trinn d basert på: e1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter for CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og e2. sekvenslikheter for CDR1 og CDR2 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; f. selektering av en undergruppe av human kimlinje antistoff lett kjede sekvensene valgt i trinn d baser på: f1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter for CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og f2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og en del av CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; g. selektering av en undergruppe av tung kjede J gen peptidsekvenser fra det humane kimlinje JH gen sub-biblioteket basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 av ikke-humant antistoff og JH gen regioner; h. selektering av en undergruppe av J gen peptidsekvenser for den lette kjeden fra human kimlinje J og J gen sub-biblioteker basert på sekvenslikheter mellom rammeverk 4 av det ikke-humane antistoffet og J og J gen regioner; i. kombinering av en seleksjon av FR 1, 2 og 3 fra trinn e og en seleksjon av FR4 fra trinn g for humane tunge kjeder for å selektere humant antistoff tung kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer; og j. kombinering av en seleksjon av FR 1, 2 og 3 fra trinn f og en seleksjon av FR4 fra trinn h for humane lette kjeder for å selektere humant antistoff lett kjede sekvenser for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer.

19 Fremgangsmåte for å selektere humane antistoffsekvenser som inneholder somatiske mutasjoner for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffmolekyler som omfatter trinnene med: a. oppnåelse av en peptidsekvens for et ikke-humant antistoff variabel region; b. beskrivelse av de hypervariable områder (CDR er) og rammeverk regioner (FR er) av ikke-humant antistoff variabel region peptidsekvensen; c. tilveiebringelse av et bibliotek av humant somatisk antistoff gen peptidsekvenser; d. selektering av en undergruppe av peptidsekvenser fra det humane somatiske genbibliotek som har maksimum CDR og FR sekvenslikheter med tunge og lette kjeder av det ikke-humane antistoffet; e. selektering av en undergruppe av humant somatisk antistoff tung kjede sekvensene valgt i trinn d for anvendelse i fremstilling av human-tilpassede antistoffer basert på: e1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter av CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og e2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikkehumane antistoffet; og f. selektering av en undergruppe av humant somatisk antistoff lett kjede sekvensene selektert i trinn d for anvendelse i fremstillingen av humantilpassede antistoffer basert på: f1. sammenligning av lengde-kompatibiliteter av CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikke-humane antistoffet; og f2. sekvenslikheter for CDR1, CDR2 og CDR3 sløyfer med det ikkehumane antistoffet. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, som ytterligere omfatter trinnet med å konstruere et humant tilpasset nytt molekyl som inkluderer hver av CDR regionene fra den ikke-humane variable region og rammeverkregioner fra minst ett medlem av de valgte humane tung og lett kjede representative rammeverk, hvor det nye molekylet er et humantilpasset antistoff eller antistoff-fragment som binder det samme antigenet som det bundet ved det ikke-humane antistoffet Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvor det human-tilpassede antistoffet er et fulllengde monoklonalt antistoff.

20 19. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor det full-lengde monklonale antistoffet er av type IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE eller IgA.

21

22 21

23 22

24 23

25 24

26 2

27 26

28 27

29 28

30 29

31