europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. C07K 16/28 ( ) A61K 39/275 ( ) C07K 16/30 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , EP, (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Stichting Sanquin Bloedvoorziening, Plesmanlaan 125, 1066 CX Amsterdam, NL- Nederland (72) Oppfinner VAN DEN BERG, Timo Kars, Jachthavenweg 10B, 1076 CZ Amsterdam, NL- Nederland (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 0104 OSLO, Norge (54) Benevnelse PREPARATER OG METODER FOR Å FORBEDRE IMMUNFORSVARET (56) Anførte publikasjoner EP-A JP-A US-A WO-A-02/ WO-A-2007/ WO-A-99/40940 S. E. Strome ET AL: "A Mechanistic Perspective of Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Beyond Target-Related Effects", The Oncologist, vol. 12, no. 9, 1 September 2007 ( ), pages , XP , ISSN: , DOI: /theoncologist

2 EP B1 PREPARATER OG METODER FOR Å FORBEDRE IMMUNFORSVARET Beskrivelse [0001] Oppfinnelsen er relatert til området molekylær medisin. Spesielt er den relatert til preparater og fremgangsmåter for å forbedre klaringen av avvikende celler, for eksempel kreftceller eller virusinfiserte celler, av vertens immunsystem. Blant annet gir det en forbedret effektivitet i behandling av humane pasienter med et terapeutisk antistoff, særlig gjennom en økning i antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). [0002] Immunsystemet forsvarer kroppen mot infeksjoner, sykdom og fremmede stoffer. Det er satt sammen av mange organer og celler. Et antigen er et stoff som får immunsystemet til å utføre en spesifikk respons, kalt immunresponsen. Virus, bakterier, bakterier og parasitter inneholder stoffer som normalt ikke finnes i kroppen, og fører dermed til en immunrespons. Immunresponsen kan føre til ødeleggelse av antigenet, og alt det er en del av, eller som det er festet til. Flere forskjellige typer celler er involvert i immunsystemets respons på et antigen. Blant cellene er makrofager, granulocytter, dendrittiske celler, naturlige dreperceller og lymfocytter. Blant lymfocytt-cellene er B-celler (B-lymfocytter), T-celler (T-lymfocytter), dreper-t-celler, og hjelper-t-celler. [0003] Kreftceller har stoffer på sine ytre overflater som kan fungere som antigener og dermed "merke" cellene som forskjellige eller unormale. Virus, bakterier og parasitter har komponenter som er vesentlig forskjellig fra normale humane celler, fordi de er helt fremmed for kroppen, og blir detektert av immunsystemet. Det kan imidlertid hende at forskjellene mellom kreftceller og normale humane celler er vanskeligere for immunsystemet å detektere. Kreftimmunterapier, typisk ved bruk av monoklonale antistoffer,

3 - 2 - er utformet for å hjelpe immunsystemet til å gjenkjenne kreftceller og/eller styrke immunresponsen på kreftcellene, og derved ødelegge kreften. [0004] Ulike terapeutiske strategier på mennesker er basert på bruk av terapeutiske antistoffer. Dette inkluder, for eksempel, bruk av terapeutiske antistoffer utviklet for å utarme målceller, særlig syke celler som for eksempel virusinfiserte celler, tumorceller eller andre patogene celler. Slike antistoffer er typisk monoklonale antistoffer av IgG-typen, vanligvis med humant IgGl eller IgG3 Fc-delen. Disse antistoffene kan være opprinnelige eller rekombinante antistoffer, humaniserte muse-antistoffer (dvs. innbefattende funksjonelle domener fra forskjellige arter, vanligvis Fc-delen av human eller ikke-human primatopprinnelse, og variable region, eller komplementær bestemmende region (CDR) av museopprinnelse). Alternativt kan det monoklonale antistoffet være fullstendig humant gjennom immunisering i humane Ig-locus transgene mus eller skaffet gjennom cdnabiblioteker avledet fra humane celler. Et spesielt eksempel på slike terapeutiske antistoffer er rituximab (MabThera ; Rituxana), som er et kimerisk anti-cd20 monoklonalt antistoff laget med human y1 og k konstante regioner (derfor med humant IgGl Fc-del) som er koblet til murine variable domener som overdrar CD20-spesifisitet. I de siste årene har rituximab betydelig endret den terapeutiske strategien mot B lymfoproliferative krefttyper, spesielt non-hodgkins lymfom (NHL). Andre eksempler på humaniserte IgGl antistoffer omfatter alemtuzumab (Campath, som brukes i behandlingen av maligne B-celler, eller trastuzumab (Herceptin ), som brukes ved behandling av brystkreft. [0005] Terapeutiske antistoffer oppnår sin terapeutiske effekt gjennom ulike mekanismer. De kan ha en direkte effekter på produksjon av apoptose, eller programmert celledød i f.eks. tumorceller. De kan blokkere vekstfaktorreseptorer, og effektivt stoppe proliferasjon av tumorceller.

4 - 3 - [0006] Indirekte virkninger inkluderer rekruttering av celler som har cytotoksisitet, som monocytter og makrofager. Denne typen antistoff-mediert celledrap kalles antistoffavhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC). Monoklonale antistoffer kan binde komplement, og føre til direkte celletoksisitet, kjent som komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC). [0007] Mens terapeutiske antistoffer representerer en ny spesifikk og effektiv tilnærming til behandling av mennesker, spesielt for behandling av tumorer, viser de ikke alltid en sterk effekt. For eksempel, mens rituximab, alene eller i kombinasjon med kjemoterapi, er vist å være effektiv ved behandling av både lav- og middels høy grad av NHL, har 30 % til 50 % av pasienter med lav grad av NHL ikke noen klinisk respons på rituximab. Det har blitt foreslått at nivået av CD20-ekspresjon på lymfomceller, nærvær av store tumormasser på tidspunktet for behandling eller lave serumkonsentrasjoner er rituximab forklarer den manglende effekt for rituximab hos noen pasienter. Likevel er de faktiske årsakene til behandlingssvikt fortsatt i stor grad ukjent. Det er derfor et behov innen bransjen for å øke effektiviteten av terapeutiske antistoffer. [0008] Også gitt antall antistoffer som har blitt testet ved kreftindikasjoner, kunne en ha forutsett at antikreft antistoffer ville omfatte det store flertallet av stoffer på listen over FDA-godkjente legemidler. Men bare fire av de 12 antistoff-legemidlene på denne listen er målrettet for kreftbehandling, og dette er i stor grad på grunn av mangel på fordeler for pasienten. Det er interessant at det nå er blitt klart at en av de viktigste grunnene til dette, er at kreftcellene (som sine friske motstykker) er relativt motstandsdyktig mot immunmedierte drapsmekanismer. Mekanismen for denne tilsynelatende motstand til kreftceller mot vertsimmunitet er ikke blitt klarlagt.

5 - 4 - [0009] Et mål med den foreliggende oppfinnelsen er derfor å identifisere midler og metoder for å forbedre immunforsvaret og immunterapi mot avvikende celler, for eksempel kreftceller. Spesielt er det et mål å øke in vivo-effekten av en terapeutisk forbindelse som kan utløse en verts immuneffektor-celler mot en avvikende celle. [0010] Det er interessant at oppfinnerne har oppdaget en endogen mekanisme som begrenser dreping av avvikende celler, f.eks. kreftceller, med immuneffektor-celler (se figur 1). Denne mekanismen involverer den molekylære interaksjonen mellom CD47, som finnes på overflaten av så godt som alle celler i kroppen av verten med kreftceller, og SIRPα, som uttrykkes spesifikt på immunceller, spesielt på makrofager og granulocytter (Adams et al., J.Immunol. 161: ). Viktigere var at blokkering av interaksjonen mellom CD47 og SIRPα med antagonistiske antistoffer mot en av de to komponentene ble funnet å dramatisk styrke in vitro dreping av kreftceller i nærvær av anti-kreftcelle antistoffer (figur 2). Denne effekten ble bekreftet i en murin lungetumormodell i SIRPα-mutante mus (figur 3). Disse dataene viser at binding av CD47 til SIRPα genererer et hemmende signal som undertrykker ADCC av immunsystemet. Uten ønske om å være bundet av teori, er det en hypotese at interferens med det hemmende signalet via SIRPα fører til en forbedret aktivitet av immuneffektor-celler mot avvikende celler, antagelig via en økning av ADCC-mekanismen. [0011] Ett aspekt ved oppfinnelsen er derfor relatert til et preparat som omfatter (i) en terapeutisk forbindelse som kan utløse en verts immuneffektor-celler mot en avvikende celle og (ii) minst et middel som kan redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα. For eksempel brukes et middel som er i stand til å hemme interaksjonen mellom SIRPα og CD47, slik at det hemmende signalet via CD47/SIRPα-interaksjon blir redusert. En vert er et

6 - 5 - pattedyr, fortrinnsvis en primat- eller gnager, mer foretrukket et menneske. [0012] Den terapeutiske forbindelsen er et terapeutisk antistoff, spesielt et antistoff som induserer eller fremmer antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Som anvendt her, er ADCC også ment å omfatte antistoffavhengig cellulær fagocytose (ADCP). Nevnte terapeutiske antistoff er i stand til å danne et immunkompleks. I en utførelsesform har det terapeutiske antistoffet en human eller ikkehuman primat IgG Fc-del. Fortrinnsvis er det terapeutiske antistoffet et monoklonalt antistoff, eller et funksjonelt fragment eller et derivat derav, fortrinnsvis et humanisert, humant eller kimerisk antistoff. Nevnte fragment eller et derivat derav blir fortrinnsvis valgt fra et Fabfragment, et F(ab')2-fragment, et CDR og et scfv. I en spesiell utførelse, er det terapeutiske antistoffet et FDAgodkjent terapeutisk antistoff, som rituximab, herceptin, trastuzumab, alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab eller panitumumab. Se for eksempel Strome et al., Oncologist 2007;12; [0013] I henhold til oppfinnelsen, brukes et middel som kan redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα til delvis eller fullstendig å blokkere hemmende signal via CD47/SIRPα-komplekset. Midler i stand til å redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα, f.eks. ved hemming av interaksjonen mellom SIRPα og CD47, er kjent innen faget, og ytterligere midler kan bli identifisert ved bruk av kjente teknikker basert på avlesning av nedstrøms signaleringshendelser. For eksempel er interaksjonen av celleassosiert CD47 med SIRPα uttrykt på overflaten av myeloide celler kjent for å forårsake SIRPα tyrosinfosforylering, og for å fremme rekruttering og/eller aktivering av tyrosinfosfatasene SHP-1 og SHP-2, så vel som flere andre signaleringsproteiner til den cytoplasmiske delen av SIRPα-proteinet (Oldenborg PA et al.

7 - 6 - (2000) Science 288: , Oshima et al. (2002) FEBS letters 519:1-7). Disse komponentene, og særlig SHP-1, og kanskje også SHP-2, er kjent for å fremme de negative effektene av SIRPα-utløsing med hensyn til forskjellige nedstrømseffekter, inkludert fagocytose av antistoff- eller komplementbelagte røde blodlegemer (Oldenborg PA et al. (2001) J Exp Med. 193:855-62), og er derfor forventet å også fremme den hemmende reguleringen av ADCC. Terapeutiske midler som hemmer CD47/SIRPα-interaksjon vil på samme måte også forhindre rekruttering og/eller aktivering av SHP-1, SHP-2, og/eller noen av de andre angitte signalmolekylene. Et stoff som reduserer eller hindrer hemmende signaloverføring initiert via humane CD47/SIRPα-interaksjoner under ADCC kan velges ved hjelp av en rekke analyser med mål å oppdage: i) reduksjon av CD47/SIRPα-interaksjoner generelt (Liu et al. (2007) J Mol Biol. 365:680-93, Liu et al. (2004) J. Immunol. 172: ) (figur 4), ii) reduksjon av CD47-avhengig tyrosinfosforylering av SIRPα, og/eller SHP-1- rekrutteringen til SIRPα og påfølgende aktivering av SHP-1- tyrosinfosfataseaktivitet (Oldenborg PA et al. (2000) Science 288:2051-4), og/eller iii) økning av ADCC ved hjelp av terapeutiske antistoffer (f.eks. trastuzumab, rituximab) mot tumorer (Mimura K et al. (2007) Oncology. 72:172-80, Shimadoi S et al. (2007) Cancer Sci. 98: , Lefebvre ML et al. (2006) J Immunother. 29: ), eller andre celler (f.eks. røde blodlegemer). [0014] WO99/40940 beskriver ligander for CD47 og midler som binder til nevnte ligander, som CD47-antistoffer og SIRPα, for behandling av inflammatoriske, autoimmune og allergiske sykdommer, transplantatavvisning og/eller kronisk lymfatisk leukemi. [0015] Det har blitt rapportert at ligasjon av SIRPα, med spesifikke antistoff Fab-fragmenter kan undertrykke produksjonen av betennelsesmediatorer med makrofager (Van den Berg et al., J. Leukocyte Biol. 1999; pg. 16)

8 - 7 - [0016] WO02/ er relatert til polynukleotider og polypeptider relatert til modulering av SIRPα/CD47- interaksjoner. [0017] Armant et al. beskriver at anti-cd47 monoklonale antistoffer selektivt undertrykker IL-12-avgivelsen med monocytter (J. Exp. Med. Vol. 190, 1999, pg ). [0018] Van den Berg et al. rapporterer at aktiverte makrofager er den viktigste årsaken til vevsskade under betennelse i CNS. Tre antistoffer som binder til SIRPαreseptoren hos rotter ble valgt (J. Neuroimmunology, Vol. 90, 1998, pg. 53). [0019] US2003/ beskriver en metode for behandling av en autoimmun sykdom med makrofaginvolvering, omfattende å administrere et middel som hemmer interaksjonen mellom CD47 og SIRPα. Der er det også beskrevet metoder for identifisering av slike midler. [0020] Imidlertid har bruken av et CD47/SIRPα-hemmende middel som beskrevet her, nemlig å forsterke en verts immuneffektor-celler, ikke blitt beskrevet eller foreslått innen bransjen. [0021] Et "middel" eller "antagonist", som referert til her, kan i det vesentlige være et hvilket som helst molekyl eller prosess som er i stand til å oppnå den ønskede funksjon, nemlig å redusere eller hindre CD47/SIRPα-indusert undertrykking av cytolytisk og/eller fagocytisk respons av immuneffektor-celler (se fig. 1). Denne funksjonen oppnås hensiktsmessig ved å hemme eller forstyrre CD47/SIRPαinteraksjonen. "Hemming" av CD47/SIRPα-interaksjonen betyr at den funksjonelle sammenhengen mellom de to molekylene blir endret, for eksempel for å redusere eller eliminere drepe-undertrykkende virkninger på makrofagen av CD47. For

9 - 8 - eksempel kan den biologiske interaksjonen mellom SIRPα og CD47 bli redusert eller endret, og dermed hindre hemmende signalering indusert gjennom SIRPα. Alternativt kan den hemmende signaleringen gjennom SIRPα hindres uten å faktisk påvirke samspillet med CD47. Det er gitt et antistoff eller antistoff-fragment som antagoniserer CD47/SIRPα, hvor nevnte antistoff er et anti-cd47-eller anti-sirpα antistoff eller fragment derav, og et ytterligere terapeutisk antistoff som omfatter et humant eller ikke-humant primat IgG Fc-del som induserer antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), for bruk ved behandling av kreft, hvor nevnte antagoniserende antistoff øker antistoff-mediert ødeleggelse av tumorceller utløst av nevnte ytterligere terapeutiske antistoff. [0022] Hemmende molekyler av forskjellige typer er kjent innen bransjen, og kan brukes som en basis for utforming av midler i henhold til foreliggende oppfinnelse. En eller flere midler av samme eller av en annen type (f.eks. lite molekyl og antistoff) kan brukes. I en utførelsesform omfatter en sammensetning et proteinøst stoff i stand til å hemme interaksjonen mellom CD47 og SIRPα. Det er et peptid, et antistoff eller antistoff-fragment. [0023] Antistoffer eller antistoff-fragmenter kan lett fremstilles og testes som beskrevet nedenfor, ved hjelp av teknikker som er kjent innen faget. For eksempel omfatter en sammensetning som antagonist av CD47/SIRPα-indusert signalering et anti-cd47-antistoff, et anti-sirpα-antistoff, eller et fragment derav. [0024] Egnede CD47/SIRPα-hemmende midler for bruk i foreliggende oppfinnelse kan velges ved hjelp av en (høyt gjennomløp) in vitro-analyse som omfatter ko-inkubasjon av tumorceller og makrofager i nærvær av et terapeutisk antistoff mot tumorcellene og ved testing av effektiviteten til kandidatstoffene f.eks. et panel av monoklonale antistoffer

10 - 9 - mot enten CD47 eller SIRPα, for å styrke antistoffavhengig dreping. Se også Eksempel 1. For eksempel, fagocytose og cytolyse av dyrkede humane brystkreftceller av humane monocytt-avledede makrofager (MDM) eller myelomonocytiske cellelinjer som er mediert av et terapeutisk antistoff kan påvises i nærvær og fravær av en kandidat til et antagonistmiddel. Slike analysesystemer er kjente innen faget. For eksempel kan rensede monocytter dyrkes med GM-CSF, M-CSF, eller ikke noe cytokin i fem eller seks dager. Analyser av antistoffavhengig cellulær fagocytose (ADCP) og cytolyse (ADCC) kan utføres med MDM og HER-2/neu-positive målceller (SK-BR-3). ADCP kan måles ved to-farget fluorescensstrømningscytometri ved bruk av PKH2 (grønt fluorescerende fargestoff) og fysoerytrin-konjugerte (røde) monoklonale antistoffer (MoAb) mot humant CD14 og CD11b. ADCC kan hensiktsmessig bli målt med etablerte radioaktive 51-Cr frigjøringsanalyser, eller med et kommersielt ikke-radioaktivt LDH deteksjonssett. Imidlertid kan andre metoder også anvendes. [0025] Som det vil forstås, blir den foreliggende oppfinnelsen fordelaktig benyttet for å forbedre in vivoeffektiviteten av en terapeutisk forbindelse som kan utløse en verts immuneffektor-celler mot en hvilken som helst form for avvikende celle. Som anvendt heri refererer "avvikende celle" til en hvilken som helst sykelig eller på annen måte uønsket celle i en vertsorganisme. [0026] I en utførelsesform er den en kreftcelle. For eksempel, er det en non-hodgkins lymfomcelle, en brystkreftcelle, en kronisk lymfatisk leukemicelle eller en kolorektal kreftcelle. [0027] Åpenbart gir blokkering av CD47/SIRPα-interaksjoner med egnede antagonister stort håp om å øke antistoffmediert ødeleggelse av kreftceller. I prinsippet kan den

11 ekstra verdien av å løse begrensningene med antistoffterapi mot kreft oppstå på minst tre forskjellige nivåer: 1. Ved å redusere terskelen for kreftcelledrepingen, kan doseringen og/eller hyppigheten av behandlingen med antistoff senkes, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av kostnadene. Dette har betydning, da produksjon av antistoff-terapeutika, som er generelt humaniserte rekombinante proteiner, er kostbart. 2. Kurerings- og overlevelsesrater kan øke betydelig ved å øke den totale effektiviteten av antistoffterapi. 3. Økende ADCC kan ha en dramatisk effekt på omfanget av antistoff-terapeutika som ville være egnet for klinisk anvendelse. Mange antistoff-terapeutika som ellers ikke ville ha fordelaktige virkninger, kan i kombinasjon med CD47/SIRPα-antagonister vise seg å være effektive. Faktisk, bør en rekke av de antistoff-terapeutika som så langt ikke har vist tilstrekkelig aktivitet i studier kanskje revurderes. [0028] En av styrkene til konseptet ifølge foreliggende oppfinnelse er i dets brede anvendelighet. I prinsippet kan det forventes å potensiere effekten av et hvilket som helst terapeutisk antistoff mot kreft, spesielt de som utøver sine effekter, i det minste delvis, ved ADCC. Videre kan terapeutiske antistoffer som ikke har vist noen ADCCkomponent i fravær av CD47/SIRPα-interferens, være i stand til å heve en gunstig ADCC-respons ved blokkering av CD47/SIRPα-interaksjoner. Som angitt før, er de fleste FDAgodkjente terapeutiske antistoffer av human IgG1- underklassen, som i prinsippet kan forventes å være effektive indusere av ADCC. Således kan foreliggende oppfinnelse praktiseres i kombinasjon med flertallet av terapeutiske antistoffer.

12 [0029] En utførelsesform av oppfinnelsen er relatert til bruk av et middel som kan redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα, som hemmer interaksjonen mellom SIRPα og CD47, i fremstillingen av et medikament for behandling eller profylakse av en sykdom eller lidelse som vil dra nytte av økt fagocytose med makrofager. Eksempler på sykdommer som vil dra nytte av økt fagocytose med makrofager inkluderer kreft, som non-hodgkins lymfom, brystkreft, kronisk lymfatisk leukemi eller kolorektal kreft. [0030] Faktisk kan behandling eller profylakse av enhver sykdom eller lidelse hvor avvikende eller på annen måte uønskede celler er involvert, dra nytte av bruk av et hemmende middel som her beskrevet. I et aspekt er nevnte sykdom en virusinfeksjon, særlig infeksjoner forårsaket av et medlem av familien Poxviridae. Som det vil forstås, kan et hemmende middel, eller en kombinasjon av to eller flere forskjellige hemmende midler, brukes i fremstillingen av et medikament i kombinasjon med en ytterligere terapeutisk forbindelse. I en foretrukket utførelsesform, kan nevnte ytterligere terapeutiske forbindelse utløse en verts immuneffektorceller mot en avvikende celle. [0031] I ett aspekt er oppfinnelsen relatert til en metode for å øke ADCC i et subjekt som mottar kreftbehandling, nevnte fremgangsmåte omfatter å administrere til nevnte subjekt i forkant av, samtidig, før eller etter at administrering av et antikreftmedikament et stoff i stand til å redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα i en mengde tilstrekkelig til å øke ADCC. For eksempel er nevnte antikreftmedikament et terapeutisk antistoff som hemmer interaksjonen mellom SIRPα og CD47. Subjektet som skal behandles er for eksempel en pasient som lider av non-hodgkins lymfom, brystkreft, kronisk lymfocytisk leukemi, eller kolorektal kreft.

13 [0032] I et relatert aspekt, er det gitt en metode for å øke ADCC i et subjekt som mottar terapeutisk antistoffbehandling, nevnte metode omfatter å administrere til nevnte individ i forkant av, samtidig, før eller etter administrering av nevnte terapeutiske antistoff et middel som kan redusere eller forhindre at hemmende signal transduksjon initieres via SIRPα i en mengde tilstrekkelig til å øke ADCC. [0033] Dessuten gir oppfinnelsen en metode for å øke effektiviteten av en terapeutisk antistoffbehandling i et subjekt, nevnte metode omfatter å administrere til nevnte individ i forkant av, samtidig, før eller etter administrering av nevnte terapeutiske antistoff et middel som kan redusere eller forhindre at hemmende signal transduksjon initieres via SIRPα. [0034] Det er også beskrevet bruk av et middel som kan redusere eller forebygge hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPα for behandling eller profylakse av en virusinfeksjon. Generelt vil en hvilken som helst metode som fremmer vertens immunsystem til å reagere mer effektivt mot viruset, sannsynligvis øke vertens naturlige og ervervede (f.eks. ved vaksinering) immunitet mot viruset. Det er beskrevet bruk av et middel som kan hemme interaksjonen mellom SIRPα og CD47 for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av sykdommer forårsaket av koppevirus. Koppeviruser (medlemmer av familien Poxviridae) kan som familie infisere både virveldyr og virvelløse dyr. Prototypen av koppevirusfamilien er vaccinia-virus, som har blitt brukt som en vellykket vaksine for å utrydde koppevirus. Vaccinia-virus er også brukt som et effektivt verktøy for fremmedproteinuttrykk for å framkalle sterk immunrespons hos verten. Navnet på familien, Poxviridae, er en arv fra den opprinnelige grupperingen av virus assosiert med sykdommer som produserte kopper i huden. Moderne virusklassifisering er basert på form og molekylære egenskaper ved

14 virusene, og koppevirus er fortsatt det mest bemerkelsesverdige medlemmet av familien. Det eneste andre koppeviruset som er kjent for å spesifikt infisere mennesker er molluscum contagiosum virus (MCV). Selv om Verdens helseorganisasjon (WHO) erklærte viruset offisielt utryddet i 1977, har amerikanske og britiske styresmakter etter 11 september 2001 [0035] hatt økt bekymring om bruk av kopper eller koppelignende sykdommer, innen biologisk terrorisme. [0036] Det har blitt etablert at koppeviruser koder en homolog av CD47, kalt viral CD47 (vcd47). Ved å samhandle med SIRPα på immuneffektorceller, fremmer foreliggende oppfinnere den hypotese at vcd47, i tillegg til endogent CD47, kan gi negative signaler som hindrer dreping og/eller fagocytose av koppevirusinfiserte celler. Det beskrives et preparat som omfatter (i) en terapeutiske forbindelse som kan utløse en verts immuneffektorceller mot en virusinfisert celle, for eksempel en celle infisert av koppevirus, og (ii) minst et middel som kan redusere eller forebygge hemmende signaloverføring initiert via SIRPα. Egnede terapeutiske forbindelser omfatter virusvaksiner, fortrinnsvis en koppevirusvaksine. [0037] Det er også beskrevet bruk av et hemmende middel for å redusere eller forhindre hemmende signaltransduksjon initiert via SIRPalpha for eksempel indusert av vcd47/sirpαinteraksjon, for å (i) øke vertens naturlige motstand mot infeksjon av koppevirus-patogener, (ii) å øke virkningen av vaksinering mot koppevirus-patogener) og/eller (iii) å forbedre effektiviteten av vaksinering med koppevirusvektorer, som vaccinia. FORKLARINGER TIL FIGURENE [0038]

15 Figur 1. Modell for rollen til CD47 og SIRPα i å begrense antistoffavhengig dreping av tumorceller av immunsystemet og potensering av tumorcelle-ødeleggelse ved å blokkere CD47/SIRPα-interaksjoner. Antistoffer rettet mot tumorcellene blir gjenkjent av immuncelle Fc-reseptorer, og dette induserer tumorcelle-dreping. Under normale forhold (venstre panel) begrenses denne antistoff-induserte drepingen av interaksjonen til CD47 på tumorcellene med SIRPα på immuncellene, som genererer et intracellulært signal som negativt regulerer dreperesponsen. Ved å blokkere interaksjonen mellom CD47 og SIRPα (høyre panel) forbedres antistoffindusert dreping av tumorceller fordi den blir frigitt fra denne begrensningen. Figur 2: Blokkering CD47/SIRPα-interaksjoner med antagonistiske monoklonale antistoffer øker CC52 antistoffavhengig cellulær fagocytose av rotte CC531 kolonkarsiomceller ved rotte NR8383 makrofager. CC531 tumorceller og NR8383 makrofager ble inkubert på kulturplater med medium i fravær eller nærvær av CC52 antistoff mot CC531 celler og/eller blokkerende monoklonale antistoffer mot enten CD47 eller SIRPα. Etter 1,5 timer ble andelen av ADCP bestemt. For detaljer, se Eksempel 1. Figur 3: SIRPα-deriverte signaler begrenser dreping av B16 tumorceller in vivo. CD47-uttrykkende B16 melanomceller ble injisert i kontrollmus (dvs. villtype) eller i mus som mangler SIRPα cytoplasmisk hale som medierer intracellulær signalering i immunceller (dvs. SIRPα-/-). Grupper av mus ble behandlet annenhver dag i 2 uker med en suboptimal dose av terapeutisk antistoff TA99 rettet mot gp75 tumorantigenet tilstede på B16-cellene. En uke senere ble dyrene avlivet og lungetumorbelastningen ble kvantifisert. Representative bilder (panel A) fra lungene til disse musene viser at det i så godt som ingen dannelse av tumorer i antistoffbehandlede SIRPα-/- mutante mus, sammenlignet med antistoff-

16 behandlede villtype mus, noe som identifiserer en negativ rolle til SIRPα-signalering i tumorcelleeliminering in vivo. Hvert punkt på grafen (panel B) representerer evaluering av et enkelt dyr. *, P <0,005, studenter T-test. Figur 4: ADCC av humane monocytter mot Jurkat akutt T leukemiceller blir forbedret ved å blokkere CD47/SIRPαinteraksjoner. (B) Overflateuttrykk av CD3 (ved hjelp av CLB-T3/4.2a mab) og CD47 (ved hjelp av B6H12 mab) og på Jurkat-celler vurdert med strømningscytometri. (B) ADCC av humane monocytter mot Jurkat-celler etter forinkubering med mus IgG2a anti-cd3 (20 mg/ml) og/eller B6H12 (50 μg/ml), anti-cd47 F(ab')2. Metning av Jurkat-celler med anti-cd47 F(ab')2 ble bekreftet ved parallell strømningscytometrisk farging (data ikke vist). Legg merke til at så godt som ingen dreping er indusert av anti-cd3 i fravær av CD47/SIRPα-blokkering, mens betydelige nivåer av dreping blir fremkalt i nærvær av anti-cd47 F(ab')2. Verdier som vises er middelverdier ± SD (n=3) fra et representativt eksperiment ut av tre. Figur 5: Rituximab-mediert ADCC av humane monocytter mot Raji Burkitts B-celle lymfomceller er forbedret ved å blokkere CD47/SIRPα-interaksjoner. (B) Overflateuttrykk av CD20 (ved hjelp av anti-cd20 Rituximab) og CD47 (ved hjelp av anti-cd47 B6H12 mab) og på Raji-celler vurdert med strømningscytometri. Rødt histogram representerer kontroll og blått histogram representerer Rituximab- (øvre histogram) eller CD47-farging (nedre histogram) (B) ADCC av humane monocytter mot Raji-celler etter forinkubering med Rituximab (20 mg/ml) og/eller B6H12 (10 mg/ml ) anti-cd47. ADCC ble utført ved et effektor:mål-forhold på 50:1. Merk at Rituximab-mediert dreping av Raji-celler er betydelig forbedret med anti-cd47 mab. Verdier som vises er middelverdier ± SD (n=3) fra et representativt eksperiment. * statistisk signifikant forskjell, p < 0,05.

17 [0039] Oppfinnelsen er eksemplifisert med de følgende eksemplene. Eksempel 1: In vitro bevis for en rolle til CD47/SIRPα interaksjoner i ADCC. [0040] For å undersøke bidraget av CD47/SIRPα-interaksjon under ADCC av tumorceller med makrofager ble det brukt en analyse hvor CC531 rotte kolonkarcinom-celler ble inkubert med CC52 antistoff og rotte NR8383 effektorcellemakrofager. Materialer og metoder [0041] Rotte CC531 kolonkarcinom-celler og NR8383 rotte alveolære makrofager ble rutinemessig dyrket i RP-MI medium inneholdende 10 % kalvefosterserum (FCS) (Gibco BRL) og antibiotika. CC531 ble løsnet fra vevskolbene ved skraping, vasket i PBS og merket med 5 μm DiI (molekylære sonder) i 15' ved RT. Etter vasking av 3,75 x 10 5 CC531- celler, enten forinkubert eller ikke i 15' med 5 μg/ml ble anti-rotte-cd47-antistoff OX101 inkubert i en rundbunnet 96-brønners vevskultur plastplate i 200 μl av HEPES-buffret RPMI-1640 inneholdende 0,5 % BSA, med 1,25 x 10 5 NR8383- celler, enten forinkuberte eller ikke i 15' med 5 mg/ml anti-rotte-sirpα-antistoff ED9 eller dets Fab'-fragmenter, i nærvær eller fravær av CC531-reaktiv mab CC52 (1 mg/ml). Etter inkubering i 90' ved 37 C ble cellene vasket og farget ved hjelp av makrofagspesifikk biotinylert antistoff ED3 (rettet mot rotte-sialoadhesin) og FITC-merket streptavidin. ADCP (uttrykt som % av NR8383 som har inntatt DiImerkede CC531-celler) ble bestemt på et FACScan strømningscytometer (Becton and Dickinson). Resultater:

18 [0042] I fravær av blokkerende antistoffer mot CD47 (OX101) eller SIRPα (ED9) observeres bare svært lite antistoffavhengig cellulær fagocytose, mens i nærvær av slike antistoffer blir CC531 lett fagocytert (Fig. 2). Dette viser at interaksjoner mellom CD47/SIRPα på henholdsvis tumorceller og makrofageffektorceller kan regulere negativt ADCC in vitro. Eksempel 2: In vivo bevis for en rolle til SIRPαsignalering ved antistoffavhengig dreping av tumorceller. [0043] For å demonstrere at SIRPα gir signaler som hemmer dreping av tumorceller in vivo, sammenlignet vi antistoffavhengig dreping av tumorceller i villtype og SIRPα-mutante mus (Yamao (2002) J Biol Chem. 277: ) ved hjelp av en in vivo B16F10-mus melanommodell (Bevaart L et al. (2006) Cancer Res. 66:1261-4). De SIRPα-muterte musene mangler den fullstendige cytoplasmiske halen, inkludert ITIM-motivene som fungerer som docking-steder for SHP-1 og SHP-2. Materialer og metoder: [0044] Unge voksne (7 uker gamle) C57B1/6 villtype eller SIRPα-mutante mus (Yamao (2002) J Biol Chem. 277: ) ble injisert iv. 1,5 x 10 5 B16F10 melanomceller (i 100 ml saltvann, hentet fra National Cancer Institute (Frederick, MD), i fravær eller tilstedeværelse av terapeutisk antistoff TA99 (10 μg/mus på dag 0, 2, 4, 7, 9, og 11 etter tumorcelle-injeksjon). Etter 21 dager ble dyrene avlivet, og antallet metastaser og tumorbelastning i lungene ble bestemt som beskrevet (Bevaart L et al. (2006) Cancer Res. 66:1261-4). Resultater:

19 [0045] Som man kan se på figur 3, var det en vesentlig lavere grad av tumorutvikling i SIRPα-mutante mus, sammenlignet med villtype mus ved bruk av suboptimale konsentrasjoner av terapeutisk monoklonalt antistoff TA99. Disse resultatene viser at SIRPα er en negativ regulator av dreping av tumorceller in vivo. Eksempel 3: [0046] For å gi ytterligere bevis for en negativ rolle til CD47/SIRPα-interaksjoner i dreping av tumorceller med myeloidceller, etablerte vi en ADCC-analyse ved bruk av humane CD47-uttrykkende Jurkat T-celle leukemiceller, opsonisert med et murint IgG2a anti-cd3 antistoff (Van Lier RA et al. Eur J Immunol. 1987;17: ) som et mål (fig. 4A), og humant SIRPα-uttrykkende monocytter som effektorceller, og brukte dette til å teste effekten av antistoffer som blokkerer CD47/SIRPα-interaksjoner. ADCC-analyse [0047] Monocytter ble isolert ved magnetisk cellesortering ved hjelp av anti-cd14 belagte perler i henhold til produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec BV, Utrecht, Nederland) fra PBMC isolert ved tetthetssentrifugering ved hjelp av isotonisk Percoll (Pharmacia Uppsala, Sverige) fra heparinisert blod hentet fra friske frivillige. Cellene ble dyrket i 16 timer i fullstendig RPMI supplert med 5 ng/ml rekombinant, humant GM-CSF (Pepro Tech Inc, USA), høstet ved mild trypsinbehandling, og vasket. Jurkat-celler (5-8 x 10 6 celler) ble oppsamlet og merket med 100mCi 51Cr (Perkin-Elmer, USA) i 1 ml i 90 minutter ved 37 C. Hvor indikert ble cellene forinkubert med anti-cd47 og/eller anti- CD3, og vasket på nytt. Monocytter ble høstet og utsådd i 9-brønns U-bunn vevskulturplater i RPMI med 10 % FCSmedium. Målcellene (5 x 10 3 /brønn) og effektorceller ble samkultivert i 96-brønners U-bunn vevskulturplater i kom-

20 plett medium i et forhold på E:T = 50:1 i 4 timer ved 37 C, 5 % CO2. Porsjoner av supernatanten ble høstet og analysert for radioaktivitet i en gammateller. Prosenten relativ cytotoksisitet ble bestemt som [(eksperimentell cpm - spontan cpm)/(total cpm - spontan cpm)] x 100 %. Alle prøver ble testet i triplikat. Resultater: [0048] Som man kan se i fig. 4B. anti-cd3-mediert ADCC mot Jurkat-celler som uttrykker høye nivåer av overflate-cd47 (fig. 4A), er potent og synergistisk forbedret ved mettende konsentrasjoner av F(ab)'2-fragmenter av antistoffet B6H12 som blokkerer CD47-binding til SIRPα. Spesielt, i fravær av effektor-anti-cd3 antistoff, ble ingen virkning av anti- CD47 F(ab)'2 observert, noe som tyder på at CD47/SIRPαinteraksjoner opptrer selektivt for å begrense antistoffog Fc-reseptor-mediert innvirkning på dreping av tumorceller. [0049] Samlet viser disse dataene at CD47/SIRPαinteraksjoner, og de resulterende intracellulære signaler generert via SIRPα i myeloidceller, danner en barriere for antistoff-mediert ødeleggelse av tumorceller. Disse resultatene gir en begrunnelse for å bruke antagonister av CD47/SIRPα-interaksjon hos kreftpasienter, med det formål å styrke den kliniske effekten av terapeutiske antistoffer mot kreft. Eksempel 4: Blokkering av CD47/SIRPα-interaksjoner forbedrer effekten av terapeutiske antistoffer mot kreft. [0050] For å demonstrere at blokkering av CD47/SIRPαinteraksjoner faktisk forsterker effekten av etablerte terapeutiske antistoffer mot kreft, utviklet vi en ADCCanalyse ved bruk av humane Raji Burkitt B-lymfomceller som mål, humane monocytter som effektorceller, og et FDA-

21 godkjent terapeutisk antistoff mot CD20 (Rituximab). For detaljer om eksperimentet, se forklaringen til figur 5. Som man kan se i figur 5, var det blokkerende antistoffet mot CD47, B6H12, i stand til å betydelig forbedre Rituximabmediert cytotoksisitet mot Raji-celler.

22 KRAV 1. Et antistoff eller antistoff-fragment som antagoniserer CD47/SIRPα, hvor nevnte antistoff er et anti-cd47- eller anti-sirpα antistoff eller fragment derav, og et ytterligere terapeutisk antistoff som omfatter et humant eller ikke-humant primat IgG Fc-del som induserer antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), for bruk ved behandling av kreft, hvor nevnte antagoniserende antistoff øker antistoff-mediert ødeleggelse av tumorceller utløst av nevnte ytterligere terapeutiske antistoff. 2. Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til krav 1, for bruk i henhold til krav 1, hvor nevnte antagoniserende antistoff er en antagonist av CD47/SIRPα-interaksjonen. 3. Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til krav 1 eller 2, for bruk i henhold til krav 1 eller 2, hvor nevnte antagoniserende antistoff er et anti-cd47 antistoff eller et fragment av dette. 4. Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til krav 1 eller 2, for bruk i henhold til krav 1 eller 2, hvor nevnte antagoniserende antistoff er et anti-sirpα antistoff eller et fragment av dette. 5. Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til et av kravene 1-4, for bruk i henhold til et av kravene 1-4, hvor nevnte antistofffragmentet er et Fab-fragment, F(ab')2-fragment eller et scfv.

23 Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til et av kravene 1-5, for bruk i henhold til et av kravene 1-5, hvor det nevnte ytterligere terapeutiske antistoffet er valgt fra gruppen bestående av rituximab, herceptin, trastuzumab, alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab og panitumumab. 7. Et CD47/SIRPα-antagoniserende antistoff eller antistoff-fragment og et ytterligere terapeutisk antistoff i henhold til et av kravene 1-6, for bruk i henhold til et av kravene 1-6, hvor det nevnte antagonisering antistoffet blir administrert før, samtidig, eller etter administreringen av nevnte ytterligere terapeutiske antistoff. 8. Et preparat som omfatter (i) et antistoff eller antistoff-fragment som antagoniserer CD47/SIRPα, hvor nevnte antistoff er et anti-cd47 eller anti-sirpα antistoff eller fragment derav, og (ii) et ytterligere terapeutisk antistoff, hvor det ytterligere terapeutiske antistoffet er valgt fra gruppen bestående av rituximab, herceptin, trastuzumab, alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab og panitumumab. 9. Et preparat i henhold til krav 8, hvor nevnte antagoniserende antistoff er en antagonist for CD47/SIRPαinteraksjonen. 10. Et preparat i henhold til krav 8 eller 9, hvor nevnte antagoniserende antistoff er anti-cd47 antistoff eller et fragment derav. 11. Et preparat i henhold til krav 8 eller 9, hvor nevnte antagoniserende antistoff er anti-sirpα antistoff eller et fragment derav.

24 Preparat i henhold til ett av kravene 8-11, hvor nevnte antistoff-fragmentet er et Fab-fragment, F(ab')2- fragment eller et scfv.

25 - 24 -

26 - 25 -

27 - 26 -

28 - 27 -

29 - 28 -