Oppfinnelsens område Bakgrunn for oppfinnelsen

Transkript

1 1 Oppfinnelsens område Foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikke bindingsmidler som gjenkjenner og binder angiopoietin-1 (ang-1) og angiopoietin-2 (Ang-2). Mer spesifikt vedrører oppfinnelsen produksjonen, den diagnostiske anvendelsen og den terapeutiske anvendelsen av monoklonale og polyklonale antistoffer, og de antigenbindende fragmentene derav, som spesifikt binder Ang-1 og/eller Ang-2. Aspekter av oppfinnelsen vedrører også hybridomer eller cellelinjer som uttrykker slike antistoffer. De beskrevne antistoffene er nyttige i diagnostikk og i behandlingen av sykdommer som er assosiert med aktiviteten og overproduksjonen av Ang-1 eller Ang-2. Bakgrunn for oppfinnelsen Angiogenese, som er dannelsen av nye blodkar ut fra eksisterende kar, er essensielt i mange fysiologiske og patologiske prosesser. Normalt er angiogenese strengt regulert ved pro- og anti-angiogene faktorer, men i tilfellet med sykdom slik som kreft, okular neovaskulære sykdommer, artritt og psoriasis kan prosessen komme skjevt ut. Folkman, J. Nat. Med., 1:27-31 (199). Et antall sykdommer er kjent for å være assosiert med deregulert eller uønsket angiogenese. Slike sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, okular neovaskularisering slik som retinopatier, diabetisk retinopati, aldersrelatert makular degenerering, psoriasis, hemangiomblastom, hemangiom, arteriosklerose, inflammatorisk sykdom slik so reumatoid eller reumatisk inflammatorisk sykdom, spesielt artritt (inkludert reumatoid artritt) eller andre kronisk inflammatoriske forstyrrelser, slik som kronisk astma, arteriell eller post-transplantat ateriosklerose, endometriose og neoplastiske sykdommer, for eksempel såkalte faste tumorer og flytende (eller hematopoietiske) tumorer (slik som leukemier og lymfomer). Andre sykdommer som er assosiert med uønsket angiogenese er åpenbare for fagfolk på området. Selv om mange signaloverføringssystemer har blitt implisert i reguleringen av angiogenese så involverer ett av de best karakteriserte og mest endotelselektive systemene Tie-2-reseptortyrosinkinasen (referert til som «Tie-2» eller «Tie-2R» (også referert til som «ORK»), murin Tie-2 blir også referert til som «tek») og dens ligander, angiopoietinene (Gale, N.W. og Yancopoulos, G.D., Genes Dev. 13:- 66 [1999]). Det finnes 4 kjente angiopoietiner, angiopoietin-1 («Ang-1») til angiopoietin-4 («Ang-4»). Disse angiopoietinene blir også referert til som «Tie-2- ligander». (Davis, S., et al., Cell, 87: [1996], Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84:118-1 [1999], Holash, J., et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 42: [1999], Koblizek, T.I., et al., Current Biology, 8:29-32 [1998], Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

2 : [1998], Maisonpierre, P.C., et al., Science, 277:-60 [1997], Papapetropoulos, A., et al., Lab. Invest., 79: [1999], Sato, T.N., et al., Nature, 37:70-74 [1998], Shyu, K.G., et al., Circulation, 98:81-87 [1998], Suri, C., et al., Cell, 87: [1996], Suri, C., et al., Science, 282: [1998], Valenzuela, D.M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96: [1999], Witzenbichler, B., et al., J. Biol. Chem., 273: [1998]). Mens Ang-1 sin binding til Tie-2 stimulerer reseptorfosforylering I dyrkede endotelceller så har Ang-2 blitt observert både å agonisere og antagonisere Tie-2- reseptorfosforylering (Davis, S., et al., [1996] ovenfor, Maisonpierre, P.C., et al., [1997] ovenfor, Kim, I., J.K. Kim, et al., Oncogene 19(39): (00), Teivhert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre et al., Cardiovascular Research 49(3):69-70 (01)). Fenotypene til Tie-2- og Ang-1-knockoutmus er tilsvarende og tyder på at Ang-1- stimulert Tie-2-fosforylering medierer remodellering og stabilisering av utviklende blodkar in utero via vedlikehold av endotelcelle-støttecelle-adhesjon (Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8: [1994], Sato, T.N., et al., Nature, 376:70-74 [199], Suri, C., et al., [1996] ovenfor). Rollen til Ang-1 i karstabilisering er antatt å være konservert hos voksne, der den blir uttrykt bredt og konstitutivt (Hanahan, D., Science, 277:48-0 [1997], Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 19: [1999]). I motsetning til dette er uttrykking av Ang-2 primært begrenset til steder med vaskulær remodellering, der den er antatt å blokkere Ang-1-funksjon, for derved å indusere en tilstand med vaskulær plastisitet som bidrar til angiogenese (Hanahan, D., [1997] ovenfor, Holash, J., et al., Science, 284: [1999], Maisonpierre, P.C., et al., [1997] ovenfor). Utallige publiserte undersøkelser har vedvarende vist blodkarselektiv Ang-2- uttrykking i sykdomstilstander assosiert med angiogenese. Disse patologiske tilstandene inkluderer for eksempel psoriasis, makular degenerering og kreft (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 1: [1999], Etoh T., et al., Cancer Research, [01], Hangai, M., et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 42: [01], Holash, J., et al., [1999] ovenfor, Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermatology, 116:713-7 [01], Otani, A., et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 40: [1999], Stratamann, A., et al., American Journal of Pathology, 13: [1998], Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest., 3;34-34 [1999], Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 1: [1999], Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 3: [00], Zagzag, D., et al., [1999] ovenfor). De fleste av disse undersøkelsene har fokusert på kreft, der mange typer tumorer ser ut til å oppvise vaskulær Ang-2-uttrykking. I motsetning til dens uttrykking i patologisk angiogenese er Ang-2-uttrykking i normale vev ekstremt begrenset (Maisonpierre, P.C., et al., [1997] ovenfor, Mezquita, J., et al., Biochemical and

3 3 Biophysical Research Communications, 260: [1999]). I normale voksne er de tre hovedstedene for angiogenese ovariene, placenta og livmor, dette er de primære vevene i normale (dvs., ikke-kreftvev) vev der Ang-2-mRNA har blitt påvist. 1 2 Visse funksjonelle studier tyder på at Ang-2 kan være involvert i tumorangiogenese. Ahmad et al. (Cancer Res., 61: [01]) beskriver Ang-2- overuttrykking og viser at den angivelig er assosiert med en økning i tumorvekst i en muse-xenograftmodell. Se også Etoh et al, ovenfor, og Tanaka et al., ovenfor, der data er presentert som angivelig assosierer Ang-2-overuttrykking med tumorhypervaskularitet. Yu et al., (Am. J. Path., 18:63-70 [01]) rapporterer likevel i motsetning til dette at overuttrykking av Ang-2 i Lewis-lungekarsinom og TA3- brystkarsinomceller angivelig forlenget overlevelsen til mus injisert med de tilsvarende transfektantene. I de siste få årene har ulike publikasjoner foreslått Ang-1, Ang-2 og Tie-2 som mulige mål for anti-kreftterapi. US patent nr, 6,166,48,,60,490 og,814,464 tilkjennegir for eksempel hver konseptet med anti-tie-2-ligandantistoffer og reseptorlegemer. US patentsøknad nr. 03/ A1 beskriver visse anti-ang-2- antistoffer og deres anvendelse i behandling av kreft. Lin et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9: [1998]) injiserte et adenovirus som uttrykte løselig Tie-2 inn i mus, der det løselige Tie-2 angivelig minsket antallet og størrelsen på tumorene som ble utviklet i musene. I en beslektet studie injiserte Lin et al., (J. Clin. Invest., 0:72-78 [1997]) en løselig form av Tie-2 inn i rotter, der denne forbindelsen angivelig reduserte tumorstørrelse hos rotter. Siemeister et al., (Cancer Res., 9: [1999]) genererte humane melanomcellelinjer som uttrykte det ekstracellulære domenet til Tie-2, injiserte disse cellen inn i nakenmus, og konkluderte med at løselig Tie-2 angivelig førte til en «signifikant inhibering» av tumorvekst og tumorangiogenese. Dermed kan en effektiv anti-ang-2-terapi kanskje hjelpe en stor populasjon av kreftpasienter fordi de fleste faste tumorer krever neovaskularisering for å vokse ut over 1-2 millimeter i diameter. Slik terapi kan ha bredere anvendelse i andre angiogenese-assosierte sykdommer i tillegg, slik som retinopatier, artritt og psoriasis. Oppsummering av oppfinnelsen. 3 Selv om mye bevis peker mot nyttigheten av å inhibere Ang2-nivåer i behandling av uønsket angiogenese (eller enhver undergruppe av tilstander som involverer uønsket generering av blodkar, slik som angiogenese) så gjør ikke teknikkens stand per i dag det klart hvorvidt den samtidige inhiberingen av Ang1 vil være fordelaktig i slike terapier, og hvis så, hvilken grad av Ang1-inhibering, i tillegg til Ang2-inhibering,

4 som vil vise seg å tilveiebringe i det minste en additiv, terapeutisk effekt. Dermed adresserer foreliggende oppfinnelse et ikke anerkjent behov for å identifisere nye midler som spesifikt gjenkjenner og binder både Ang-1- og Ang-2-ligander. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har de ønskede aktivitetsnivåene for inhibering av Ang2 i tillegg til Ang1 som gjør dem spesielt nyttige i en mengde settinger slik som diagnostisk screening, bioanalyser og terapeutisk intervensjon i sykdommer som er assosiert med Ang-1- og/eller Ang-2-aktivitet, slik som kreft, inflammasjon og andre sykdommer som er relatert til uønsket angiogenese. De ulike utførelsesformene av oppfinnelsen vedrører antistoffer som spesifikt binder Ang-1 og/eller Ang-2 og som derved inhiberer fysiologisk eller patologisk angiogenese. Mekanismer ved hvilke dette blir oppnådd er binding til Ang-1- og/eller Ang-2-ligand for Tie2-reseptor. Antistoffet kan binde Ang-1 og/eller Ang-2 med en Kd på mindre enn omtrent 0 pm, pm, pm, pm, pm eller 1 pm. Visse utførelsesformer av oppfinnelsen er antistoffer av IgG-typen, for eksempel IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4. Beskrevet her blir bindingsmidler slik som et antistoff omfattende en tungkjede og en lettkjede, der nevnte tungkjede omfatter en tungkjedevariabelregion valgt fra gruppen bestående av H2 (SEQ ID NO. 1), H3 (SEQ ID NO. 2), H4 (SEQ ID NO. 3), H6 (SEQ ID NO. 4), H (SEQ ID NO. ), H11 (SEQ ID NO. 6). HP (SEQ ID NO. 7) og antigenbindende fragmenter derav, og nevnte lettkjede omfatter en lettkjedevariabelregion valgt fra gruppen bestående av: L1 (SEQ ID NO. 8), L2 (SEQ ID NO. 9), L4 (SEQ ID NO. ), L6 (SEQ ID NO. 11), L7 (SEQ ID NO. 12), L8 (SEQ ID NO. 13), L9 (SEQ ID NO. 14), L11 (SEQ ID NO. 1), L12 (SEQ ID NO. 16), L13 (SEQ ID NO. 17) og antigenbindende fragmenter derav. Også beskrevet er et spesifikt bindingsmiddel omfattende minst ett peptid valgt fra gruppen bestående av: H2 (SEQ ID NO. 1), H3 (SEQ ID NO. 2), H4 (SEQ ID NO. 3), H6 (SEQ ID NO. 4), H (SEQ ID NO. ), H11 (SEQ ID NO. 6), HP (SEQ ID NO. 7), L1(SEQ ID NO. 8), L2 (SEQ ID NO. 9), L4 (SEQ ID NO. ), L6 (SEQ ID NO. 11), L7 (SEQ ID NO. 12), L8 (SEQ ID NO. 13), L9 (SEQ ID NO. 14), L11 (SEQ ID NO. 1), L12 (SEQ ID NO. 16), L13 (SEQ ID NO. 17) og antigenbindende fragmenter derav. Det er på det rene at antistoffet for eksempel kan være et antistoff slik som et polyklonalt, monoklonalt, kimært, humanisert eller et fullt humant antistoff. Antistoffet kan også være et enkeltkjedeantistoff. Andre eksempler på spesifikke bindingsmidler inkluderer peptidlegemer slik som peptidlegeme ml4-3, avimerer, andre former for peptidmolekyler (slik som Fc-fusjonsmolekyler og Abfusjonsmolekyler (se CovX-Pfizer technology)) som inneholder peptidsekvenser som gjenkjenner og binder et proteinmål (i denne konteksten Ang2- eller Ang1- ligander) osv.

5 1 2 3 Beskrevet er peptidlegemer slik som ml4-3 som binder Ang1. Andre utførelsesformer inkluderer peptidandelen av ml4-3 i tillegg til liknende Ang1- bindingspeptider som kan bli fremstilt ved addisjon, delesjon og/eller innskudd av aminosyrer til og fra dette peptidet. Liknende addisjoner, delesjoner eller innskudd kan bli gjort på Fc-delen av Ml4-3-peptidlegemet. Ytterligere endringer av ml4-3 og peptidlegemer generelt er velkjent på fagområdet og blir for eksempel beskrevet i WO 00/24782 og WO 03/ Ytterligere beskrevet er et hybridom som produserer et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, i tillegg til cellelinjer inneholdende (på en hvilken som helst måte slik som ved transfeksjon, transformasjon, elektroporering) nukleinsyresekvensene som er nødvendige for å uttrykke de foreliggende, spesifikke bindingsmidlene slik som antistoffene som er beskrevet her. Det er også på det rene at konjugater blir beskrevet her. Konjugatet kan for eksempel være et spesifikt bindingsmiddel (slik som et antistoff) ifølge oppfinnelsen, konjugert til andre proteininneholdende molekyler, karbohydrat-, lipid- eller blandingsenhetsmolekyler. Ytterligere beskrevet er nukleinsyremolekyler som koder for spesifikke bindingsmidler (slik som et antistoff) ifølge oppfinnelsen, i tillegg til en vektor omfattende et slikt nukleinsyremolekyl, i tillegg til en vertscelle inneholdende vektoren. I tillegg blir det beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av et spesifikt bindingsmiddel omfattende, (a) transformering av en vertscelle med minst ett nukleinsyremolekyl som koder for det spesifikke bindingsmiddelet, (b) uttrykking av nukleinsyremolekylet i nevnte vertscelle, og (c) isolering av nevnte spesifikke bindingsmiddel. Oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff, omfattende: (a) transformering av en vertscelle med minst ett nukleinsyremolekyl som koder for antistoffet ifølge oppfinnelsen, (b) uttrykking av nukleinsyremolekylet i nevnte vertscelle, og (c) isolering av nevnte spesifikke bindingsmiddel. Ytterligere beskrevet er en fremgangsmåte for inhibering av uønsket angiogenese i et pattedyr ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet blir en fremgangsmåte for behandling av kreft i et pattedyr ved administrering av en terapeutiske effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen. Beskrevet blir også en fremgangsmåte for inhibering av uønsket angiogenese i et pattedyr ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet blir en fremgangsmåte for behandling av kreft i et pattedyr omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge oppfinnelsen.

6 6 Det er på det rene at oppfinnelsen ytterligere vedrører farmasøytiske sammensetninger omfattende antistoffet ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt formuleringsmiddel. 1 2 Beskrevet her blir en fremgangsmåte for modulering eller inhibering av angiopoietin-2-aktivitet ved administrering av ett eller flere bindingsmidler ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet blir en fremgangsmåte for modulering eller inhibering av angiopoietin-2-aktivitet ved administrering av et antistoff ifølge oppfinnelsen. Ytterligere beskrevet blir en fremgangsmåte for modulering av minst én av vaskulær permeabilitet eller plasmalekkasje i et pattedyr, omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av det spesifikke bindingsmidlet ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet er en fremgangsmåte for behandling av minst én av okular neovaskulær sykdom, fedme, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerose, inflammatorisk sykdom, inflammatoriske forstyrrelser, aterosklerose, endometriose, neoplastisk sykdom, beinrelatert sykdom eller psoriasis hos et pattedyr omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet er en fremgangsmåte for modulering av minst én av vaskulær permeabilitet eller plasmalekkasje hos et pattedyr omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av e antistoff ifølge oppfinnelsen. Også beskrevet er en fremgangsmåte for behandling av minst én av okular neovaskulær sykdom, fedme, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerose, inflammatorisk sykdom, inflammatoriske forstyrrelser, aterosklerose, endometriose, neoplastisk sykdom, beinrelatert sykdom, eller psoriasis hos et pattedyr omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff ifølge oppfinnelsen. Videre beskrevet er en fremgangsmåte for behandling av kreft i et pattedyr omfattende administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et spesifikt bindingsmiddel ifølge oppfinnelsen og et kjemoterapeutisk middel. Fagfolk på området vil innse at det spesifikke bindingsmidlet og det kjemoterapeutiske midlet ikke behøver å bli administrert samtidig. I detalj vedrører foreliggende oppfinnelse de følgende punktene: 3 1. Isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav som omfatter et tungkjedevariabeldomene og et lettkjedevariabeldomene som har sekvenser som er valgt fra gruppen som består av: (a) SEQ ID NO. 4 og SEQ ID NO. 12, (b) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 12, (c) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 17,

7 7 1 2 (d) SEQ ID NO. 6 og SEQ ID NO. 12, (e) SEQ ID NO. og SEQ ID NO. 12, (f) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 12, (g) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 11, (h) SEQ ID NO. 1 og SEQ ID NO. 12, (i) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 13, (j) SEQ ID NO. 4 og SEQ ID NO. 13, (k) SEQ ID NO. 2 og SEQ ID NO. 12, (l) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO., (m) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 16, (n) SEQ ID NO. 4 og SEQ ID NO. 11, (o) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 9, (p) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 11, (q) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO., (r) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 1, (s) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 8, (t) SEQ ID NO. 3 og SEQ ID NO. 1, (u) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 16, og (v) SEQ ID NO. 7 og SEQ ID NO. 14, der nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav spesifikt binder minst én av Ang1- og Ang2-ligander av Tie2-reseptor. 2. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for antistoffet eller det antigenbindende fragmentet derav ifølge punkt Vektor inneholdende et nukleinsyremolekyl ifølge punkt Vertscelle inneholdende vektoren ifølge punkt 3.. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 1, omfattende uttrykking av nevnte antistoff i en vertscelle. 6. Vertscelle ifølge punkt 4 eller fremgangsmåten ifølge punkt, der nevnte vertscelle er en CHO-celle. 7. Farmasøytisk sammensetning omfattende et antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 1, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer til dette.

8 8 8. Farmasøytisk sammensetning ifølge punkt 7, ytterligere omfattende et molekyl valgt fra gruppen som består av et reportermolekyl, en vannløselig polymer, en antistoff-fc-region og et cytotoksisk middel Farmasøytisk sammensetning ifølge punkt 8, der nevnte farmasøytisk akseptable bærer er et farmasøytisk formuleringsmiddel.. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 1, ytterligere omfattende en human IgG-konstantregion. 11. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt, der isotypen til IgG-konstantregionen er IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 11, ytterligere omfattende et lettkjedekonstantdomene. 13. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 12, der lettkjedekonstantdomenet er et kappa-konstantdomene Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 1, ytterligere omfattende en human immunoglobulinkonstantregion. 1. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 14, der konstantregiontungkjede-aminosyresekvensene er valgt fra IgG1-, IgG2-, IgG3- og IgG4-sekvenser, og konstantregionlettkjede-aminosyresekvensene er valgt fra SEQ ID NO. 44 og Antigenbindende fragment ifølge punkt 1, der fragmentet er et Fab-, F(ab )2-, Fv-fragment, et enkeltkjedeantistoff eller et scfv-fragment. 17. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge ethvert av punktene 1 og -16, ytterligere omfattende et påvisbart merke. 18. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge ethvert av punktene 1 og -16 for inhibering av uønsket angiogenese hos et individ med behov derav. 19. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge punkt 18, der nevnte uønskede angiogenese er kreft. 40

9 9 Kort beskrivelse av figurene Figur 1 viser en graf over tumorstørrelse (y-akse) versus tid (x-akse) i tumorbærende mus behandlet med enten et anti-ang1/2-antistoff (H4L4, H4L11 eller H6L7) ifølge oppfinnelsen eller et svært potent kontroll-peptidlegeme (AMG 386) eller antistoff 36, sammenlignet med behandling med et isotypekontrollantistoff. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur 2 viser tumorbelastningen (% levedyktig tumor [halvert seksjon] x tumorvekt) i tumorbærende mus behandlet med et anti-ang1/2-antistoff (H4L4, H4L11 eller H6L7) ifølge oppfinnelsen eller et svært potent kontroll-peptidlegeme (AMG 386) eller antistoff 36 sammenlignet med behandling med et isotype-kontrollantistoff. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur 3 viser effekten av H4L4, H4L11 og H6L7 ifølge oppfinnelsen, et svært potent kontroll-peptidlegeme (AMG 386) og antistoff 36 på endotelcelleproliferasjon i Colo-tumorbærende mus. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur 4 viser H4L4-antistoff-doseresponssammenheng i Colo-tumorbærende mus. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur viser effekten av H4L4-antistoff på Colo-tumorbyrde in vivo. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur 6 viser effekten av antistoffet H4L4 på endotelcelle-proliferasjon i Colo- tumorbærende mus. Detaljer er beskrevet i eksemplene. Figur 7 viser at systematisk administrert ml4-3 nøytraliserer Ang1-indusert Tie2- fosforylering i muselunge. Mus (n=3 per gruppe) ble behandlet med L1-7(N) (2 mg/kg), ml4-3 ( mg/kg) eller Fc-kontroll ( mg/kg) daglig i 23 dager før i.v.- utfordring med Ang1 eller BSA. Muselunger ble deretter høstet, og nivåene av fosforylert Tie2 ble bestemt ved immunpresipitering-western blott-analyse. Data er gjennomsnittsverdier ± SE. *P=0,000 versus Ang1 pluss Fc, ANOVA med Fishers post hoc test. Figur 8 viser hvordan farmakologisk inhibering av Ang1 under tidlig organogenese endrer hjerteutvikling. A) Muse-embryoer eksponert overfor 0 mg/kg ml4-3 (høyre panel) hadde mindre hjerter med færre, smalere og mer spredte trabeculae relativt i forhold til større hjerter med store, vide trabeculae funnet i stadiummatchede embryoer eksponert overfor 0 mg/kg Fc-kontroll (venstre panel). Representative bilder er vist. B) Forekomst av hjerte-unormalheter i Fc- og ml4-3- behandlede embryoer. *P<0,0001 versus Fc, chi-kvadrat-test. Figur 9 viser effekten av kombinert Ang1- og Ang2-inhibering på veksten av Colo-tumorxenografter. Mus (n= per gruppe) ble implantert med Colo- celler, og behandling begynte når tumorer nådde omtrent 00 mm 3 med Fc-kontroll (,2 mg/kg QD), ml4-3 (3,2 mg/kg QD), L1-7(N) (2,0 mg/kg QD), L1-7(N)

10 kombinert med ml4-3 (ved de samme doseringsregimene som benyttet i enkeltmiddel-gruppene), eller AMG 386 (,6 mg/kg to ganger i uken). Ett av fire representative eksperimenter er vist. Data er gjennomsnittsverdier±se. *P<0,0001 versus L1-7(N), RMANOVA med Scheffé post hoc test Figur viser effekten av Ang1- og Ang2-antagonisme på tumorendotelcelleproliferasjon, kornea-angiogenese og retina-angiogenese. A) Effekten av inhibering av Ang1 og Ang2 på BrdU-opptak i muse-endotelceller avledet fra Colo-tumorxenografter. Tumorbærende mus ble behandlet i 3 dager med Fc (,7 mg/kg QD), AMG 386 (6 mg/kg enkeltdose), L1-7(N) (2,2 mg/kg QD), ml4-3 (3, mg/kg QD) eller L1-7(N) kombinert med ml4-3 (ved de samme dosene og skjemaene som benyttet i enkeltmiddel-gruppene). Hver stolpe representerer gjennomsnittlige endotelcelle:musecelle BrdU-forhold (n=3). Data er gjennomsnittsverdier ± SE. *P<0,0 versus Fc, uparet Student s t-test. B og C) Effekten av inhibering av Ang1 og Ang2 på (B) VEGF-indusert og (C) bfgf-indusert kornea-angiogenese. Angiogenese ble indusert ved implantering av VEGF- eller bfgf-dynkede nylonskiver inn i stroma i kornea hos rotter (n=8 per gruppe). Behandling ble satt i gang én dag før implantering i kornea og fortsatte hver tredje dag med: Fc(60 mg/kg), L1-7(N) ( mg/kg), ml4-3 (60 mg/kg) og L1-7(N) kombinert med ml4-3 (ved samme dose og skjema som i enkeltmiddel-gruppene). Data er gjennomsnittsverdier ± SE. *p < 0,0001 versus Fc + VEGF (B), # P < 0,002 versus Fc + bfgf (C), ANOVA med Fishers post hoc test. D) Inhibering av Ang2 forhindrer oksygenindusert neovaskularisering i muse-retina. Med start på dag p8 etter fødsel (n= per gruppe) ble unger behandlet daglig s.c. i ni dager med Fc (0 mg/kg) L1-7(N) (0 mg/kg) ml4-3 (0 mg/kg) eller L1-7(N) kombinert med L4-3 (ved samme dose og skjema som benyttet i enkeltmiddel-gruppene). Data er gjennomsnittsverdier ± SE. P < 0,0001 versus Fc, ANOVA med Fishers post hoc test. Figur 11 viser Ang1- og Ang2-inhibitorer som sammen undertrykker ovariefolikkelangiogenese. HCG ble benyttet for å indusere superovulering i mus. Fc (0 mg/kg), ml4-3 ( mg/kg), L1-7(N) ( mg/kg) eller en kombinasjon av ml4-3/l1-7(n) ( mg/kg hver) administrert s.c. (n=7 mus per gruppe) ble evaluert for evnen til å forhindre neovaskularisering i ovulerende follikler. Blodkarareal ble beregnet fra anti-cd3-immunfargede seksjoner i individuelle follikler. Data er gjennnomsnittsverdier ± SE. To uavhengige eksperimenter er vist. *P = 0,00 som sammenligner ml4-3/l1-7(n)-kombinasjon versus enten enkeltmiddel alene, # P < 0,0 versus Fc, ANOVA med Dunnets post hoc test. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen 40 Avsnittsoverskriftene blir her kun benyttet for organiseringsformål og skal ikke anses på noen måte som å begrense gjenstanden som beskrives.

11 Standardteknikker kan bli benyttet til rekombinant DNA-molekyl-, protein- og antistoffproduksjon, i tillegg til vevskultur- og celletransformasjon. Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker blir typisk utført i overensstemmelse med produsentens spesifikasjoner slik dette vanligvis utføres på fagområdet ved å benytte konvensjonelle prosedyrer, slik som de som fremkommer i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989], eller som beskrevet her. Dersom ikke spesifikke definisjoner er tilveiebrakt så er nomenklaturen som benyttes i sammenheng med, og laboratorieprosedyrene og teknikkene for analytisk kjemi, syntetisk og organisk kjemi, og medisinsk og farmasøytisk kjemi som er beskrevet her de som er velkjente på fagområdet. Standardteknikker kan bli benyttet til kjemisk syntese, kjemiske analyser, farmasøytisk klargjøring, formulering og levering, og behandling av pasienter. Uttrykkene som er benyttet for å beskrive foreliggende oppfinnelse skal her, dersom ikke annet er spesifikt definert, sin mening slik den forstår på fagområdet. Det bør bemerkes at uttrykkene H og HP blir benyttet om hverandre og refererer til tungkjeden som benyttes i ulike utførelsesformer av oppfinnelsen, for eksempel mab er benevnt som HL7, HL6, HL8, HL11, HL1, HL12 og HL9. Uttrykket «Ang-2» refererer til polypeptidet på figur 6 i US patent nr. 6,166,18 («Tie-2-ligand-2») eller fragmenter derav i tillegg til relaterte polypeptider som inkluderer allelvarianter, spleisevarianter, derivater, substitusjons-, delesjonsog/eller innskuddsvarianter, fusjonspeptider og polypeptider og inter-artshomologer. Ang-2-polypeptidet kan inkludere, men behøver ikke å inkludere, ytterligere terminale rester, for eksempel ledersekvenser, målsøkingssekvenser, aminoterminalt metionin- og lysinrester, og/eller merke- eller fusjonsproteinsekvenser, avhengig av måten det fremstilles på. Uttrykket «spesifikt bindingsmiddel» refererer til et molekyl, fortrinnsvis et proteininneholdende molekyl, som binder Ang-2 i tillegg til Ang-1 (og varianter og derivater derav som definert her) med høyere affinitet enn andre angiopoietiner. Et spesifikt bindingsmiddel kan være et protein, peptid, nukleinsyre, karbohydrat, lipid, eller forbindelse med liten molekylvekt som fortrinnsvis binder Ang-2 og Ang-1. I en foretrukket utførelsesform er antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse et polyklonalt antistoff (mab), et kimært antistoff, et CDR-transplantert antistoff, et multispesifikt antistoff, et bispesifikt antistoff, et katalytisk antistoff, et humanisert antistoff, et humant antistoff, et anti-idiotypisk (anti-id) antistoff og antistoffer som kan bli merket i løselig eller bundet form, i tillegg til antigenbindende fragmenter, varianter eller derivater derav, enten alene eller i kombinasjon med andre aminosyresekvenser, som er tilveiebrakt med kjente teknikker. Slike teknikker inkluderer, men er ikke begrenset til, enzymatisk kløyving, kjemisk kløyving, peptidsyntese eller rekombinante teknikker. Anti-Ang-2- o anti-ang-1-antistoffene

12 12 ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å binde deler av Ang-2 og Ang-1 som modulerer for eksempel inhiberer eller fremmer den biologiske aktiviteten til Ang-2 og Ang-1 og/eller andre Ang-2- og Ang-1-assosierte aktiviteter Uttrykket «polyklonalt antistoff» refererer til en heterogen blanding av antistoffer som gjenkjenner og binder ulike epitoper på det samme antigenet. Polyklonale antistoffer kan bli fremskaffet fra ubehandlede serumpreparater eller kan bli renset ved for eksempel å benytte antigenaffinitetskromatografi, eller Protein-A/Protein-Gaffinitetskromatografi. Uttrykket «monoklonale antistoffer» refererer til en samling av antistoffer som er kodet for av det samme nukleinsyremolekylet som eventuelt er produsert av et enkelt hybridom (eller klon derav) eller annen cellelinje, eller av et transgent pattedyr slik at hvert monoklonale antistoff typisk vil gjenkjenne den samme epitopen på antigenet. Uttrykket «monoklonal» er ikke begrenset til noen spesifikk fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet, og heller ikke er uttrykket begrenset til antistoffer produsert i en spesifikk art, for eksempel mus, rotte osv. Uttrykket «kimære antistoffer» refererer til antistoffer der en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog med en tilsvarende sekvens i et antistoff som er avledet fra en spesifikk art eller som tilhører en spesifikk antistoffklasse eller -underklasse, mens det gjenværende av kjeden/kjedene er identisk med eller homolog med en tilsvarende sekvens i antistoffer som er avledet fra en annen art eller som tilhører en annen antistoffklasse eller underklasse. Også inkludert er antigenbindende fragmenter av slike antistoffer som oppviser den ønskede biologiske aktiviteten (dvs., evnen til spesifikt å binde Ang-2), Se US patent nr. 4,816,67 og Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81: [198]. Uttrykket «CDR-transplantert antistoff» refererer til et antistoff der CDR en fra ett antistoff av en spesifikk type eller isotype blir rekombinant satt inn i rammeverket til et annet antistoff av den samme typen eller isotypen. Uttrykket «multispesifikt antistoff» refererer til et antistoff som har variabelregioner som gjenkjenner mer enn én epitop på ett eller flere antigener. En underklasse av denne typen antistoff er et «bispesifikt antistoff» som gjenkjenner to distinkte epitoper på det samme eller ulike antigener. «Katalytiske» antistoffer refererer til antistoffer der én eller flere cytotoksiske, eller mer generelt én eller flere biologisk aktive enheter er festet til det målsøkende bindingsmiddelet. Uttrykket «humanisert antistoff» refererer til en spesifikk type a CDR-transplantert antistoff der antistofframmeverkregionen er avledet fra et menneske men der hver CDR er erstattet med den som er avledet fra andre arter, slik som en murin CDR. Uttrykket «CDR» er definert nedenfor.

13 13 Uttrykket «fullt humant» antistoff refererer til et antistoff der både CDR og rammeverket er avledet fra ett eller flere humane DNA-molekyler Uttrykket «anti-idiotypisk» antistoff refererer til ethvert antistoff som spesifikt binder til et annet antistoff som gjenkjenner et antigen. Produksjon av antiidiotypiske antistoffer kan bli utført ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er beskrevet her for fremstilling av Ang-2-spesifikke antistoffer bortsett fra at disse antistoffene fremkommer fra for eksempel av immunisering av et dyr med et Ang-2- spesifikt antistoff eller Ang-2-bindende fragment derav, heller enn Ang-2- polypeptidet selv eller et fragment derav. Uttrykket «varianter» inkluderer slik det benyttes her de polypptypene der aminosyrerester er satt inn i, fjernet fra og/eller substituert inn i den naturlig forekommende (eller i det minste kjente) aminosyresekvensen for bindingsmiddelet. Varianter av oppfinnelsen inkluderer fusjonsproteiner som beskrevet nedenfor. «Derivater» inkluderer de bindingsmidlene som har blitt kjemisk modifisert på en eller annen måte som er forskjellig fra innskudds-, delesjons- eller substitusjonsvarianter. «Spesifikt binder» refererer til et spesifikt bindingsmiddel sin evne (slik som et antistoff eller fragment derav ifølge foreliggende oppfinnelse) til å gjenkjenne og binde modent, fullengde- eller partiellengde-målpolypeptid (her, Ang-2 og Ang-1) eller en ortolog derav, slik at dets affinitet (som for eksempel bestemt ved affinitets- ELISA eller BIAcore-analyser som beskrevet her) eller dets nøytraliserende evne (som for eksempel bestemt ved nøytraliserings-elisa-analyser som beskrevet her, eller liknende analyser) er minst ganger så høy, men eventuelt 0 ganger så høy, 0, eller 00 ganger så høy, eller til og med minst 00 ganger så høy som affiniteten eller nøytraliseringsevnen for det samme eller ethvert annet angiopoietin eller annet peptid eller polypeptid. Uttrykket «antigenbindende domene» eller «antigenbindende region» refererer til den delen av det spesifikke bindingsmiddelet (slik som et antistoffmolekyl) som inneholder de spesifikke bindingsmiddelaminosyrerestene (eller andre enheter) som interagerer med et antigen og som på bindingsmiddelet overfører dets spesifisitet og affinitet for antigenet. I et antistoff blir det antigenbindende domenet vanligvis referert til som den «komplementaritetsbestemmende regionen eller CDR». Uttrykket «epitop» refererer til den delen av ethvert molekyl som er i stand til å bli gjenkjent av og bundet av et spesifikt bindingsmiddel, for eksempel et antistoff, på én eller flere av bindingsmiddelets antigenbindende regioner. Epitoper består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler, slik som for eksempel aminosyrer eller karbohydratsidekjeder, og har spesifikke, tredimensjonale, strukturelle egenskaper i tillegg til spesifikke ladningskarakteristika. Epitoper som benyttet her kan være kontinuerlige eller ikke-

14 kontinuerlige. Videre kan epitoper være hermende ved at de omfatter en tredimensjonal struktur som er identisk med epitopen som ble benyttet for å generere antistoffet, men fremdeles omfatte ingen av eller kun noen av aminosyrerestene som er funnet på Ang-2 som er benyttet for å stimulere antistoffimmunresponsen. Uttrykket «inhiberende og/eller nøytraliserende epitop» er en epitop som når den er bundet av et spesifikt bindingsmiddel slik som et antistoff fører til tapet av (eller i det minste minskningen av) biologisk aktivitet for molekylet, cellen eller organismen som inneholder en slik epitop, in vivo, in vitro eller in situ. I konteksten av foreliggende oppfinnelse er den nøytraliserende epitopen lokalisert på eller er assosiert med an biologisk aktiv region av Ang-2. Alternativt er uttrykket «aktiverende epitop» en epitop som når den er bundet til et spesifikt bindingsmiddel, slik som et antistoff, fører til aktivering, eller i det minste opprettholdelse av en biologisk aktiv konformasjon, av Ang-2. Uttrykket «antistoffragment» refererer til et peptid eller polypeptid som omfatter mindre enn et komplett, intakt antistoff. Komplette antistoffer omfatter to funksjonelle, uavhengige deler eller fragmenter: et antigenbindende fragment kjent som «Fab» og et karboksyterminalt, krystalliserbart fragment kjent som «Fcfragmentet». Fab-fragmentet inkluderer det første konstantdomenet fra både den tunge og lette kjeden (CH1 og CL1) sammen med variabelregionene fra både tungog lettkjedene som binder det spesifikke antigenet. Hver av tungkjede- og lettkjedevariabelregionene inkluderer tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR er) og rammeverksaminosyrerester som separerer de individuelle CDR ene. Fc-regionene omfatter den andre og tredje tungkjedekonstantregionen (CH2 og CH3) og er involvert i effektorfunksjoner slik som komplementaktivering og angrep av fagocytose-celler. I noen antistoffer er Fc- og Fab-regionen separert av en «antistoff-hengsleregion», og avhengig av hvordan fullengde-antistoffet blir proteolytisk kløyvd så kan hengsleregionen være assosiert med enten Fab- eller Fcfragmentet. Kløyvingen av et antistoff med proteasen papain fører for eksempel til at hengsleregionen blir assosiert med det resulterende Fc-fragmentet, mens kløyving med proteasen pepsin tilveiebringer et fragment der hengsleregionen er assosiert med begge Fab-fragmentene samtidig. Fordi de to Fab-fragmentene faktisk er kovalent bundet sammen etter pepsin-kløyving blir det resulterende fragmentet betegnet F(ab )2-fragmentet. Et Fc-domene har en relativ lang halveringstid i serum, mens en Fab er kortlivet. [Capon et al., Nature, 337:2-31 (1989)]. Når det uttrykkes som en del av et fusjonsprotein gir et Fc-domene lengre halveringstid eller inkorporerer slike funksjoner som Fc-reseptorbinding. Protein-A-binding, komplementfiksering og kanskje til og med placentaoverføring inn i proteinet det er fusjonert med. Fcregionen kan være en naturlig forekommende Fc-region, eller kan bli endret for å forbedre visse kvaliteter, slik som terapeutiske kvaliteter eller sirkulasjonstid.

15 Uttrykket «variabelregion» eller «variabeldomene» refererer til en del av lettkjeden og/eller tungkjeden på et antistoff, og inkluderer typisk omtrent de aminoterminale 1-1 aminosyrene på tungkjeden og omtrent 0 til 1 aminoterminale aminosyrer på lettkjeden. Variabelregionene har typisk svært forskjellige aminosyresekvenser, til og med innenfor antistoffer av samme type. Variabelregionen på et antistoff bestemmer typisk bindingen og spesifisiteten til hvert spesifikke antistoff for dets spesifikke antigen. Variabiliteten i sekvens er konsentrert i de regionene som er referert til som komplementaritetsbestemmende regioner (CDR), mens de mer konserverte regionene i variabeldomenet blir kalt rammeverksregioner (FR). CDR ene i lettkjedene og tungkjedene inneholder aminosyrene som i hovedsak er ansvarlige for den direkte interaksjonen for antistoffet med antigen, men likevel kan aminosyrer i FR ene vesentlig påvirke antigenbinding/-gjenkjenning som diskutert nedenfor. Uttrykket «lettkjede» refererer når det benyttes med referanse til et antistoff kollektivt til to distinkte typer kalt kappa (k) eller lambda (l) basert på aminosyresekvensen til konstantdomenene. Uttrykket «tungkjede» refererer når det benyttes på et antistoff kollektivt til fem distinkte typer kalt alfa, delta, epsilon, gamma og mu, basert på aminosyresekvensen til tungkjedekonstantdomenet. Kombinasjonen av tunge og lette kjeder gir opphav til fem kjente klasser med antistoffer: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, inkludert fire kjente underklasser av IgG betegnet IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4. Uttrykket «naturlig forekommende» refererer når det benyttes i sammenheng med biologiske materialer slik som nukleinsyremolekyler, polypeptider og vertsceller og liknende de som blir funnet i naturen og som ikke er modifisert av mennesker. Uttrykket «isolert» refererer når det benyttes i relasjon til Ang-2 eller med et spesifikt bindingsmiddel av Ang-2 til en forbindelse som er fri for i det minste ett kontaminerende polypeptid eller forbindelse som blir funnet i dets naturlige miljø, og fortrinnsvis vesentlig fri for ethvert annet kontaminerende pattedyrpolypeptid som vil kunne interferere med dets terapeutiske eller diagnostiske anvendelse. Uttrykket «moden» refererer når det benyttes i sammenheng med Ang-2, anti-ang- 2-antistoff eller med annet proteininneholdende spesifikt bindingsmiddel av Ang-2 til et peptid eller et polypeptid som mangler en leder- eller signalsekvens. Når et antistoff ifølge oppfinnelsen blir uttrykt, for eksempel i en prokaryot vertscelle, så kan det «modne» peptidet eller polypeptidet også inkludere ytterligere aminosyrerester (men fremdeles mangle en ledersekvens) slik som et aminoterminalt metionin, eller én eller flere metionin- og lysinrester. Et peptid eller polypeptid som er fremstilt på denne måten kan bli benyttet med eller uten disse ytterligere aminosyrerestene som har blitt fjernet.

16 16 Spesifikke bindingsmidler og antistoffer Som benyttet her refererer uttrykket «spesifikt bindingsmiddel» til et molekyl som har spesifisitet for gjenkjenning og binding av Ang-2 og Ang-1 som beskrevet her. Passende spesifikke bindingsmidler inkluderer, men er ikke begrenset til, antistoffer og derivater derav, polypeptider og små molekyler. Passende spesifikke bindingsmidler kan bli fremstilt ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Et eksempelmessig Ang-2- og Ang-1-polypeptidspesifikt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å binde en viss del av Ang-2- og Ang- 1-polypeptidene, og modulerer fortrinnsvis aktiviteten eller funksjonen til Ang-2- og Ang-1-polypeptidene. Antistoffer eller antistoffragmenter som spesifikt binder Ang-2- og Ang-1- polypeptider er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Antistoffene kan være polyklonale, inkludert monospesifikke polyklonale, monoklonale (mab), rekombinante, kimære, humaniserte slik som CDR-transplanterte, humane, enkeltkjedede, katalytiske, multispesifikke og/eller bispesifikke, i tillegg til antigenbindende fragmenter, varianter og/eller derivater derav. Polyklonale antistoffer mot Ang2- og Ang1-polypeptider blir generelt produsert i pattedyr (for eksempel kaniner, hamstre, geiter, sauer, hester, svin, rotter, ørkenrotter, marsvin, mus eller ethvert annet passende pattedyr, i tillegg til andre arter som ikke er pattedyr) ved hjelp av mange subkutane eller intraperitoneale injeksjoner av Ang-2- og/eller Ang-1-polypeptid eller et fragment derav med eller uten adjuvans. Slike adjuvanser inkluderer, men er ikke begrenset til, Freunds komplette eller ukomplette, mineralgeler slik som aluminiumhydroksid, og overflateaktive stoffer slik som lysolechitin, pluroniske polyoler, polyanioner, peptider, olje-emulsjoner, keyhole-limpet-hemocyanin og dinitrofenol. BCG (bacilli Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum er potensielt nyttige humane adjuvanser. Det kan være nyttig å konjugere et antigenpolypeptid med et bærerprotein som er immunogent i arten som skal immuniseres, slik som keyholelimpet-hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønnetrypsininhibitor. Aggregerende midler slik som alum blir også benyttet for å forsterke immunresponsen. Etter immunisering blir dyrene tappet og serumet blir analysert for anti-ang-2-polypeptidantistofftiter som kan bli bestemt ved å benytte analysen som er beskrevet her under «Eksempler». Polyklonale antistoffer kan bli benyttet i serumene de ble påvist i, eller kan bli renset fra serumene, ved for eksempel å benytte antigenaffinitetskromatografi eller Protein-A- eller Gaffinitetskromatografi. Monoklonale antistoffer som er rettet på Ang-2-polypeptider kan for eksempel bli produsert ved å benytte, uten begrensning, den tradisjonelle «hybridomfremgangsmåten» eller den nyere «phage-dsplay» teknikken. Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan for eksempel bli fremstilt ved

17 hybridomfremgangsmåten som beskrevet i Kohler et al., Nature 26:49 [197], den humane B-celle-hybridomteknikken [Kosbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983), Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:26- (1983), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s.1-63, Marcel Dekker Inc., New York (1987) og EBV-hybridomteknikken [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York. s.77-96, (198)]. Også tilveiebrakt ved oppfinnelsen er hybridomcellelinjer som produserer monoklonale antistoffer som er reaktive med Ang-2-polypeptider. Når hybridomteknikken benyttes kan myelomcellelinjer bli benyttet. Slike cellelinjer som er passende for anvendelse i hybridomproduserende fusjonsprosedyrer er fortrinnsvis ikke antistoffproduserende, har høy fusjonseffektivitet, og enzym-mangler som gjør dem ute av stand til å vokse i visse selektive medier som kun understøtter veksten til de ønskede, fusjonerte cellene (hybridomer). Cellelinjer som benyttes i musefusjoner er for eksempel Sp-, P3- X63/Ag8, P3-X63-Ag8.63, NS1/1.Ag41, Sp2-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X4-GTG1.7 og S194/XX0 Bul, cellelinjer benyttet i rottefusjoner er R2.RCY3, Y3-Ag1.2.3, IR983F og 4B2. Andre cellelinjer som er nyttige til cellefusjoner er U-266, GM0-GRG2, LICR-LON-HMy2 og UC Hybridomer og andre cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer er kontemplert å være nye sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse. Phage-display-teknikken kan også bli benyttet til å generere monoklonale antistoffer fra enhver art. Fortrinnsvis blir denne teknikken benyttet til å produsere fult humane monoklonale antistoffer der et polynukleotid som koder for et enkelt Fab- eller Fvantistoffragment blir uttrykt på overflaten av en bakteriofagpartikkel. [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol. 222:81 (1991), se også US patent nr.,88,793)]. Hver bakteriofag kan bli «screenet» ved å benytte bindingsanalyser som er beskrevet her for å identifisere de antistoffragmentene som har affinitet for Ang-2. Slik hermer disse prosessene immunseleksjon via oppvisningen av antistoffragment-repertoarer på overflaten av filamentøs bakteriofag, og påfølgende seleksjon av bakteriofager ved deres binding til Ang-2. En slik prosedyre er beskrevet i WO 99/494 A2, innsendt i navnet Adams et al., som beskriver isoleringen av høyaffinitets- og funksjonelle, agonistiske antistoffragmenter for MPL- og msk-reseptorer ved å benytte en slik tilnærming. I denne tilnærmingen kan et fullstendig repertoar av humane antistoffgener bli dannet ved å klone naturlig rearrangerte humane V-gener fra perifere blodlymfocytter som tidligere beskrevet [Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: (1990)]. Med en gang en polynukleotidsekvens er identifisert som koder for hver kjede i det monoklonale fullengde-antistoffet eller Fab- eller Fv-fragmentene ifølge oppfinnelsen, så kan vertsceller, enten eukaryote eller prokaryote, bli benyttet for å uttrykke de monoklonale antistoffpolynukleotidene ved å benytte rekombinante

18 teknikker som er velkjente og som blir rutinemessig praktisert på fagområdet. Alternativt blir transgene dyr produsert der et polynukleotid som koder for det ønskede, spesifikke bindingsmiddelet blir introdusert inn i genomet til et mottakerdyr, slik som for eksempel en mus, kanin, geit eller storfe, på en måte som tillater uttrykking av polynukleotidmolekylene som koder for et monoklonalt antistoff eller annet spesifikt bindingsmiddel. I ett aspekt kan polynukleotidene som koder for det monoklonale antistoffet eller annet spesifikt bindingsmiddel bli ligert til brystspesifikke, regulatoriske sekvenser, og de kimære polynukleotidene kan bli introdusert inn i kjønnscellelinjen til mål-dyret. Det resulterende transgene dyret produserer da det ønskede antistoffet i sin melk [Pollock et al., J. Immunol. Meth. 231: (1999), Little et al., Immunol Today 8: (00)]. I tillegg kan planter bli benyttet for å uttrykke og produsere Ang-2-spesifikke bindingsmidler slik som monoklonale antistoffer ved å transfektere passende planter med polynukleotidene som koder for de monoklonale antistoffene eller andre spesifikke bindingsmidler. I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan et monoklonalt eller polyklonalt antistoff eller fragment derav som er avledet fra en art forskjellig fra menneske bli «humanisert» eller «kimerisert». Fremgangsmåter for humanisering av ikke-humane antistoffer er velkjente på fagområdet. (se US patent nr.,89,,,8,089 og,693,762). Humanisering blir for eksempel utført ved å benytte fremgangsmåter som er beskrevet på fagområdet [Jones et al., Nature 321:22-2 (1986), Reichmann et al., Nature, 332: (1988), Verhoeyen et al., Science 239: (1988)] ved å substituere i det minste en del av, for eksempel gnager, komplementaritetsbestemmende region (CDR) med de tilsvarende regionene på et humant antistoff. Oppfinnelsen beskriver også varianter og derivater av disse humane antistoffene som diskutert her og slik det er velkjent på fagområdet. Også omfattet av oppfinnelsen er fult humane antistoffer som binder Ang-2- polypeptider, i tillegg til antigenbindende fragmenter derav. Slike antistoffer kan bli produsert ved å benytte phage-display-teknikken som er beskrevet ovenfor. Alternativt kan transgene dyr (for eksempel mus) som er i stand til å produsere et repertoar av humane antistoffer i fraværet av endogen immunoglobulinproduksjon bli benyttet for å generere slike antistoffer. Dette kan bli utført ved immunisering av dyret med et Ang-2-antigen eller fragment derav der Ang-2-fragmentene har en aminosyresekvens som er unik for Ang-2. Slike immunogener kan eventuelt bli konjugert til en bærer. Se for eksempel Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 90:21-2 (1993). Jakobovits et al., Nature 362:2-28 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993). I én fremgangsmåte blir slike transgene dyr produsert ved å udyktiggjøre de endogene loci som koder for de tunge og lette immunoglobulinkjedene deri, og sette inn loci som koder for humane tungkjede- og lettkjedeproteiner inn i genomet derav. Delvis modifiserte dyr, det vil

19 si de som har mindre enn det fulle komplementet av disse modifiseringene, blir deretter krysset for å oppnå et dyr som har alle de ønskede immunsystemmodifiseringene. Når de får administrert et immunogen er disse transgene dyrene i stand til å produsere antistoffer med humane variabelregioner, inkludert humane (heller enn for eksempel murine) aminosyresekvenser, som er immunspesifikke for de ønskede antigenene. Se WO 96/3373 A1 og WO 94/02602 A1. Ytterligere fremgangsmåter er beskrevet i US patent nr.,4,807, WO 91/741 A1, WO 90/04036 A1 og i EP B1 og EP A1. Humane antistoffer kan også bli produsert ved uttrykkingen av rekombinant DNA i vertsceller eller ved uttrykking i hybridomceller som beskrevet her. Transgenitet blir oppnådd på et antall ulike måter. Se for eksempel Bruggemann et al., Immunol Today 17:391-7 (1996). I én tilnærming blir et minilocus konstruert slik at gensegmenter i en kjønnslinjekonfigurasjon blir brakt kunstig nært hverandre. På grunn av størrelsesbegrensninger (dvs., har generelt mindre enn kb) så vil det resulterende minilocus inneholde et begrenset antall forskjellige gensegmenter, men er fremdeles i stand til å produsere et stort repertoar av antistoffer. Miniloci som kun inneholder humane DNA-sekvenser, inkludert promotere og enhancere er fult funksjonelle i den transgene musen. Når større antall gensegmenter er ønskelig i det transgene dyret blir kunstige gjærkromosomer (YAC) benyttet. YAC er kan ha en størrelse fra flere hundre kilobaser til 1 Mb og blir introdusert inn i musegenomet (eller annet passende dyr) via mikroinjeksjon direkte inn i et egg eller via overføring av YAC en inn i embryonale stamcelle (ES)-linjer. Generelt blir YAC er overført inn i ES-celler ved lipofeksjon av det rensede DNA, eller gjærsferoplastfusjon der det rensede DNA blir fraktet i miceller og fusjon blir utført på en måte tilsvarende hybridomfusjonsprotokoller. Valg av ønskede ES-celler etter DNA-overføring blir oppnådd ved på YAC en å inkludere en hvilken som helst av de selekterbare markørene som er kjent på fagområdet. Som et annet alternativ blir bakteriofag-p1-vektorer benyttet som blir amplifisert i en bakteriell E. coli-vert. Mens disse vektorene generelt inneholder mindre innsatt DNA enn en YAC så blir klonene enkelt dyrket i høyt nok utbytte til å tillate direkte mikroinjeksjon inn i et muse-egg. Anvendelse av en cocktail av ulike P1-vektorer har blitt vist å føre til høye nivåer av homolog rekombinasjon. Med en gang en passende transgen mus (eller annet passende dyr) har blitt identifisert ved å benytte enhver av teknikkene som er kjent på fagområdet for å påvise serumnivåer av et sirkulerende antistoff (for eksempel ELISA) så blir det transgene dyret krysset med en mus der det endogene Ig-locuset har blitt ødelagt. Resultatet gir avkom der så å si alle B-cellene uttrykker humane antistoffer. Som enda et annet alternativ blir hele dyre-ig-locuset erstattet med det humane Iglocuset, der det resulterende dyret kun uttrykker humane antistoffer. I en annen