(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 11 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 16/28 (06.01) A61K 39/39 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR (73) Innehaver Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 1, Rue de Tolbiac, 764 Paris Cedex 13, FR-Frankrike (72) Oppfinner PIERRES, Michel, Le Belvédère63, chemin du Mozambique, 116 Marseille, FR- Frankrike VIVIER, Eric, Chemin des Cuettes, Cassis, FR-Frankrike BARATIN, Myriam, 8, hameau des GorguettesRoute de Carnoux, Cassis, FR-Frankrike (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 170 Vika, 0118 OSLO, Norge (4) Benevnelse Monoklonale antistoffer som binder B7H6 og anvendelser derav (6) Anførte publikasjoner WO-A1-01/114 WO-A1-06/ WO-A2-09/ BRANDT CAMERON S ET AL: "The B7 family member B7-H6 is a tumor cell ligand for the activating natural killer cell receptor NKp in humans", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 6, no. 7, 6 July 09 ( ), pages 149-3, XP , ISSN: , DOI: DOI:.84/JEM [retrieved on ] VON STRANDMANN ELKE POGGE ET AL: "Human leukocyte antigen-b-associated transcript 3 is released from tumor cells and engages the NKp receptor on natural killer cells", IMMUNITY, CELL PRESS, US, vol. 27, no. 6, 1 December 07 ( ), pages , XP009146, ISSN: MORETTA LORENZO ET AL: "Unravelling natural killer cell function: Triggering and inhibitory human NK receptors", EMBO JOURNAL, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 23, no. 2, 28 January 04 ( ), pages 2-29, XP , ISSN: SCHLEINITZ NICOLAS ET AL: "Expression of the CD8j (Leukocyte Ig-like Receptor 1, Ig-like Transcript 2) Receptor for Class I Major Histocompatibility Complex Molecules in Idiopathic Inflammatory Myopathies", ARTHRITIS & RHEUMATISM, JOHN WILEY & SONS, INC, US, vol. 8, no., 1 October 08 (08--01), pages , XP , ISSN: [retrieved on ]

2 1 Beskrivelse TEKNISK OMRÅDE [0001] Oppfinnelsen vedrører monoklonale antistoffer som definert i kravene, som binder en tumorcelleligand, betegnet B7H6. Oppfinnelsen vedrører også anvendelsen av antistoffene, som bestemt i kravene. BAKGRUNN B7 Familie 1 2 [0002] Positive og negative co-stimulerende signaler spiller kritiske roller i modulasjonen av lymfocyttaktivitet, og molekylene som medierer disse signalene har bevist å være effektive mål for immunmodulatore midler. Ved interaksjon med B7-1 eller B7-2 på overflaten av antigenpresenterende celler (APC), emitterer f.eks. CD28, det prototypiske T celle co-stimulerende molekylet, signaler som fremmer T-celleformering og differensiering som svar på T-cellereseptor (TcR) tilkobling, mens CD28 homologt cytotoksisk T-lymfocyttantigen-4 (CTLA-4) medierer hemming av T- celleformering og effektorfunksjoner. (Se Chambers et al., Ann. Rev. Immunol., 19:6-94, 01; Egen et al., Nature Immunol., 3: , 02.) [0003] Flere molekyler med homologi til B7-familien har blitt oppdaget (Abbas et al., Nat. Med., :134-6, 1999; Coyle et al., Nat. Immunol., 2: 3-9, 01; Carreno et al., Annu. Rev. Immunol., : 29-3, 02; Liang et al., Curr. Opin. Immunol., 14: , 02), og deres rolle i lymfocyttaktivering har bare startet å bli belyst. Disse nye costimulerende counter-reseptorene inkluderer B7h2, PD-L1, PD-L2, B7-H3 og B7-H4. [0004] Uttrykket av kjent B7-familiemedlemmer er sterkt begrenset til antigenpresenterende celler. Studier har vist at B7-familiemedlemmer er counter-reseptorer på lymfoide celler som samhandler med kognatreseptorer på lymfocytter for å tilveiebringe positive eller negative co-stimulerende signaler som spiller kritiske roller i reguleringen av cellemedierte immunresponser. NK Celler og NKp [000] Naturlige killer (NK) celler er en undergruppe av lymfocytter aktive i immunsystemet og representerer et gjennomsnitt på ca. 1 % av mononukleære celler i humant perifert blod. NK-celler ble først beskrevet funksjonelt i 1971 ved observasjonen da dødelig bestrålte mus kunne avstøte allogene eller parentale arter av benmargcelle (BMC) allografter. (Se Cudowicz and Bennett, J. Exp. Med. 134:83-2, 1971; Cudowicz and Bennett, J. Exp. Med. 13: , 1971.) Cudowicz og Bennett observerte at bestrålte F1 hybrid H-2-heterozygote mus (A x B) kunne avstøte

3 parental H-2-homozygote BMC (A eller B). Denne observasjonen var i strid med de klassiske transplantasjonslovene i hvilke transplantasjonsantigener ble tenkt å arve codominerende og etterkommere ble obligat tolerante mot parentale hoved histoforenelige kompleks (MHC) determinanter. (Se Cudowicz og Bennett, J. Exp. Med. 134:83-2, 1971.) Cellene som er ansvarlige for dette fenomenet ble funnet å være radioresistente og identiske med lymfoide celler, som ble karakterisert senere i 197 av deres evne til å mediere spontan dreping av tumorer in vitro på en MHC-uhindret måte. (Se Herberman og Ortaldo, Science, 214:24-, 1981; Ortaldo og Herberman, Annu. Rev. Immunol. 2:39-394, 1984; Trinchieri, Adv. Immunol. 47: , 1989; Murphy et al., J. Natl. Cancer Inst. 8: , 1993.) Ytterligere bevis på at NKceller alene kunne mediere spesifisiteten av avstøting av benmarggraft dukket opp i 1987 når det ble observert at mus med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID), som ikke kan utvikle T- og B-celler, har normal NK-cellefunksjon. (Se Murphy et al., J. Exp. Med. 16: ,1987.) [0006] NK-celler blir for tiden forstått å representere en viktig arm av medfødt immunitet og å spille en primærrolle i immunovervåkingen mot tumorer og virusinfiserte celler. NK-celler er imidlertid ineffektive i å utføre deres normale funksjon, også når tilstede i ellers betydelige antall, hvis de ikke er aktivert. Redusert NK-celleaktivitet er riktignok forbundet med kreft og infeksiøse sykdommer (se Yamazaki et al., Oncology Reports 9:39-363, 02; Rosenberg et al., Cancer Research 1: (suppl.), 1991; Britteenden et al., Cancer 77: , 1996; U.S. Patent Nos og ). Som bemerket over, medierer NKcelleaktivitet omvendt akutt avstøting av BMC-allografter. Derfor synes nivåer av NKcelleaktivit å spille en viktig rolle i immunrelaterte sykdommer. [0007] NK-celleaktivitet er normalt regulert av intraksjon mellom MHC-klasse I molekyler og hemmende og aktiverende reseptorer. (Se, f.eks. Barao og Murphy, BB&MT 9: , 03.) "Missing-self" hypotesen er opprinnelig basert på observasjonen at tumorceller som lekker MHC-klasse-I-molekyler er mottagelige for dreping av NK-celler. (Se Ljunggren og Karre, Immunol. Today 11: , 1990; Ohlen et al., J. Immunol. 14:2-8, 1990.) Forskere observerte i tillegg at humane NK-celler lyserer klasse-i-mangelfulle Epstein-Barr-virus-omformede B-lymfoblast cellelinjer. (Storkus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: , 1989.) Det ble også funnet at transfeksjon av klasse-i-gener i klasse-i-mangelsfulle målceller medførte at disse cellene ble delvis eller fullstendig resistente mot NK-cellemediert lysering. (Se Storkus et al., supra; Shimizu og DeMars, Eur. J. Immunol., 19:447-41, 1989.) MHCklasse-I er imidlertid ikke alltid nødvendig for beskyttelse fra NK-cellemediert cytotoksisitet, og gjenkjenning av MHC-klasse-I hindrer ikke alltid cytolyse av NKceller. (Barao og Murphy, supra.) I løpet av de siste årene har forskjellige MHCklasse-I-spesifikke hemmende og aktiverende reseptorer samt non-mhc-klasse-i-

4 spesifikke aktiverende reseptorer blitt identifisert. Disse reseptorene er relevante med hensyn til terapeutiske tilnærminger slik som, f.eks. allogen BMT og kreftterapi. (Se id.) 0008] Non-MHC-klasse-I-spesifikke aktiverende reseptorer, som kan mediere NKcellecytotoksisitet mot MHC-klasse-I-mangelfulle eller negative mål, er representert i del av en heterogen familie av NK cellespesifikt immunglobulinlignende molekyler som er kjent som naturlige cytotoksisitetsreseptorer (NCRs). (Se, f.eks. Moretta et al., Annu. Rev. Immunol. 19: , 01; Diefenbach og Raulet, Immunol. Rev., 181: , 01.) I fraværet av MHC-klasse-I-uttrykk (slik som, f.eks. på tumorceller eller virusinfiserte celler), trigger ligasjon av disse aktiverende reseptorene på NK-celler målcelledreping. P?en slik aktiverende reseptor er NKp, som er selektivt og grunnleggende uttrykt p?modne naturlige killer-(nk)-celler og signaler gjennom, inter alia, kobling med CD3ζ. (Se Barao og Murphy, supra.) Målcelleliganden til hvilken NKp binder har ikke tidligere blitt identifisert. [0009] Dette systemet med medfødt gjenkjenning av NK-celler representerer et potensielt kraftfullt verktøy for klinisk applikasjon i allogen benmargstransplantasjon (BMT), kreftterapi eller behandling av andre NK-celle-forbundede sykdommer. (Se, f.eks. Barao og Murphy, supra.) Stimulering eller hemming av aktivering av NKp ville f.eks. være nyttig for å modulere NK-celleaktivitet og behandle sykdommer eller forstyrrelser forbundet med NK-celleaktivitet. Særlig ville forbedringen av NKcelleaktivitet ved å trigge NKp være nyttig for behandling av sykdommer eller lidelser karakterisert ved utilstrekkelig NK-celleaktivitet, slik som kreft og infeksiøse sykdom, mens hemming av NK-celleaktivitet ved å blokkere NKp ville være nyttig for å behandle NK-celle-medierte sykdommer, slik som, f.eks. BMC allograftavstøting. [00] Det nyeste medlemmet av B7-familien, B7H6, ble nylig oppdaget og karakterisert som en counter-reseptor for NKp, en reseptor selektivt uttrykt på modne naturlige killer-(nk)-celler og som er involvert i human naturlig cytotoksisitet som en aktivatorreseptor (Brandt et al.. J. Exp. Med., 6(7): 149-3, 09). B7H6 ble ikke påvist i normale humane vev, men ble uttrykt på humane tumorceller. [0011] Følgelig var det ikke et behov i teknikken for identifiseringen av antistoffer som kan hemme interaksjonen for B7H6 med NKp. Det er et terapeutisk potensial for slike antistoffer basert på deres evne til å modulere co-stimulerende signaler og immunresponser. Videre vil antistoffene som bindes til B7H6-proteiner være nyttige når konjugert til et cytotoksisk middel og anvendt til å måle en celle som uttrykker B7H6. Disse og andre anvendelser er svært ønskelige. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer sammensetninger og fremgangsmåter for disse og andre anvendelser som ville være tydelige for fagfolk i teknikken fra læringene heri.

5 4 KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN [0012] Et aspekt med den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer isolerte, monoklonale antistoffer som spesifikt bindes til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester fra SEQ ID NO:2. Antistoffet konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester fra SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller alternativt konkurrerer antistoffet om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424). [0013] I visse utførelsesformer er anti-b7h6 monoklonalt antistoff beskrevet over et murint antistoff, et kimært antistoff, et humanisert antistoff eller et humant antistoff. Antistoffet konkurrerer om binding til det humane B7H6 ekstracellulære domenet og hemmer interaksjonen av humant B7H6 med NKp. Hemmingen kan være fullstendig eller delvis blokkerende, og kan nøytralisere eller redusere interaksjonen. Egnede antistoffer inkluderer videre enkeltkjedede antistoffer. Andre bestemte variasjoner inkluderer antistoffer omfattende en Fc-region med minst en av ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet. I noen slike variasjoner, er Fc-regionen en enkeltkjedet Fc (scfc). Hvert av de bestemte monoklonale antistoffene som binder human B7H6 er egnet som en sammensetning omfattende antistoffet og farmasøytisk akseptabelt bindemiddel. Slike antistoffer er egnet for diagnostiske sett som påviser binding med antistoffet. [0014] I et annet aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et antistofflegemiddelkonjugat som definert i kravene, omfattende et monoklonalt antistoff som spesifikt bindes til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminsyrerester SEQ ID NO:2), der antistoffet blir konjugert til et cytotoksisk middel. Antistoffdelen av antistofflegemiddelkonjugatet er et antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424). Det monoklonale antistoffet kan f.eks. være et murint antistoff, et kimerisk antistoff, et humanisert antistoff eller et humant antistoff. Egnede antistoffer inkluderer videre enkeltkjedede antistoffer. I visse variasjoner omfatter antistoffet en Fc-region med minst et av ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet. I noen slike variasjoner, er Fc-regionen en enkeltkjedet Fc (scfc). Det cytotoksiske midlet kan f.eks. være et anti-tubulinmiddel, et DNA mindre sprekkbindende middel, et DNA mindre sprekkalkylerende middel, et duocarmycin eller et puromycin. Egnede antitubulinmidler inkluderer f.eks. dolastatin, et vinkaalkaloid, et podofyllotoksin, et taksan, et bakkatinderivat, et cryptofysin, et maytansinoid eller et kombretastatin. I

6 1 2 3 visse utførelsesformer blir antistoffet konjugert til legemidlet via en linker, og i noen tilfeller kan linkeren spaltes under intracellulære betingelser. Egnede spaltbare linkere inkluderer peptidlinkere, inkludert de spaltbare av en intracellulær protease. Alle de bestemte antistofflegemiddelkonjugatene er egnet som sammensetninger omfattende antistofflegemiddelkonjugatet og farmasøytisk akseptabelt bindemiddel. [001] I et annen relatert aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen in vitro fremgangsmåter for å redusere naturlig killer (NK)-celleaktivitet mot en celle som uttrykker human B7H6 ved å hemme interaksjonen av human B7H6 med human NKp. Slike fremgangsmåter inkluderer generelt å kontakte en celle som uttrykker human B7H6, i nærværet av en human NK-celle, med en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ) eller at antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424), hvori antistoffet hemmer interaksjonen av human B7H6 med human NKp (som definert i kravene). [0016] Spesifikasjonen beskriver å behandle benmargcelle (BMC)-allograftavstøting hos en person ved å hemme interaksjonen av human B7H6 med human NKp. Slike fremgangsmåter anvender generelt, i en mengde effektiv til å hemme NK-celleaktivitet og dermed behandle akutt BMC-allograftavstøting, et monoklonalt antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM I-4242) eller at antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM I-424), der antistoffet hemmer interaksjonen av human B7H6 med human NKp. [0017] Både fremgangsmåten for å redusere human NK-celleaktivitet og fremgangsmåten for å behandle BMC-allograftavstøting inkluderer visse utførelsesformer der antistoffene er humane eller humaniserte monoklonale antistoffer. Fremgangsmåtene inkluderer også utførelsesformer der antistoffet er et enkeltkjedet antistoff. [0018] I andre beslektede aspekter tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen in vitro fremgangsmåter for å redusere eller hemme veksten av B7H6-uttrykkende celler innen en cellepopulasjon med et antistofflegemiddelkonjugat som definert i kravene. Fremgangsmåtene omfatter generelt å kontakte de B7H6-uttrykkende cellene med en effektiv mengde av et antistofflegemiddelkonjugat omfattende (a) et antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCMI-424); og (b) et cytotoksisk middel konjugert til antistoffet. [0019] Et annet beslektet aspekt tilveiebringer for å behandle B7H6-uttrykkende kreft hos en person med et antistofflegemiddelkonjugat omfattende (a) et antistoff som

7 konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM I-4242); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCM I-424); og (b) et cytotoksisk middel konjugert til antistoffet. Inkludert er utførelsesformer der kreften er en kreft i tykktarmen, leveren, livmorhalsen, lungen, bukspyttkjertelen eller prostata. Andre egnede B7H6-uttrykkende kreftformer for behandling inkluderer prohemocytisk leukemi, B- cellelymfom, monocyttlymfom, erytroleukemi, Burkitts lymfom og kronisk myelogen leukemi. [00] I både en in vitro fremgangsmåte for å redusere eller hemme veksten av B7H6- uttrykkende celler inne i en cellepopulasjon og/eller en anvendelse for å behandle en B7H6-uttrykkende kreft hos en person, er humane eller humaniserte monoklonale antistoffer egnet for antistoffet omfattende antistofflegemiddelkonjugatet. Det er også egnet å anvende et enkeltkjedet antistoff for antistoffet omfattende antistofflegemiddelkonjugatet for disse fremgangsmåtene/ anvendelsene. [0021] I andre beslektede aspekter beskriver spesifikasjon å indusere antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) mot en B7H6-uttrykkende celle. Disse fremgangsmåtene inkluderer generelt å kontakte B7H6-uttrykkende celle med en effektiv mengde av et antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminsyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 9G9.2 (gjenstand nr. CNCM ); et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse E2.9 (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424); der kontaktingen er i nærværet av en NK eller en CD8 + T-celle uttrykkende en Fc-reseptor med ADCC-aktivitet og antistoffet omfatter en Fc-region som kan binde Fc-regionen. [0022] I andre beslektede aspekter beskriver spesifikasjon å indusere komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) mot en B7H6-uttrykkende celle. Disse fremgangsmåtene inkluderer generelt å kontakte den B7H6-uttrykkende cellen med en effektiv mengde av et antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminsyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 9G9.2 (gjenstand nr. CNCM I-4243); et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse E2.9 (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424); der kontaktingen er i nærværet av komplement, og antistoffet omfatter en Fcregion med CDC-aktivitet.

8 [0023] I begge fremgangsmåter for å indusere ADCC mot en B7H6-uttrykkende celle og/eller indusere CDC mot en B7H6-uttrykkende celle, inkluderer utførelsesformer humane eller humaniserte antistoffer. Inkludert er også enkeltkjedede antistoffer. En annen variasjon inkluderer Fc-regioner der Fc-regionen er en enkeltkjedet Fc (scfc). For begge fremgangsmåter er, i noen utførelsesformer, den B7H6-uttrykkende kreften en kreftcelle. Kreftcellen kan f.eks. være en tykktarmkreftcelle, en leverkreftcelle, en livmorhalskreftcelle, en lungekreftcelle, bukspyttkjertelkreftcelle, en prostatakreftcelle, en prohemocytisk leukemicelle, en B-cellelymfomcelle, en monocyttlymfomcelle, en erytroleukemicelle, en Burkitts lymfomcelle eller en kronisk myelogen leukemicelle. [0024] Et annet beslektet aspekt tilveiebringer et monoklonalt antistoff med oppfinnelsen for anvendelse i å behandle en B7H6-uttrykkende kreft. Det monoklonale antistoffet som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424); der antistoffet omfatter en Fc-region med minst en av ADCC-aktivitet og CDC-aktivitet. Egnede monoklonale antistoffer inkluderer humane antistoffer, humaniserte antistoffer og enkeltkjedede antistoffer. I visse variasjoner, er Fc-regionen en enkeltkjedet Fc (scfc). B7H6-uttrykkende kreftformer tilgjengelige for å behandle inkluderer f.eks. kreft i tykktarmen, leveren, livmorhalsen, lungen, bukspyttkjertelen eller prostata. Andre egnede B7H6-uttrykkende kreftformer inkluderer f.eks. prohemocytisk leukemi, B-cellelymfom, monocyttlymfom, erytroleukemi, Burkitts lymfom og kronisk myelogen leukemi. [002] Et annet beslektet aspekt tilveiebringer in vitro-fremgangsmåter for å påvise cellulær uttrykking av B7H6 der binding av antistoffet indikerer nærvær av B7H6 på en celle. Fremgangsmåten omfatter (1) å kontakte en biologisk prøve omfattende en human celle som skal testes med et monoklonalt antistoff som definert i kravene som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424); og (2) å påvise binding av antistoffet der bindingen indikerer nærværet av B7H6 på cellen og påviser om cellen uttrykker B7H6. I noen utførelsesformer er de biologiske prøvene intakte humane celler eller en membranfraksjon av cellen som skal testes. I visse utførelsesformer er antistoffet merket med en påvisbar merking. Egnede merkinger inkluderer radioisotoper, fluorescensmerkinger, kjemiluminescensmerkinger, enzymmerkinger eller bioluminescensmerkinger. [0026] I et beslektet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et monoklonalt antistoff med oppfinnelsen for anvendelse å diagnostisere en kreft som

9 8 uttrykker B7H6 hos en person. Det monoklonale antistoffet som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 (aminosyrerester av SEQ ID NO:2) med et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM ); eller et antistoff fremstilt av hybridom av klonbetegnelse 17B 1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424), og blir konjugert til en påvisbar merking. Egnede applikasjoner inkluderer diagnosen kreft i tykktarmen, leveren, livmorhalsen, lungen, bukspyttkjertelen eller prostata. [0027] I et annet aspekt tilveiebringer også den foreliggende oppfinnelsen antistofffremstillende celler valgt fra gruppen bestående av et hybridom av klonbetegnelse 4E. (gjenstand nr. CNCM I-4242); eller et hybridom av klonbetegnelse 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM 1-424). DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN I. Oversikt [0028] Den foreliggende oppfinnelsen vedrører identifikasjonen og karakteriseringen av anti-human B7H6 monoklonale antistoffer, som definert i kravene. [0029] B7H6 polypeptid ble først identifisert som en counter-reseptor for NKp, en reseptor selektivt uttrykt på modne naturlige killer (NK)-celler og er involvert i human naturlig cytotoksisitet som en aktivatorreseptor (se US patentsøknadpublikasjon nr. 09/0202). En illustrativ nukleotidsekvens som koder human B7H6 er tilveiebrakt av SEQ ID NO:1; det kodede polypeptidet er vist i SEQ ID NO:2. B7H6-polypeptidet av SEQ ID NO:2 omfatter et ekstracellulært domene av ca. 242 aminosyrerester (rester av SEQ ID NO:2), et transmembrandomene av ca. 18 aminosyrerester (rester av SEQ ID NO:2), og et intracellulært domene av ca. 18 aminosyrerester (rester av SEQ ID NO:2). B7H6 har også et IgV-domene av ca. 117 aminosyrerester (rester av SEQ ID NO:2) og et IgC domene av ca. 97 aminosyrerester (rester av SEQ ID NO:2). Det er også flere potensielle signaliseringsmønster inne i det intracellulære domenet av B7H6, inkludert et ITIM-mønster (SaYtpL, aminosyrerester av SEQ ID NO:2); et SH2 bindingsmønster (Yq1Q, aminosyrerester av SEQ ID NO:2); og et SH3 bindingsmønster (PdaPilPvsP, aminosyrerester av SEQ ID NO:2). [00] Den foreliggende oppfinnelsen oppstår fra fremstillingen av murine monoklonale antistoffer mot det humane B7H6 proteinet og karakterisering av egenskapene for disse antistoffene. Fem monoklonale antistoffer fra mus mot human B7H6 med isotypen IgG1 ble fremstilt av hybridomer. Antistoffene har blitt betegnet 4E., E1.4, 9G9.2, E2.9 og 17B1.3. Konkurranseanalyser viste at forskjellige epitoper ble gjenkjent av visse antistoffer. To av anti-b7h6 mabs, 17B1.3 og 4E., blokkerer delvis NKp:B7H6 interaksjonen, som vist ved hemmingen av NKpFc

10 binding og DOMSP aktivering. Disse studiene korrelerer struktur for funksjon og er beskrevet i eksemplene. De forskjellige monoklonale antistoffene er vist å være nyttige reagenser i biokjemiske og diagnostiske analyser samt å ha terapeutisk verdi. [0031] Derfor binder de monoklonale antistoffene definert i kravene et humant B7H6 celleoverflateprotein med de samme eller lignende spesifisitet og karakteristikker som mabs 4E. og/eller 17B1.3. Som beskrevet heri ble anti-human-b7h6 monoklonale antistoffer fra mus fremstilt og vist å bindes til forskjellige epitoper i konkurranseeksperimenter. Derfor tilveiebringer et aspekt med den foreliggende oppfinnelsen monoklonale antistoffer som kan konkurrere med disse antistoffene for binding til B7H6 (f.eks. et antistoff som kan binde den samme B7H6 epitopen som et antistoff valgt fra mabs 4E. og 17B1.3). Videre ble noen av antistoffene vist å fremkalle B7H6-NKp-interaksjonen. Følgelig hemmer anti-human-b7h6 monoklonale antistoffer med den foreliggende oppfinnelsen i noen utførelsesformer B7H6-mediert aktivering av NKp. [0032] Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre for humaniserte antistoffer avledet fra ikke-humane anti-b7h6 antistoffer (f.eks. humaniserte antistoffer avledet fra murine antistoffer), nøytraliserende antistoffer, humane monoklonale antistoffer og antigenbindende fragmenter derav. Illustrative antistoffragmenter inkluderer F(ab') 2, F(ab) 2, Fab', Fab, Fv, scfv og minimale gjenkjenningsenheter. Nøytraliserende antistoffer binder B7H6 slik at deres interaksjon med NKp er hemmet eller blokkert. Innen oppfinnelsens område er et monoklonalt antistoff som konkurrerer om binding til det ekstracellulære domenet av human B7H6 for anvendelse å hemme NK cellemedierte responser slik som f.eks. i akutt benmargcelle (BMC) allograftavstøting, der antistoffet er for administrasjon i en effektiv mengde for å blokkere NK-celleaktivitet og behandle BMC allograftavstøting. [0033] Anti-B7H6 antistoffer i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan også bli anvendt for å måle cytotoksiske midler til en B7H6-uttrykkende celle, særlig en B7H6-uttrykkende kreftcelle. Slike anti-human-b7h6 monoklonale antistofflegemiddelkonjugater fremstiller kliniske nyttige effekter på B7H6-uttrykkende celler når administrert til en person, slik som en person med en B7H6-uttrykkende kreft. Antistoffet er generelt for administrering alene, men kan være for administrering sammen med andre terapeutiske midler. I vanlige utførelsesformer blir et anti-human- B7H6 monoklonalt antistoff konjugert til et cytotoksisk middel, slik at det resulterende antistofflegemiddelkonjugatet utøver en cytotoksisk eller cytostatisk effekt på en B7H6-uttrykkende celle (f.eks. en B7H6-uttrykkende kreftcelle) når tatt opp eller internalisert av cellen. [0034] Derfor inkluderer den foreliggende oppfinnelsen i noen aspekter anti-human- B7H6 monoklonale antistofflegemiddelkonjugater, som definert i kravene. Antistoffdelen vil binde et humant B7H6 celleoverflateprotein med den samme eller lignende

11 1 2 spesifisitet og karakteristikker beskrevet heri, og legemiddelkonjugatdelen vil være et terapeutisk middel. Det anti-human-b7h6 monoklonale antistofflegemiddelkonjugatet vil utøve en klinisk nyttig effekt på B7H6-uttrykkende celler når administrert til en person med en B7H6-uttrykkende kreft. Legemiddelkonjugatdelen er et cytotoksisk middel og vil utøve en cytotoksisk eller cytostatisk effekt på en B7H6-uttrykkende celle. For disse antistofflegemiddelkonjugatene vil antistoffdelen gjenkjenne visse epitoper på B7H6. Det anti-human-b7h6 monoklonale antistofflegemiddelkonjugatet hemmer B7H6-NKp-interaksjonen. I noen utførelsesformer hemmer f.eks. et antihuman-b7h6 monoklonalt antistofflegemiddelkonjugat i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen aktivering av NKp. [003] I andre utførelsesformer omfatter anti-human-b7h6 monoklonalt antistoff en Fc-region med effektorfunksjon anvendt til å indusere antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) mot en B7H6- uttrykkende celle. Den foreliggende spesifikasjonen beskriver et anti-human-b7h6 monoklonalt antistoff omfattende en Fc-region med ADCC-aktivitet for anvendelse i å indusere ADCC. Til denne anvendelsen blir vanligvis en B7H6-uttrykkende celle kontaktet med en effektiv mengde av det anti-human-b7h6 monoklonale antistoffet omfattende en Fc-region og i nærværet av en cytolytisk immuneffektorcelle som uttrykker en Fc-reseptor med cytolytisk aktivitet. Immuneffektorceller som uttrykker cytolytiske Fc-reseptorer (f.eks. FcγRIIIα eller CD16) inkluderer f.eks. NK-celler samt visse CD8 + T-celler. I utførelsesformer der et anti-human-b7h6 monoklonalt antistoff omfattende en Fc-region med CDC-aktivitet er for anvendelse i å indusere CDC, blir generelt B7H6-uttrykkende celler kontaktet med en effektiv mengde av det antihuman-b7h6 monoklonale antistoffet omfattende en Fc-region med CDC-aktivitet, og er i nærværet av komplement. B7H6-utrykkende celler som kan bli målrettet for å drepe med antistoffene og fremgangsmåtene krevd heri, inkluderer f.eks. kreftceller, slik som f.eks. tykktarmkreftceller, leverkreftceller, livmorhalskreftceller, lungekreftceller, bukspyttkjertelkreftceller, prostatakreftceller, prohemocytiske leukemiceller, B- cellelymfomceller, monocyttlymfomceller, erytroleukemiceller, Burkitts lymfomceller og kronisk myelogen leukemiceller for å nevne noen få. [0036] Disse og andre aspekter med oppfinnelsen vil bli tydelig ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelsen. II. Definisjoner 3 [0037] Hvis ikke definert på annen måte, har alle tekniske og vitenskaplige uttrykk anvendt heri den samme betydning som vanlig forstått av en fagperson innen teknikken aktuell for fremgangsmåtene og sammensetningene beskrevet. Som anvendt heri, har

12 de følgende begrep og fraser betydningen tillagt dem med mindre spesifisert på annen måte. [0038] Begrepene "en", "ei", "et", "den" og "det" som anvendt heri inkluderer flertallsreferanser med mindre konteksten klart indikerer noe annet. [0039] Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester forbundet med peptidbånd, enten fremstilt naturlig eller syntetisk. Polypeptider på mindre enn ca. aminosyrerester blir vanligvis omtalt som "peptider." [0040] Et "protein" er et makromolekyl omfattende en eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptide komponenter, slik som karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre ikke-peptide substitutter kan bli satt til et protein via cellen i hvilken proteinet er fremstilt og vil variere med celletypen. Proteiner er definert heri i form av aminosyrens ryggradstrukturer; substitutter slik som karbohydratgrupper blir generelt ikke spesifisert, men kan ikke desto mindre være tilstede. [0041] Et "isolert polypeptid" er et polypeptid som er vesentlig fritt for kontaminerende cellulære komponenter, slik som karbohydrat, lipid eller andre proteinaktige urenheter forbundet med det naturlige polypeptidet. Normalt inneholder en fremstilling av isolert polypeptid, polypeptidet i en svært renset form, dvs. minst ca. 80 % rent, minst ca. 90 % rent, minst ca. 9 % rent, mer enn 9 % rent, slik som 96 %, 97 % eller 98 % eller mer rent eller mer enn 99 % rent. En måte å vise at en spesiell proteinfremstilling inneholder et isolert polypeptid er ved utseende av et enkelt bånd etter natriumdodekylsulfat (SDS)-polyakrylamid gelelektroforese av proteinfremstillingen og å farge gelen med Coomassie briljantblå. Begrepet "isolert" utelukker imidlertid ikke nærværet av det samme polypeptidet i alternative fysiske former, slik som dimere eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former. [0042] Begrepene "aminoterminal" og "karboksylterminal" er anvendt heri for å betegne posisjoner innen polypeptidene. Der konteksten tillater, blir disse begrepene anvendt med henvisning til en spesiell sekvens eller del av et polypeptid for å betegne nærhet eller relativ plassering. En viss sekvens plassert karboksylterminalt til en referansesekvens innen et polypeptid er f.eks. plassert proksimalt til karboksylterminen for referansesekvensen, men er nødvendigvis ikke ved karboksylterminen for det fullstendige polypeptidet. [0043] Begrepet "uttrykk" viser til biosyntesen for et genprodukt. Ved et strukturelt gen, involverer f.eks. uttrykk transkripsjon av det strukturelle genet i mrna og translasjonen av mrna i et eller flere polypeptider. [0044] Som anvendt heri inkluderer begrepet "immunmodulator" cytokiner, stamcellevekstfaktorer, lymfotoksiner, co-stimulerende molekyler, hematopoietiske faktorer og lignende, og syntetiske analoger av disse molekylene. [004] Begrepet "antistoff" som anvendt heri, viser til immunglobulinpolypeptider og immunologisk aktive deler av immunglobulinpolypeptider, dvs. polypeptider av

13 immunglobulinfamilien eller fragmenter derav, som inneholder et antigenbindingssted som immunspesifikt bindes til et spesifikt antigen (f.eks. det ekstracellulære domenet av B7H6). [0046] Et "antiidiotype antistoff" er et antistoff som bindes med det variable regiondomenet av et immunglobulin. I den foreliggende konteksten bindes et antiidiotype antistoff med den variable regionen av et anti-human-b7h6 monoklonalt antistoff og dermed et antiidiotype antistoff som etterligner en epitop av B7H6. [0047] Et "antistoffragment" er en del av et antistoff slik som F(ab') 2, F(ab) 2, Fab', Fab og lignende. Uavhengig av struktur, bindes et antistoffragment med det samme antigenet som er gjenkjent av det intakte antistoffet. Et anti- B7H6 monoklonalt antistoffragment bindes f.eks. til en epitop av B7H6. [0048] Begrepet "antistoff" omfatter også genetisk oppbygde intakte antistoffer eller fragments slik som, f.eks. kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, "Fv"-fragmenter bestående av de variable regionene av de tunge og lette kjedene, polypeptider bestående av den lette kjedens variable region, rekombinante enkeltkjedede antistoffer i hvilke lette og tunge variable regioner er koblet ved en peptidlinker ("scfv-proteiner"), minimale gjenkjenningsenheter bestående av aminosyreresten som etterligner den hypervariable regionen, og lignende, samt syntetiske antigenbindende peptider og polypeptider. [0049] Et "kimært antistoff" er et rekombinant protein som inneholder de variable domenene og komplementært bestemmende regioner avledet fra et gnagerantistoff, mens resten av antistoffmolekylet er avledet fra et humant antistoff. [000] "Humaniserte antistoffer" er rekombinante proteiner i hvilke ikke-humane (f.eks. murine) komplementært fastsettende regioner av et monoklonalt antistoff har blitt overført fra tunge og lette variable kjeder av det ikke-humane immunglobulinet inn i et humant variabelt domene. Oppbygging av humaniserte antistoffer for terapeutisk anvendelse hos mennesker som er avledet fra ikke-humane (f.eks. murine) antistoffer, slik som de som bindes til eller nøytraliserer et humant protein, er innen faget for en innen teknikken. [001] Begrepet "Fc-fragment," "Fc-region," eller "Fc domene," som anvendt heri, er synonymer og viser til delen av et antistoff som er ansvarlig for binding til antistoffreseptorer på celler og C1q-komponenten til kompliment. Fc står for "krystallfragment," et antistoffs fragment som enkelt vil danne et proteinkrystall. Distinkte proteinfragmenter, som opprinnelig ble beskrevet ved proteolytisk fordøying, kan definere den totale generelle strukturen av et immunglobulinprotein. Som opprinnelig definert i litteraturen, består Fc-fragmentet av de disulfidlinkede tunge kjedehengselregionene, C H 2 og C H 3-domenene. Nylig har imidlertid begrepet blitt brukt på en enkeltkjede bestående av C H 3, C H 2 og minst en del av hengselen egnet til å danne en disulfidlinket dimer med en andre slik kjede. For en gjennomgang av immunglobulin-

14 struktur og funksjon, se Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp ; og Padlan, Mol. Immunol. 31: , Som anvendt heri inkluderer begrepet Fc varianter av naturlig forekommende sekvenser. [002] Begrepene "enkeltkjedet Fc," "enkeltkjedet Fc-domene," og "scfc," som anvendt heri, er synonymer og viser til en polypeptidfusjon omfattende to Fc-domenemonomerer forbundet med en fleksibel linker, slik at de to Fc-monomerene kan dimerisere for å danne et funksjonelt, dimerisk Fc-domene som kan binde Fcreseptorer. Enkeltkjede Fc-polypeptider er videre beskrevet i International PCT Patent Application Publication No. WO 08/ , kalt "Single Chain Fc, Methods of Making, and Methods of Treatment," omtalen av hvilke er innlemmet som referanse heri i sin helhet. [003] Begrepet "Fc-region med ADCC-aktivitet," som anvendt heri, viser til et Fcdomene som kan mediere antistoffavhengig cellul? cytotoksisitet (ADCC) gjennom binding av en cytolytisk Fc-reseptor (f.eks. FcγRIIIα) p?en cytolytisk immun effektorcelle som uttrykker Fc-reseptoren (f.eks. en NK-celle eller CD8 + T-celle). [004] Begrepet "komplement" viser kollektivt til de komponentene i normalt serum som, sammen med antigenbundede antistoffer, viser evnen til å lysere celler. Komplement består av en gruppe serumproteiner som opptrer samlet og i en ordnet rekkefølge for å utøve deres effekt. [00] Begrepene "klassisk komplementvei" og "klassisk komplementsystem," som anvendt heri er synonymer og viser til en spesiell vei for aktiveringen av komplement. Den klassiske veien krever antigen-antistoffkomplekser for initiering og involverer aktiveringen, på en ordnet måte, av ni hovedproteinkomponenter betegnet C1 til C9. For flere steg i aktiveringsprosessen, er produktet et enzym som katalyserer det etterfølgende steget. Denne kaskaden tilveiebringer amplifikasjon og aktivering av store mengder komplement ved et relativt lite innledende signal. [006] Begrepet "Fc-region med CDC-aktivitet," som anvendt heri, viser til et Fcdomene som kan mediere komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) gjennom binding av C1q-komplementprotein og aktivering av det klassiske komplementsystemet. [007] Begrepet "middel" som anvendt heri betyr et grunnstoff, forbindelse eller annen molekylær enhet, inkludert, f.eks. en farmasøytisk, terapeutisk eller farmakologisk forbindelse. Midler kan være naturlige eller syntetiske eller en kombinasjon derav. Et "terapeutisk middel" er et middel som utøver en terapeutisk (f.eks. fordelaktig) effekt på en celle eller et vev (f.eks. på en celle eller vev som uttrykker B7H6, slik som en B7H6-uttrykkende kreftcelle), enten alene eller i kombinasjon med et annet middel (f.eks. en prodroge som omdanner enzym sammen med en prodroge). I visse aspekter med den foreliggende oppfinnelsen, er et "terapeutisk middel" et middel konjugert til et antistoff for å fremstille et konjugat som er nyttig for terapi. Eksempler på terapeutiske midler inkluderer legemidler, toksiner,

15 immunmodulatorer, chelatorer, borforbindelser, fotoaktive midler eller fargestoffer og radioisotoper. I noen variasjoner er et terapeutisk middel for konjugering til et antistoff et middel som utøver en cytotoksisk eller cytostatisk effekt. [008] "cytotoksisk effekt," med referanse til effekten av et middel på en celle, betyr dreping av cellen. "Cytostatisk effekt" betyr en hemmer av celleformering. Et "cytotoksisk middel" betyr et middel som har en cytotoksisk eller cytostatisk effekt på en celle, og derved henholdsvis å redusere eller hemme veksten av celler innen en cellepopulasjon. [009] En "påvisbar merking" er et molekyl eller atom som kan bli konjugert til en antistoffdel for å fremstille et molekyl nyttig for diagnostisering. Eksempler på påvisbare merkinger inkluderer chelatorer, fotoaktive midler, radioisotoper, fluorescensmidler, paramagnetiske ioner eller andre merkingsdeler. [0060] Begrepet "affinitetstag" er anvendt heri for å betegne et polypeptidsegment som kan bli festet til et andre polypeptid for å tilveiebringe for rensing eller påvisning av det andre polypeptidet eller tilveiebringe steder for festing av det andre polypeptidet til et substrat. I hovedsak kan ethvert peptid eller protein for hvilket et antistoff eller annet spesifikt bindemiddel er tilgjengelig bli anvendt som en affinitetstag. Affinitetstagger inkluderer en poly-histidinområde, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:7, 198; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutation S transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu affinitetstag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:792, 198), substans P, FLAG-peptid (Hopp et al., Biotechnology 6:14, 1988), streptavidinbindende peptid eller annen antigenisk epitop eller bindende domene. Se generelt Ford et al.. Protein Expression and Purification 2:9, DNA-molekyler som koder affinitetstagger er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). [0061] Et "nakent antistoff" er et helt antistoff, motsatt til et antistoffragment, som ikke er konjugert med et terapeutisk middel. Nakne antistoffer inkluderer både polyklonale og monoklonale antistoffer, samt visse rekombinante antistoffer, slik som kimære og humaniserte antistoffer. [0062] begrepet "monoklonalt antistoff" viser til et antistoff som er avledet fra et enkelt celleklon, inkludert ethvert eukaryotisk eller prokaryotisk celleklon eller et fagklon og ikke fremgangsmåten ved hvilken det er fremastilt. Dermed er begrepet "monoklonalt antistoff" som anvendt heri ikke begrenset til antistoffer fremstilt gjennom hybridomteknologi. [0063] Et "immunkonjugat" er et konjugat av et antistoff med et terapeutisk middel eller en påvisbar merking. [0064] Begrepet "epitop" viser til enhver proteindeterminant som kan spesifikt binde til et immunglobin eller T-cellereseptor. Epitopiske determinanter består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler slik som aminosyrer eller sukker

16 sidekjeder og har vanligvis spesifikke tredimensjonale strukturelle karakteristikker, samt spesifikk ladningskarakteristikker. Mer spesifikt viser begrepet "B7H6-epitop" som anvendt heri til en del av B7H6-polypeptidet med antigenisk eller immunogenisk aktivitet i et dyr, foretrukket et pattedyr og mest foretrukket en mus eller et menneske. En epitop med immunogenisk aktivitet er en del av et B7H6 polypeptid som fremkaller en antistoffrespons hos et dyr. En epitop med antigenisk aktivitet er en del av et B7H6 polypeptid til hvilket et antistoff immunspesifikt bindes som bestemt av enhver fremgangsmåte velkjent innen teknikken, f.eks. ved immunanalyser. Antigeniske epitoper trenger ikke nødvendigvis være immunogeniske. "Diskontinuerlige epitoper" er tilpassede epitoper dannet fra minst to atskilte regioner i den primære sekvensen av B7H6-proteinet. Tilpassede epitoper mister evnen til spesifikt å binde i nærværet av denaturerende løsningsmidler (f.eks. i Western blot analyser). [006] "NK-celleaktivitet" som anvendt heri viser til NK-cellecytolytisk aktivitet. Det er mange analyser velkjent av fagutøvere for å påvise og/eller overvåke slik aktivitet, inkludert, men ikke begrenset til analysene beskrevet i eksemplene tilveiebrakt heri. [0066] Som anvendt heri viser frasen "interaksjon av B7H6 og NKp" til direkte fysisk interaksjon (f.eks. binding) og/eller annen indirekte interaksjon av en funksjonell B7H6-reseptor med NKp på en NK-celle, resulterende i stimulering av B7H6- reseptoren og/eller NKp og forbundet intracellulær signalisering. [0067] Som anvendt heri, viser begrepet "blokkerende antistoff til et antistoff som interfererer med (dvs. hemmer) interaksjonen av B7H6 og NKp, og/eller den interfererer med evnen til B7H6 til å trigge NK-celleaktivitet, f.eks. som målt ved cytolytisk aktivitet. Hemming må ikke være fullstendig og kan være "delvis", dvs. en minsking eller reduksjon i aktivitet som en innbyrdes måling til en kontroll eller standard. [0068] Frasen "sykdom eller lidelse karakterisert av nærværet av B7H6-uttrykkende celles," som anvendt heri, viser til enhver sykdom eller lidelse som involverer, minst delvis, patogene celleuttrykkende B7H6. Slike patogene celler inkluderer f.eks. visse tumorceller. Følgelig er vanligvis sykdommer eller lidelser karakterisert av nærværet av B7H6-uttrykkende celler visse kreftformer. Slike sykdommer og lidelser er spesielt mottagelige for visse behandlingsfremgangsmåter for å målrette B7H6-uttrykkende celler, som beskrevet videre heri. [0069] Begrepet "sykdom eller lidelse mediert av NKp-uttrykkende celler" og "sykdom eller lidelse forbundet med økt aktivitet av en NKp-uttrykkende celle" blir anvendt synonymt heri for å vise til enhver sykdom eller lidelse med en patologi som er mediert, minst delvis ved cytolytisk aktivitet av en NKp-uttrykkende celle. I noen variasjoner er den NKp-yttrykkende-celle-medierte sykdommen eller lidelsen en "NK celle-mediert sykdom eller lidelse," med en patologi som er mediert, minst delvis, av NK-cellecytolytisk aktivitet. Et eksempel på en slik sykdom eller lidelse er akutt

17 avstøting av benmargcelle (BMC) allografter. Slike sykdommer eller lidelser er spesielt mottagelige for visse behandlingsfremgangsmåter for å hemme NK-celleaktivitet, som beskrevet videre heri. [0070] Begrepet "effektiv mengde," i konteksten for behandling av en sykdom eller lidelse mediert av NKp-uttrykkende celler ved administrering av et blokkende anti- B7H6 antistoff til en person som beskrevet heri eller i konteksten for behandling av en sykdom eller lidelse karakterisert av nærværet av B7H6-uttrykkende celler ved administrering av et anti-b7h6 antistoff eller antistofflegemiddelkonjugat til en person som beskrevet heri, viser til mengden av slikt molekyl som er tilstrekkelig til å hemme forekomsten eller bedre en eller flere kliniske eller diagnostiske symptomer for sykdommen eller lidelsen hos en person. En effektiv mengde av et middel blir administrert ifølge fremgangsmåtene med den foreliggende oppfinnelsen i et "effektivt regime." Begrepet "effektivt regime" viser til en kombinasjon av mengde av midlet som blir administrert og doseringsfrekvens adekvat til å utføre behandling eller hindring av sykdommen elle lidelsen. [0071] På grunn av unøyaktigheter med standard analytiske fremgangsmåter, er molekylvekter og polymerlengder forstått å være omtrentlige verdier. Når en slik verdi er uttrykt som "ca." X eller "omtrentlig" X, vil den angitte verdien på X bli forstått å være nøyaktig til ± %. III. Antistoffer til B7H6-proteiner [0072] I et aspekt beskriver den foreliggende spesifikasjonen anti-human-b7h6 monoklonale antistoffer som spesifikt binder til en epitop av human B7H6 (f.eks. til et polypeptidsegment fra aminosyresekvensen satt ut i rester of SEQ ID NO:2). De anti-human B7H6 monoklonale antistoffene definert i kravene kan hemme B7H6- NKp-interaksjonen. Hemming må ikke være fullstendig blokking av B7H6-NKp- interaksjonen og kan være en minsking eller reduksjon i aktivitet som en innbyrdes måling til en kontroll eller standard. Et monoklonalt anti-human B7H6 antistoff i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan konkurrere om binding til human B7H6 antigen med et antistoff fremstilt av et hybridom valgt fra 4E. (gjenstand nr. CNCM ) eller 17B1.3 (gjenstand nr. CNCM I-424). Disse hybridomene ble deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur; Paris, France) 18. november 09, i navnet til Institut National De La Santé et De La Recherche Médicale (INSERM). [0073] Fem anti-human B7H6 monoklonale antistoffer fra mus ble identifisert og karakterisert, og er beskrevet heri. Karakterisering av antistoffene viste at noen av disse monoklonale antistoffene gjenkjenner forskjellige epitoper på B7H6-proteinet, vist ved

18 konkurrerende bindingsanalyser og omtalt heri. Karakterisering av antistoffene viste videre at to av disse antistoffene minst delvis blokkerer B7H6-NKp-interaksjonen. [0074] Epitopvraking kan bli anvendt for å identifisere antistoffer som faller innen den krevde oppfinnelsens område. Epitopvraking viser til anvendelsen av konkurrerende bindingsanalyser for å identifisere par av antistoffer som kan, eller ikke kan, binde B7H6 protein samtidig, og derved identifisere par av antistoffer som bindes til de samme eller overlappende epitoper på et protein. Epitopvrakingsforsøk tilveiebringer bevis for at antigeniske tydelige epitoper er til stede. Ytterligere data er nødvendig for å identifisere, eller "kartlegge" epitopen til en spesifikk aminosyresekvens eller plassering av B7H6 proteinmolekylet. [007] Konkurranse om binding kan bli evaluert for ethvert par av antistoffer eller fragmenter. Anvendelse av de egnede påvisningsreagensene, bindingsspesifisitet for antistoffer eller bindingsfragmenter fra enhver kilde kan f.eks. bli sammenlignet med bindingsspesifisiteten for de monoklonale antistoffene omtalt heri. Epitopvraking kan bli utført med "isolerte antistoffer" eller med cellekultursupernatanter. Ofte blir vraking utført med første runde klonale supernatanter for å lede valget av kloner som skal bli utviklet videre. Antistoffene som skal sammenlignes må være vesentlig homogene antigenbindende domener. I tilfellet "bispesifikke" eller "bifunksjonelle" antistoffer, trenger bindingsspesifisitet for de to forskjellige bindingsstedene å bli evaluert eller vraket uavhengig. [0076] Antistoffene med den foreliggende oppfinnelsen kan bli analysert for spesifikk binding ved enhver kjent fremgangsmåte innen teknikken. Mange forskjellige konkurrerende bindingsanalyserformat(er) kan bli anvendt for epitopvraking. Immunanalysene som kan bli anvendt inkluderer, men er ikke begrenset til, konkurrerende analysesystemer med teknikker slik som western blots, radioimmunanalyser, ELISA, "sandwich" immunanalyser, immunpresipiterende analyser, presipitinanalyser, geldiffusjonspresipitinanalyser, immunradiometriske analyser, fluorescensimmunanalyser, protein A immunanalyser og komplementfikseringsanalyser. Slike analyser er vanlige og velkjent i teknikken (se, f.eks. Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New York). I tillegg kan vanlige kryssblokkingsanalyser slik som de beskrevet i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane, 1988, bli utført. [0077] The BIACORE (GE Healthcare, Piscaataway, NJ) er kun en av mange overflateplasmon resonansanalyseformater som vanligvis blir anvendt til å epitopvrake paneler for monoklonale antistoffer. Andre referanser, f.eks. The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996, beskriver alternative fremgangsmåter som kunne bli anvendt for å binde antistoffer og ville bli forventet å tilveiebringe sammenlignbar informasjon angående bindingsspesifisiteten for antistoffene til B7H6-ligand. Ved å anvende BIACORE -

19 system, blir epitopvrakingseksperimenter utført med løselig, nativt eller rekombinant antigen. Epitopvrakingsstudier kan bli utført på et BIACORE00 -system (GE Healthcare, Piscataway, NJ). BIAlogue v. 1.2 programvare kan bli anvendt for å programmere analysefremgangsmåter. For å vrake monoklonale antistoffer fra mus rettet mot B7H6, kan f.eks. polyklonale anti-mouse IgG Fc antistoff fra geit (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) bli kovalen immobilisert mot en BIACORE CM sensorchip og anvendt for å bind (fange) det primære monoklonale antistoffet for testserier mot chipen. Uokkuperte Fc-bindingssteder på chipen blir så blokkert med et polyklonalt IgG Fc-fragment (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Deretter blir B7H6 protein injisert og tillatt å spesifikt bindes til de fangede primære monoklonale antistoffene. BIACORE -instrumentet måler massen av protein bundet til sensorchipen, og bindingen av både det primære antistoffet og B7H6 antigen kan bli verifisert for hver syklus. Etter bindingen av det primære antistoffet og antigenet til chipen, blir løselig sekundært antistoff injisert og tillatt å bindes til det forhåndsbundne antigenet. Hvis det sekundære monoklonale antistoffet kan binde B7H6 antigenet samtidig med det primære monoklonale antistoffet, blir dets binding påvist av BIACORE. Hvis imidlertid det sekundære monoklonale antistoffet ikke kan binde B7H6 antigenet samtidig med det primære monoklonale antistoffet, blir ingen ytterligere binding påvist. Hvert monoklonalt antistoff blir testet mot seg selv som en negativ kontroll for å etablere nivået av bakgrunnssignalet (ikkebindende). [0078] Et merkingsfritt konkurrerende ELISA format (LFC-ELISA) kan også bli anvendt for å vrake antistoffer. Denne fremgangsmåten er beskrevet av Nagata et al., J. Immunol. Methods 292:141-1, 04, og bruker biotinylert B7H6. For eksemplet med binding av monoklonale antistoffer fra mus rettet mot B7H6, blir mikrotiterplater belagt med 0 탅/br?n med 1 킽/ml av et anti-mus IgG Fc-γ-spesifikt antistoff fra geit (Jackson ImmunoResearch) fortynnet i ELISA B (PBS, 0,1 % Tween, 1 % BSA). Etter binding av dette beleggende antistoffet i 3 timer ved omgivende temperatur, blir hvert mab-inneholdende kondisjonert medium fortynnet i ELISA B for å gi en omtrentlig mab-konsentrasjon på 0, µg/ml og tillatt å bindes til platene belagt med anti-mouse IgG fra geit over natten ved 4 C. (mab#1). Parallelt blir et andre sett kondisjonerte medier (mab#2) fortynnet i polystyren testrør til omtrentlig 0, µg/ml mab i ELISA B, blandet med 0 ng/ml biotinylert B7H6-antigen, og inkubert over natten ved 4 C. Etter inkubering av mab#1 med det beleggende antistoffet, blir platene blokkert med et ubeslektet antistoff for å mette uokkuperte bindingssteder på platen. mab#2-biotin-b7h6-blandinger blir tilsatt platen og tillatt å binde. Som en kontroll for (ikke-konkurranse) i analysen, blir 0 ng/ml biotinylert B7H6 tilsatt direkte (uten forhåndsinkubasjon med mab#2) til brønner inneholdende immobilisert mab#1. Etter inkubering med det biotinylerte- B7H6 -mab#2 komplekset, blir streptavidin- HRP (Pierce, Rockford, Ill.) satt til platen med 0, µg/ml. Platene blir så utviklet med

20 TMB-substrat (BioFX Laboratories, Owings Mills, Md.), og absorbansen for de enkelte brønnene ved 40 nm blir målt med en plateleser (Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, Calif.). Hvis mab#1 bindes til en annen epitop enn mab#2, vil biotin- B7H6-mAb#2-komplekset bindes til platen og føre til en høy absorbansavlesning. Hvis mab#1 bindes til den samme epitopen som mab#2, vil biotin- B7H6-MAb#2- komplekset bindes til platen og føre til en lav absorbansavlesning. [0079] Et anti-human-b7h6 monoklonalt antistoff med den foreliggende oppfinnelse kan hemme interaksjonen av B7H6 med human NKp; slike antistoffer er nyttige, f.eks. for å hemme cellulære eller andre fysiologiske hendelser forbundet med interaksjonen av B7H6 med NKp, inkludert, f.eks. B7H6- og/eller NKp-mediert intracellulær signalisering og forbundet effektorfunksjon (f.eks. NKp-mediert cytolytisk aktivitet). [0080] Antistoffer mot B7H6 kan bli oppnådd med f.eks. produktet fra en B7H6- uttryksvektor eller B7H6 isolert fra en naturlig kilde som et antigen. Spesielt nyttige anti-human-b7h6 monoklonale antistoffer "binder spesifikt" til B7H6. Antistoffer er antatt å være spesifikt bindende hvis antistoffene viser minst en av de følgende to egenskapene: (1) antistoffer bindes til B7H6 med et terskelnivå for bindingsaktivitet, og (2) antistoffer kryssreagerer ikke betydelig med polypeptider beslektet med B7H6. [0081] Angående de første karakteristikkene, bindes antistoffer spesifikt hvis de bindes til et B7H6 polypeptid, peptid eller epitop med en bindingsaffinitet (K a ) på 6 M -1 eller større, foretrukket 7 M -1 eller større, mer foretrukket 8 M -1 eller større og mest foretrukket 9 M -1 eller større. Bindingsaffiniteten for et antistoff kan enkelt bli bestemt av en fagperson innen teknikken, f.eks. ved Scatchard-analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 1:660, 1949). Angående den andre karakteristikken, kryssreagerer ikke antistoffer betydelig med beslektede polypeptidmolekyler, f.eks. hvis de påviser B7H6, men ikke for øyeblikket kjente polypeptider med en standard Western blot-analyse. Eksempler på kjente beslektede polypeptider inkluderer kjente B7 familiemedlemmer. [0082] Anti-human-B7H6 monoklonale antistoffer kan bli fremstilt med antigenisk B7H6 epitopbærende peptider og polypeptider. Antigenisk epitopbærende peptider og polypeptider inneholder normalt en sekvens på minst ni, eller mellom 1 til ca. aminosyrer rommet inne i aminosyresekvensen for SEQ ID NO:2. Peptider eller polypeptider omfattende en større del av en aminosyresekvens med oppfinnelsen, inneholdende fra til 0 aminosyrer eller enhver lengde opp til og inkludert hele aminosyresekvensen for et B7H6 polypeptid, er imidlertid også nyttig for å indusere antistoffer som bindes med B7H6. Det er ønskelig at aminosyresekvensen for det epitopbærende peptidet er valgt å tilveiebringe vesentlig løselighet i vandige løsningsmidler (dvs. sekvensen inkluderer relativt hydrofile rester, mens hydrofile