Tittel: IL-2-MUTEIN FOR BEHANDLING ELLER PROFYLAKSE AV EN AUTOIMMUN SYKDOM

Transkript

1 1 Tittel: IL-2-MUTEIN FOR BEHANDLING ELLER PROFYLAKSE AV EN AUTOIMMUN SYKDOM Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et middel for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom. Autoimmune sykdommer karakteriseres av en overreaksjon fra immunsystemet mot kroppseget vev. Immunsystemet oppfatter ved en feil kroppseget vev som et fremmedlegeme som må bekjempes. Dette forårsaker alvorlige betennelsesreaksjoner som kan føre til skader på berørte organer I differensieringen mellom kroppsegne og kroppsfremmede strukturer spiller T- lymfocytter, eventuelt T-celler, som "læres opp" i thymus til bare å koble seg til egne celleoverflatemolekyler, såkalte MHC-molekyler og dermed tolerere kroppsegne strukturer, en viktig rolle. Disse prosessene kalles "klondelesjon" og "klonseleksjon". Ved den første seleksjonen i thymus overlever bare de T-cellene som kan gjenkjenne MHC-molekyler på de kroppsegne cellemembranene, hvorved bindingen ikke er så sterk at den fører til aktivering av T-cellene. T-celler som ikke kan binde eller gjenkjenne egne MHC-molekyler, elimineres. Ved klondelesjonen, som også finner sted i thymus, elimineres de T-cellene som kan gjenkjenne og binde MHC-molekyler så "målrettet" og fast at de ville aktiveres, noe som i siste instans ville føre til ødeleggelse av kroppsegne celler. Denne prosessen er et av de tiltakene som immunsystemet iverksetter for å kunne skåne "det egne" og bekjempe "det fremmede". Ved autoimmune sykdommer oppfører en gruppe av T-cellene seg avvikende. I tillegg til det fortsatt fungerende forsvaret mot fremmede molekyler og organismer, angriper de nå også kroppsegne strukturer. Organer eller vev oppfattes som fremmede. Konsekvensene kan være forskjellige: Dersom livsnødvendige strukturer er berørt, har en autoimmun sykdom et dødelig forløp. Immunsystemet retter forsvaret mot disse strukturene, cellulære og også humorale forsvarsreaksjoner settes i gang, autoantistoffer dannes, noe som fører til at berørte organer etter hvert slutter å fungere. Som regel svekkes immunsystemet og kroppen blir sårbar overfor allslags sykdommer. Det kan i noen tilfeller også hende at gjenkjennelsen av fremmede elementer forstyrres, dermed kan utbredelsen av avvikende kreftceller ikke lenger forhindres effektivt, og de berørte er

2 2 mer sårbare overfor infeksjonssykdommer. I sykdommens forløp ødelegger cellene i immunsystemet de kroppsegne strukturene mens kroppens reparasjonsmekanismer prøver å fornye de skadde organdelene der det er mulighet for det. Uten behandling fortsetter dette feilaktige angrepet fra immunsystemet hele livet eller til målstrukturen er fullstendig ødelagt. De nøyaktige årsakene til autoimmune sykdommer er til tross for intensiv forskning fortsatt uklare. Anerkjente hypoteser går ut fra at autoimmune sykdommer oppstår på grunn av genetisk disposisjon, f.eks. på grunn av tilstedeværelsen av bestemte MHC-molekylvarianter, i kombinasjon med ytre påvirkning. Dersom det finnes slike genetisk betingede faktorer i kroppen hos den berørte og det i tillegg oppstår ugunstige miljøfaktorer som kraftig stress, infeksjoner, graviditet osv., kan det føre til utbrudd av autoimmune sykdommer Immunsystemet består av forskjellige celler som er i stand til å bekjempe infeksiøse agenser som har trengt inn i kroppen. Immunsvarets mekanisme omfatter aktivering av spesialiserte celler og akkvisisjon av effektorfunksjoner som cytotoksisitet av bestemte T-celler som eksprimerer det såkalte CD8- transmembranglykoproteinet og derfor betegnes som CD8 + -T-celler. Regulatoriske T-celler (T Reg ), tidligere betegnet som suppressor-t-celler, er en spesialisert undergruppe av T-celler. De har som funksjon å undertrykke aktiveringen av immunsystemet og dermed regulere immunsystemets selvtoleranse. I friske organismer forhindrer de dermed at det oppstår autoimmune sykdommer. Det er beskrevet flere T-reg-populasjoner inkludert dem som eksprimerer proteinene CD4, CD2 og Foxp3 og derfor betegnes som CD4 + CD2 + Foxp3 + -Tceller. I tillegg er det beskrevet T Reg som riktignok eksprimerer CD4 og Foxp3, men ikke CD2, såkalte CD4 + CD2 - Foxp3 + -T-celler. 30 Lan et al. (200), Regulatory T cells: development, function and role in autoimmunity, Autoimmun. Rev. 4(6), s. 31 til 363, beskriver en musemodell der deplesjonen av CD4 + CD2 + regulatoriske T-celler fører til spontan utvikling av autoimmune sykdommer. 3 Chatila T.A. (200), Role of regulatory T cells in human diseases, 116(), s. 949 til 99, beskriver at en medfødt defisiens av CD4 + CD2 + regulatoriske T-celler

3 3 på grunn av en mutasjon i genet som koder for proteinet Foxp3, bidrar til utviklingen av autoimmune sykdommer. En oversikt over regulatoriske T-celler finnes i tidsskriftet "Nature Immunology" som ble utgitt i mars Autoimmune sykdommer behandles i henhold til hvilket organ som er berørt. Herved er grunnprinsippet i den kausale terapien å dempe immunsystemets aktivitet ved administrering av immunsuppressiva, f.eks. kortison. Disse substansene kjennetegnes ved mangfoldige systemiske bi- og vekselvirkninger, noe som har ført til at man prøvde å utvikle nye medikamenter som spesifikt påvirker mekanismer som deltar i sykdomsforløpet. Eksempler på disse er natalizumab og infliksimab. Natalizumab er et monoklonalt antistoff og en selektiv hemmer av IgG4, et adhesjonsmolekyl som befinner seg på overflaten av hvite blodceller. Natalizumab hemmer inntrenging av hvite blodceller i betennelseskilden og brukes i behandling av spesielt aggressive former av multippel sklerose der sykdomsforløpet går i sprang. Infliksimab er et kimært monoklonalt antistoff mot tumornekrosefaktor α (TNFα) som spiller en nøkkelrolle i autoimmune betennelsesreaksjoner. Infliksimab brukes ved revmatoid artritt, morbus Crohn, morbus Bechterew og psoriasis. 2 I Ehrenstein et al. (2004), Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-tnfα therapy, J. Exp. Med., Vol. 200, nr. 3, s , beskrives det at infliksimab som et monoklonalt antistoff rettet mot TNFα kan forbedre behandlingen av revmatoid artritt. 30 Noe tilsvarende foreslås av Nadkarni et al. (2007), Anti-TNFα therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGFβ, JEM Vol. 204, s Bresson et al. (2006) foreslår å behandle type 1-diabetes med kombinert administrering av et anti-cd3ε-spesifikt antistoff og et proinisulinpeptid. 3 Vandenbark et al. (2008), Therapeutic vaccination with a trivalent T-cell receptor (TCR) peptide vaccine restores deficient FoxP3 expression and TCR recognition in subjects with multiple sderosis, Immunology Vol. 123, s , beskriver en

4 4 forbedring av kontrollen av den autoreaktive responsen ved multippel sklerose etter vaksinering av pasientene med bestemte TCR-peptider. 1 Selv om disse nyere substansene virker svært spesifikt, kan det oppstå alvorlige bivirkninger, f.eks. forekomst av progressiv multifokal leukoencefalopati. Derfor ble natalizumab tatt av markedet igjen bare tre måneder etter førstegangs godkjenning i USA. Kostnadene for disse nye virkestoffene er svært høye. 300 mg natalizumab koster for tiden mer enn EUR 2000,. 200 mg infliksimab koster ca. EUR 1700,-. På denne bakgrunnen har den foreliggende oppfinnelsen til oppgave å tilveiebringe et nytt legemiddel for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom, der man i størst mulig grad unngår ulempene ved kjent teknikk. Spesielt skal det tilveiebringes et legemiddel som utmerker seg ved god toleranse og lav toksisitet Disse oppgavene løses ved tilveiebringelse av et mutein av humant interleukin 2 (hil-2-mutein) som er nummerert tilsvarende hil-2-villtype og henholdsvis har en spesifikk aminosyresubstitusjon på minst en av posisjonene 20, 88 eller 126. Oppfinnerne har overraskende nok funnet ut at et slikt hil-2-mutein oppviser et stort terapeutisk potensial, noe som kan utnyttes ved behandling og profylakse av autoimmune sykdommer. Slik kunne de for eksempel med forskjellige eksperimentelle batcher demonstrere at hil-2-mutein selektivt induserer bindingen av regulatoriske T-celler som CD4 + CD2 + Foxp3 + og CD4 + CD2 - Foxp3 + i et levende vesen. 30 Overraskende nok viser det oppfinneriske hil-2-muteinet en tydelig høyere aktivitet på de regulatoriske T-cellene enn hil-2-villtype. Dette viser seg spesielt ved høye konsentrasjoner. 3 For det oppfinneriske hil-2-muteinet beskrives det i WO 99/60128 at det er sterkere til den trekjedede IL-2-reseptoren (IL-2Rαβγ) enn den tokjedede IL-2- reseptoren (IL-2Rβγ). Som oppfinnerne nå for første gang kunne vise, induserer det oppfinneriske hil-2-muteinet sammenlignet med hil-2-villtype overraskende nok, men like fullt forsterket, dannelse av slike regulatoriske T-celler som mang-

5 ler α-underenheten av IL-2-reseptoren (CD2) (CD4 + CD2 - Foxp3 + ). Denne underpopulasjonen bidrar i tillegg til å undertrykke aktiveringen av immunsystemet og dermed regulere immunsystemets selvtoleranse. Det oppfinneriske hil-2- muteinet oppviser dermed vesentlig høyere potens som virkestoff for behandling av autoimmune sykdommer enn hil-2-villtypen. I tillegg oppviser det oppfinneriske hil-2-muteinet sammenlignet med hil-2- villtypen den ekstra fordelen at det selektivt heller aktiverer T-celler enn naturlige dreperceller (NK-celler), og dermed viser en redusert toksisitetsprofil og en økt terapeutisk indeks. Det oppfinneriske hil-2-muteinet er dermed vesentlig mer tolerabelt enn hil-2-villtype; se WO 99/ I tillegg kunne det ved hjelp av de cytotoksiske CD3 + CD8 + CD4RO + -T-cellene for første gang vises at det oppfinneriske hil-2-muteinet i motsetning til hil-2- villtypen overraskende nok ikke har noen eller bare svært begrenset effekt på proliferasjonen av CD8-positive cytotoksiske T-celler som betegnes som "naïve, central memory, early differentiated" og "late differentiated" CD8-T-celler. I denne sammenhengen er dette en fordel fordi de CD8 + -cytotoksiske T-cellene gjøres ansvarlige for persistente kroniske betennelsesprosesser ved autoimmune sykdommer; se Liu et al. (2007), Multiple Sclerosis, 13, s. 149, og Haegeleet al. (2007), Neuroimmunol, 183, s. 168). Det oppfinneriske hil-2-muteinet forhindrer, sammenlignet med hil-2-villtype, dermed en videre forsterkning av denne betennelsesreaksjonen som forårsakes av CD8 + -T-celler, noe som utgjør enda en toleransefordel. Som oppfinnerne også kunne vise, stimulerer det oppfinneriske hil-2-muteinet dessuten immuncellenes antigenspesifikke aktivitet. Dette har den fordelen at sykdomsspesifikke immunceller stimuleres selektivt ved hjelp av hil-2-muteinet, og at den systemiske effekten av immunterapien dermed begrenses. Dermed forhindres det også at andre sykdommer induseres ved administrering av hil-2- mutein. 3 Videre kunne oppfinnerne ved hjelp av en musemodell for diabetes mellitus type 1 vise at utbruddet av en autoimmun sykdom kan forhindres gjennom behandling med det oppfinneriske hil-2-muteinet.

6 6 Dermed løses oppgaven som ligger til grunn for oppfinnelsen, fullstendig. Under "villtype" av humant interleukin 2 (hil-2-villtype) forstås ifølge oppfinnelsen et polypeptid eller protein som oppviser aminosyresekvensen av 133 aminosyrer som foreligger i nativt humant IL-2 (uten signalpeptid som består av videre 20 N-terminale aminosyrer). hil-2-villtype kan både være eksprimert nativt og rekombinant. hil-2-villtypens aminosyresekvens er beskrevet i Fujita et al. (1983), PNAS USA 80, s og da med og uten et ekstra N-terminalt metionin som nødvendigvis er til stede når proteinet i E. coli eksprimeres som intracellulær fraksjon. hil-2-villtypens aminosyresekvens er angitt i den vedlagte sekvensprotokollen under SEQ ID nr. 1. cdna-enes nukleotidsekvens som er kodet for hil-2, er angitt i den vedlagte sekvensprotokollen under SEQ ID nr Under "mutein" av humant interleukin 2 (hil-2-villtype) forstås ifølge oppfinnelsen et polypeptid eller protein som det sammenlignet med hil-2-villtype er gjort spesifikke substitusjoner på. Identifiseringen av posisjonene der det er foretatt substitusjoner, retter seg etter posisjonene av aminosyrene i hil-2-villtype som for eksempel kan sees i SEQ ID nr. 1. Ifølge dette befinner det seg et alanin (A) i posisjon 1, et prolin (P) i posisjon 2, et treonin (T) i posisjon 133 osv. Asparaginsyreresten (D) i posisjon 20 ("D20") kan for eksempel være substituert med en isoleucinrest (I) eller et histidin (H) slik at det dannes IL-2-muteiner som betegnes som hil-2-d20i eller hil-2-d20h. 2 Det kan selvsagt være slik at det oppfinneriske hil-2-muteinet kan være substituert i flere enn de nevnte posisjonene 20, 88 og 126, slik at det oppstår kombinasjonsmutanter som er spesielt egnet til behandling av en autoimmun sykdom eller for induksjon av regulatoriske T-celler. 30 Ifølge oppfinnelsen omfatter et hil-2-mutein også et modifisert polypeptid, for eksempel et glykosylert hil-2-mutein. Glykosylerte hil-2-muteiner er for ek- sempel beskrevet i US-patentsøknadene 09/3,026 og /01,67. 3 Med et "avsnitt" av hil-2-mutein menes et polypeptid der det sammenlignet med hil-2-mutein N- og/eller C-terminalt mangler en eller flere aminosyrer, men der det likevel fortsatt er tilstrekkelig biologisk hil-2-mutein-aktivitet for at det ifølge oppfinnelsen skal kunne brukes til behandling og/eller profylakse.

7 7 Denne aktiviteten regnes som tilstrekkelig dersom avsnittet oppviser minst 0 %, foretrukket minst 60 %, ytterligere foretrukket minst 70 %, ytterligere foretrukket minst 80 %, ytterligere foretrukket minst 90 % mest foretrukket minst 9 % av hil-2-muteinets aktivitet for induksjon av regulatoriske T-celler. hil-2-muteinets aktivitet kan enkelt måles ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. En slik fremgangsmåte er for eksempel presentert i WO 99/60128, derværende eksempel 3 til. Ved substitusjonene i de nevnte posisjonene dreier det seg ikke om konservative substitusjoner der en aminosyre byttes ut med en annen med lignende biokje- miske egenskaper Ved substitusjonen i posisjon 20 dreier det seg ikke om en substitusjon der asparaginsyre (D) byttes ut med en glutaminsyre (E). Ved substitusjonen i posisjon 88 dreier det seg ikke om en substitusjon der asparagin (N) er byttet ut mot et alanin (A), prolin (P), glysin (G), glutamin (Q), serin (S) eller treonin (T). Videre dreier det seg ved substitusjonen i posisjon 126 ikke om en substitusjon der glutamin (Q) er byttet ut mot et alanin (A), prolin (P), glysin (G), asparagin (N), serin (S) eller treonin (T). Disse substitusjonene ville ikke eller bare i uvesentlig grad endre hil-2-villtypens biologiske aktivitet I de nevnte posisjonene er det ikke foretatt substitusjoner som tilfører steder for intermolekylære tverrbindinger eller ukorrekte disulfidbroforbindelser. Derfor dreier det seg ved substitusjon av oppfinnerisk hil-2-mutein i posisjon 20 ikke om en substitusjon der asparaginsyre (D) er byttet ut med arginin (R), asparagin (N), asparaginsyre (D), cystein (C), glutaminsyre (E), glysin (G), leucin (L), lysin (K), fenylalanin (F), prolin (P), treonin (T) eller tryptofan (W). Ved substitusjonen i posisjon 88 dreier det seg ikke om en substitusjon der asparagin (N) er byttet ut mot asparaginsyre (D), cystein (C), glutamin (Q), tryptofan (W) eller prolin (P). Ved substitusjonen i posisjon 126 dreier det seg ikke om en substitusjon der glutamin (Q) er byttet ut mot et alanin (A), histidin (H), tryptofan (W), cystein (C), glutamin (Q), glutaminsyre (E) eller lysin (K). 3 Det oppfinneriske hil-2-muteinet kan fremstilles etter alle egnede metoder innenfor kjent teknikk. Slike metoder omfatter konstruering av en DNA-sekvens som er kodet for oppfinnelsens oppfinneriske IL-2-mutein og for eksempel om-

8 8 fatter nukleotidsekvensen SEQ ID nr. 2 og denne sekvensens eksprimering i en egnet vert. Denne metoden fører til de oppfinneriske muteinene i rekombinant form. Det oppfinneriske muteinet kan selvsagt også fremstilles gjennom kjemisk syntese eller en kombinasjon av kjemisk syntese og rekombinant DNA-teknologi. Fremstillingen av det oppfinneriske muteinet er utførlig beskrevet i WO 99/60128, derværende utførelseseksempler 1 og 2. Et av de spesifikke oppfinneriske hil-2-muteinene der det i posisjon 88 er byttet ut asparagin (N) mot et arginin (R) (hil-2-n88r), er tilgjengelig for fagmannen under betegnelsen BAY0-4798, se Shanafelt et al. (2000), A T-cell-selective interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo, Nat. Biotechnol. Vol. 18, s hil-2-n88rs aminosyresekvens er angitt i den vedlagte sekvensprotokollen under SEQ ID nr Oppfinnernes funn var spesielt overraskende fordi det ikke er mulig å finne noen referanser til en tilsvarende aktivitet hos IL-2-mutein innenfor kjent teknikk. 20 Dermed beskrives det i WO 99/60128 for mutein hil-2-n88r at dette kan aktivere T-celler selektivt heller enn naturlige dreperceller og er i stand til å redusere metastasedannelsen i lungen. I WO 02/00243 beskrives en stabil, histidinnholdig, albuminfri formulering for mutein hil-2-n88r. 2 I US 2002/ beskrives en glykosylert variant av mutein hil-2-n88r. 30 Bruken av det oppfinneriske hil-2-muteinet til målrettet behandling og/eller profylakse av autoimmune sykdommer eller til selektiv aktivering av regulatoriske T-celler i et levende vesen blir verken beskrevet eller sannsynliggjort i kjent teknikk. Selv for humant villtype-il-2 foreligger det ikke tilsvarende funn. 3 Van der Vliet et al. (2007), Effects of the administration of high-dose interleukin- 2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cancer, Clin. Cancer Res. Vol. 13, s , beskriver at den tera-

9 9 peutiske effekten av IL-2 ved behandling av tumorer blir redusert ved administrering av høye doser av dette. Ahmadzadeh og Rosenberg (2006), IL-2 administration increases CD4 + CD2h1Foxp3 + regulatory T cells in cancer patients, Blood, Vol. 7, s , foreslår å forbedre den terapeutiske effekten av humant villtype-il- 2 i tumorpasienter ved at pasientenes regulatoriske T-celler elimineres. Denne tilnærmingsmåten viste seg imidlertid ikke å være lovende, se Powell et al. (2007), Inability to mediate prolonged reduction of regulatory T cells after transfer of autologous CD2-depleted PBMC and interleukin-2 after lymphodepleting chemotherapy, J. Immunother. Vol. 30, s Antony and Restifo (200), CD4 + CD2 + T regulatory cells, immunotherapy of cancer, and interleukin-2, J. Immunother. Vol. 28, s , avviser mer eller mindre IL-2 som immunterapeutikum og beskriver til og med at administrasjon av IL-2 kan indusere autoimmunitet. 20 I samme retning går Knoechel et al. (200), Sequential development of interleukin 2-dependent effector and regulatory T cells in response to endogenous systemic antigen, JEM Vol. 202, s og foreslår til og med en IL-2- antagonisme, det vil si en hemming av IL-2-mekanismer for å behandle den tidlige fasen av autoimmune sykdommer. 2 Innen kjent teknikk finnes det derfor ingen holdepunkter som sannsynliggjør den oppfinneriske løsningen. 30 Derfor har oppfinnerne også erkjent at de terapeutiske effektene av hil-2- mutein kan være forskjellige alt etter indikasjon og anvendt konsentrasjon. En høy konsentrasjon av hil-2 kan være fordelaktig ved behandling av autoimmune sykdommer, men kontraindikert i terapi av tumorsykdommer. 3 Ved den oppfinneriske anvendelsen er det ved substitusjonen i posisjon 88 byttet ut et asparagin mot et arginin (hil-2-n88r) eller mot et glysin (hil-2-n88g), eller mot et isoleucin (hil-2-n88i), og/eller ved substitusjonen i posisjon 20 byttet ut en asparaginsyre mot et histidin (hil-2-d20h), eller mot et isoleucin (hil-

10 2-D20I), eller mot et tyrosin (hil-2-d20y), eller ved substitusjonen i posisjon 126 byttet ut et glutamin mot et leucin (hil-2-q126l). Dette tiltaket har den fordelen at det brukes et oppfinnerisk hil-2-mutein som utmerker seg ved at det ekstra selektivt heller aktiverer T-celler enn naturlige dreperceller og derfor oppviser et høyt terapeutisk potensial og lav toksisitet. De foretrukne oppfinneriske hil-2-muteinenes egenskaper beskrives i WO 99/ Ifølge oppfinnelsen er det å foretrekke at hil-2-muteinet oppviser minst en ekstra aminosyresubstitusjon i en valgfri posisjon, unntatt posisjonene 20, 88 eller 126, slik at hil-2-muteinet som er substituert videre på denne måten, oppviser en aminosyresekvens som er minst 80 %, foretrukket 8 %, ytterligere foretrukket 90 %, ytterligere foretrukket 9 % og mest foretrukket 99 % identisk med hil-2-muteinets aminosyresekvens som sammenlignet med hil-2-villtypen ikke er videre substituert unntatt ved minst en av posisjonene 20, 88 eller Dette tiltaket har den fordelen at det tilveiebringes alternative primærstrukturer som eventuelt er enklere å syntetisere enn hil-2-mutein som bortsett fra i minst en av posisjonene 20, 88 eller 126 tilsvarer hil-2-villtypen. For å få et polypeptid med samme biologiske aktivitet som hil-2-mutein og dermed et legemiddel for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom, er det ikke tvingende nødvendig å tilveiebringe et polypeptid som oppviser en aminosyresekvens som er 0 % identisk med aminosyresekvensen i det oppfinneriske hil2- muteinet. Det er helt tilstrekkelig dersom det er gitt høy identitet hvorved eventuelle moderate aktivitetsreduksjoner er tolerable, fortrinnsvis bør imidlertid 0 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 9 % eller 99 % av aktiviteten være bibeholdt. De angitte identitetene tar utgangspunkt i et avsnitt av det oppfinneriske hil-2- muteinet med aminosyrer. Graden av homologi kan enkelt fastsettes ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen, for eksempel en BLASTanalyse eller ved hjelp av MegAlign-modulen i Lasergene-Programmet fra DNAStar Inc. 3 Ifølge oppfinnelsen er det i tillegg å foretrekke at det ved den videre aminosyresubstitusjonen i en valgfri posisjon bortsett fra posisjon 20, 88 eller 126 dreier seg om en konservativ aminosyresubstitusjon.

11 11 Dette tiltaket har den fordelen at det tilveiebringes flere varianter av det oppfinneriske hil-2-muteinet som oppviser en tilstrekkelig høy aktivitet for behandling og/eller profylakse av autoimmune sykdommer eller for induksjon av regulatoriske T-celler i et levende vesen. Det er kjent for fagmannen at konservative substitusjoner ikke har noen eller bare har en minimal effekt på muteinets sekundær- eller tertiærstruktur. Slike konservative substitusjoner omfatter dem som er beskrevet av Dayhoff i "The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. ", Natl Biomedical Research. For eksempel kan aminosyrer som hører til en av følgende grupper, byttes ut mot hverandre, det vil si at de danner en konservativ utveksling: 1 alanin (A), prolin (P), glycin (G), asparagin (N), serin (S), treonin (T); cystein (C), serin (S), tyrosin (Y), treonin (T); valin (V), isoleucin (I), leucin (L), metionin (M), alanin (A), fenylalanin (F); lysin (K), arginin (R), histidin (H); fenylalanin (F), tyrosin (Y), tryptofan (W), histidin (H); og asparaginsyre (D), glutaminsyre (E). 20 Ved middelet for induksjon av dannelse av regulatoriske T-celler i et levende vesen dreier det seg fortrinnsvis om et legemiddel som oppviser en farmasøytisk akseptabel bærer. 2 Dette tiltaket har den fordelen at middelet allerede tilveiebringes i en form som muliggjør en direkte applikasjon i det levende vesenet, fortrinnsvis et menneske Farmasøytisk akseptable bærere er omfattende beskrevet i kjent teknikk; se Row et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients,. opplag, Pharmaceutical Press and American Pharmasists' Association; Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbh Stuttgart. En spesielt foretrukket formulering er den som er beskrevet i WO 02/ Denne formuleringen er albuminfri og stabiliseringen av hil-2- muteinet eller avsnitt av dette skjer ved hjelp av histidin. Fortrinnsvis oppviser det ferdige legemiddelet følgende bestanddeler i følgende konsentrasjoner: hil- 2-mutein eller et avsnitt av dette = 0,1 mg/ml; histidin = 0,08 1,6 vektpro-

12 12 sent; NaCl = 0 0,9 vektprosent, sakkarose = 1 vektprosent; glycin = 0 0,3 vektprosent, og oppviser en ph-verdi på ca. til 6,. I en spesiell utførelsesform oppviser legemiddelet i tillegg et immunsuppressivum. Legemiddelet kan ved behandling og/eller profylakse av autoimmune sykdommer på grunn av det oppfinneriske hil-2-muteinets spesielt sterke potens allerede brukes som monopreparat. Et slikt monopreparat oppviser det oppfinneriske hil-2-muteinet som eneste virkestoff. Farmasøytisk akseptable bærere, løsemidler (buffere, vann osv.), hjelpestoffer osv. regnes ikke som virkestoffer i denne sammenhengen. 1 Dette tiltaket har den fordelen at det oppfinneriske legemiddelets terapeutiske indeks økes ytterlige ved tilførsel av et klassisk immunsuppressivum. 20 Det er å foretrekke at immunsuppressivet er valgt fra gruppen som består av glukokortikoid, inkludert decortin, prednisol; azatioprin; cyklosporin A; mykofenolatmofetil; takrolimus; anti-t-lymfocyttglobulin, anti-cd3-antistoffer, inkludert muromonab; anti-cd2-antistoffer, inkludert basiliksimab og daclizumab; anti- TNF-α-antistoffer, inkludert infliksimab og adalimumab; azatioprin; metotreksat; ciklosporin; sirolimus; everolimus; fingolimod; CellCept; Myfortic; cyklofosfamid. 2 Dette tiltaket har den fordelen at det brukes et immunsuppressivum som oppviser dokumenterbar terapeutisk effekt ved autoimmune sykdommer og innen kjent teknikk står til disposisjon i tilstrekkelig omfang Videre er det å foretrekke at den autoimmune sykdommen er valgt fra gruppen som består av: diabetes-mellitus type I, reumatoid artritt, multippel sklerose, kronisk gastritt, morbus Crohn, morbus Basedow, morbus Bechterew, psoriasis, myasteni gravis, autoimmun hepatitt, APECED, Chrug-Strauss-syndrom, ulcerøs kolitt, glomerulonefritt, Guillain Barré-syndrom, Hashimoto-thyreoditt, lichen sclerolus, systemisk lupus erythematosus, PANDAS, revmatisk feber, sarkoidose, Sjögrens syndrom, stiff-man-syndrom, sklerodermi, wegeners granulomatose, vitilogo, autoimmun enteropati, Goodpastures syndrom, dermatomyositt, poly-

13 13 myositt, autoimmun allergi, astma og autoimmun reaksjon etter organtransplantasjoner. Dette tiltaket har den fordelen at det tilveiebringes et slikt legemiddel som kan brukes til behandling og/eller profylakse av de viktigste autoimmune sykdom- mene. En ytterligere gjenstand for den foreliggende oppfinnelsen er et legemiddel som oppviser det oppfinneriske hil-2-muteinet og som brukes til behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom. 1 Egenskapene og fordelene samt definisjonene som er beskrevet i sammenheng med den oppfinneriske bruken, gjelder i samme grad for det oppfinneriske legemiddelet. I tillegg beskrives et middel for dannelse av regulatoriske T-celler (T Reg ) i et levende vesen som oppviser det oppfinneriske hil-2-muteinet eller et avsnitt av dette. 20 Fordelene ved og egenskapene av samt definisjonene av den oppfinneriske bru- ken gjelder tilsvarende for det oppfinneriske middelet Det beskrives også fremgangsmåter for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom i et levende vesen og for danning av regulatoriske T-celler (T Reg ) i et levende vesen, der fremgangsmåtene oppviser følgende trinn: (a) tilveiebringing av et humant interleukin 2 (hil-2-mutein) eller et avsnitt av dette, (b) administrering av hil-2-muteinet eller avsnittet av dette i et levende vesen, og (c) eventuell gjentakelse av trinn (a) og (b) hvorved det ved hil-2-muteinet eller avsnittet av dette dreier seg om det oppfinneriske hil-2-muteinet eller et avsnitt av dette. Ved det levende vesenet dreier det seg fortrinnsvis om et pattedyr, ytterligere foretrukket er et menneskelig vesen. 3 Egenskapene og fordelene samt definisjonene som er beskrevet i forbindelse med den oppfinneriske bruken, gjelder i samme grad for de ovennevnte frem-

14 14 gangsmåtene for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom i et levende vesen og for dannelse av regulatoriske T-celler (T Reg ) i et levende vesen. Det beskrives også en fremgangsmåte for dannelse av regulatoriske T-celler (T Reg ) in vitro, der fremgangsmåten oppviser følgende trinn: (a) tilveiebringing av et humant interleukin -2 (hil-2-mutein) eller et avsnitt av dette, (b) etablering av kontakt mellom hil-2-muteinet eller avsnittet av dette og perifere mononukleære blodceller (PBMC-er) og (c) eventuell gjentakelse av trinn (a) og (b) hvorved det ved hil-2-muteinet eller avsnittet av dette dreier seg om det oppfinneriske hil-2-muteinet eller et avsnitt av dette. Etablering av kontakt mellom hil-2 eller avsnitt av dette med PBMC-er kan skje i alle egnede medier for kultivering av PBMC-er. 1 Egenskapene og fordelene samt definisjonene som er beskrevet i sammenheng med den oppfinneriske bruken, gjelder i samme grad for ovennevnte fremgangsmåte for danning av regulatoriske T-celler (T Reg ) in vitro Det beskrives også en fremgangsmåte for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom i et levende vesen som oppviser følgende trinn: (a) tilveiebringing av et humant interleukin -2 (hil-2-mutein) eller et avsnitt av dette, (b) etablering av kontakt mellom hil-2-muteinet eller avsnittet av dette og perifere mononukleære blodceller (PBMC-er) som stammer fra et første levende vesen, (c) inkubasjon av hil-2-mutein eller avsnittet av dette med PBMC-ene for å få en cellepopulasjon som oppviser regulatoriske T-celler (T Reg ), og (d) tilførsel av cellepopulasjonen i et annet levende vesen hvorved det ved hil-2-muteinet eller avsnittet av dette dreier seg om det oppfinneriske hil-2-muteinet eller et avsnitt av dette. 30 Det første og det andre levende vesenet oppviser fortrinnsvis samme blodgruppe hvorved det spesielt er å foretrekke at det første og det andre levende vesenet er identiske levende vesener eller individer. 3 I denne sammenhengen er det en fordel at det ved tilførsel eller reinfusjon av cellepopulasjonen ikke oppstår uønskede immunreaksjoner mot cellene, og at fremgangsmåten derfor har spesielt få bivirkninger.

15 1 Egenskapene og fordelene samt definisjonene som er beskrevet i sammenheng med den oppfinneriske bruken, gjelder i samme grad for ovennevnte fremgangsmåte for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom i et levende vesen. Nedenfor forklares oppfinnelsen nærmere ved hjelp av utførelseseksempler som har en rent eksemplarisk karakter og ikke begrenser rekkevidden av oppfinnelsen. I denne forbindelsen tas det utgangspunkt i de vedlagte figurene, der følgende illustreres: Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. Fig. 6 Fig. 7 viser at hil-2-n88r i friske forsøkspersoner ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 + Foxp3 + -T-celler; viser at hil-2-n88r i friske forsøkspersoner ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 - Foxp3 + -T-celler; viser at hil-2-n88r i melanompasienter ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 + Foxp3 + -T-celler; viser at hil-2-n88r i melanompasienter ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 - Foxp3 + -T-celler; viser at hil-2-n88r i multippel sklerose-pasienter ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 + Foxp3 + -T-celler; viser at hil-2-n88r i multippel sklerose-pasienter ved samme eller lavere dosering sammenlignet med proleukin induserer en kraftigere økning i regulatoriske CD4 + CD2 - Foxp3 + -T-celler;

16 16 1 viser at hil-2-n88r i multippel sklerose-pasienter ved samme eller høyere dosering sammenlignet med proleukin induserer en svakere økning i cytotoksiske CFSElow/CD3 + CD8 + CD4RO + -T-celler; Fig. 8 viser at hil-2-n88r i friske forsøkspersoner ved samme eller høyere dosering sammenlignet med proleukin induserer en svakere økning i cytotoksiske CFSElow/CD3 + CD8 + CD4RO + -T-celler; Fig. 9 viser at hil-2-n88r i mus-diabetes-type-i-modellen sammenlignet med hil-2-villtype fører til en prosentvis høyere økning av FoxP3 + -celler innenfor CD4 + -cellene (A). Disse CD4 + FoxP3 + -cellene oppviser dessuten en høyere ekspresjon av CD2 (B). Fig. viser at hil-2-n88r i mus-diabetes-type-i-modellen i motsetning til hil- 2-villtype forhindrer utviklingen av diabetes (A) Utførelseseksempler 1. Materiale og metoder Utskilling av PBMC-er fra fullblod til bruk in vitro 2 30 Perifere mononukleære blodceller (PBMC-er) fra friske forsøkspersoner, melanom- eller MS-pasienter skilles fra blodet ved hjelp av et lymfocyttseparasjonsmedium (Histopaque, Sigma Aldrich). Til dette formålet overføres to rør blod (7 eller ml) fra samme forsøksperson eller pasient til et sterilt 0 ml-rør og fylles opp med RPMI 1640 (InVitrogen, # ) til 30 ml. Deretter legges 30 ml av det fortynnede blodet over 1 ml av en tetthetsgradientløsning (tetthet = 1,077; Histopaque, Sigma Aldrich, # 771). Etter en sentrifugering på 400 g i 40 min ved 20 C uten bruk av brems, høstes to "ringer av hvite blodceller" og overføres til et sterilt 0 ml-rør og vaskes to

17 17 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS; InVitrogen # ). Ved kontaminasjon med røde blodceller gjennomføres en RBC-lyse ("red blood cells"); 2 ml RBC-lyseløsning tilsettes cellepelleten, under varsom blanding ved romtemperatur skjer en inkubasjon i 2 min etterfulgt av en vaskeprosess med et stort volum komplett medium (RPMI 1640 med % føtalt kalveserum). Antallet levende leukocytter fastsettes ved hjelp av eksklusjonsfarging med trypanblått (InVitrogen # ) og et hemocytometer (FisherBioblock A279B). 1.2 CFSE-merking 1 Etter tellingen vaskes cellene to ganger i PBS og resuspenderes ved en konsentrasjon av 1 x 6 celler/ml i PBS. CFSE (InVitrogen # C117) tilsettes i en sluttkonsentrasjon på 0, µm. Etter minutters inkubasjon i mørke ved 37 C vaskes de CFSE-merkede cellene tre ganger med ferskt komplett medium ved 4 C og resuspenderes ved en konsentrasjon på 1 x 6 celler/ml i komplett medium for plassering på næringsmedium. 1.3 Stimulering av PBMC-er in vitro 20 2 PCMB-ene forblir enten ustimulert eller stimuleres med hil-2-villtype (proleukin) eller hil-2-n88r (BAY ; Charge #PR312C008) med eller uten en pool av syntetiske peptider som avledes av de melanomspesifikke proteinene gp0, TRP-2, MART-1 og tyrosinase, eventuelt av det multippel sklerose (MS)- spesifikke proteinet MOG hvorved hvert peptid tilsettes i en sluttkonsentrasjon på 2, µm (melanompeptider) eller 30 µg/ml (MS-peptid). Stimulator og peptid tilsettes ved de følgende 23 betingelsene: 30 Tabell 1: Betingelser for stimulering av PBMC-er

18 18 Betingelse Stimulator Sluttkonsentrasjon 1 hil-2-n88r -11 M ingen peptider (BAY ; #PR312C008) 2 hil-2-n88r -11 M peptider (BAY ; #PR312C008) 3 hil-2-n88r -9 M ingen peptider (BAY ; #PR312C008) 4 hil-2-n88r -9 M peptider (BAY ; #PR312C008) hil-2-n88r -8 M ingen peptider (BAY ; #PR312C008) 6 hil-2-n88r -8 M peptider (BAY ; #PR312C008) 7 hil-2-n88r -7 M ingen peptider (BAY ; #PR312C008) 8 hil-2-n88r -7 M peptider (BAY ; #PR312C008)

19 19 9 hil-2-n88r -6 M ingen peptider (BAY ; #PR312C008) hil-2-n88r -6 M peptider (BAY ; #PR312C008) 11 hil-2-villtype -11 M ingen peptider (proleukin) 12 hil-2-villtype -11 M peptider (proleukin) 13 hil-2-villtype -9 M ingen peptider (proleukin) 14 hil-2-villtype -9 M peptider (proleukin) 1 hil-2-villtype -8 M ingen peptider (proleukin) 16 hil-2-villtype -8 M peptider (proleukin) 17 hil-2-villtype -7 M ingen peptider (proleukin) 18 hil-2-villtype -7 M peptider (proleukin) 19 hil-2-villtype -6 M ingen peptider (proleukin)

20 20 20 hil-2-villtype -6 M peptider (proleukin) 21 PHA µg/ml 22 ustim. 23 bare peptid peptider Deretter ble cellene kultivert i seks dager ved 37 C og en atmosfære med % CO 2 -innhold. Proliferasjonsassay og fenotypisering på FC00-væskestrømcytometer Fargingen av cellene med fluorescensmerkede antistoffer på celleoverflatemolekyler muliggjør undersøkelse av proliferasjonen av en spesifikk undergruppe av lymfocytter (memory- og aktiveringsmarkører, se tab. 2). Immunfargingen med fluorkrommerkede (PE: fykoerytrin, ECD: PE-Texas Red, APC: allofykocyanin, PC7: PE-Cy7) antistoffer skjer før og etter seks dagers kultivering med stimulatorene. 1 Den sjette dagen blir de to første fargingene (1 og 1iso) med ikke-cfse- merkede celler gjennomført (CFSE: karboksyfluoresceindiacetatsuccinimidylester), de andre fargingene skjer på CFSE-merkede celler. 20 Tabell 2: Fargeskjema for PBMCS PE ECD APC PC7 1 CD2 CD4 Foxp3 CD4 1iso CD2 CD4 rotte-igg2a CD4 2 CD127 CD4 CD2 CD4 3 CD3 CD4 CD2 CD8 4 CD16 CD6 CD3

21 21 PE ECD APC PC7 CCR7 CD3 CD4RA CD4 6 CCR7 CD3 CD4RA CD8 7 CD8 CD3 CD4RO CD4 PE ECD APC PC7 1 CD2 CD3 Foxp33 CD4 1iso CD2 CD3 rotte-igg2a CD4 2 CD8 CD3 CD2 CD4 3 CCR7 CD3 CD4RA CD4 4 CD8 CD3 CD4RO CD4 CD2-PE, Foxp3-APC og rotte-igg2a-apc stammer fra ebiosciences; CD2-APC, CD4RA-APC og CD4RO-APC ble anskaffet fra BD Biosciences. Samtlige andre antistoffer stammer fra Beckman-Coulter, Frankrike. 1. Mus-diabetes-type-I-modell uker gamle NOD-mus ("non-obese diabetes") behandles daglig med hil-2- mutein eller hil-2-villtype. Negativ-kontrolldyr ble behandlet analogt med fysiologisk saltløsning (saltvann). Behandlingsgruppene bestod av 3 dyr. På dag 0 til 1 fikk musene applisert en mengde på K- eller 2K-enheter hil-2-mutein eller hil-villtype. Fra og med dag 17 skjedde en økning til 0K-enheter (= 6,112 µg) i behandlingsgruppene med K-enheter. Behandlingen av de andre dyrene med 2K-enheter ble beholdt uten forandringer. Den siste doseringen ble foretatt på dag 31. I et parallelt eksperiment ble det behandlet med en fast dose på 2K-enheter fra dag 0 til dag 31. Diabetes ble påvist ved hjelp av monitorering av glukosenivåer i urinen. Det ble tatt blodprøver av musene på dag 17 og dag 30. Prøvene ble analysert i FACS ved hjelp av anti-cd4-, anti-cd2- og anti- FoxP3-farging, og dermed ble prosentandelen av FoxP3 + -celler blant CD4 + -Tcellene samt den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten (MFI) av CD2- ekspresjonen på CD4 + FoxP3 + -celler fastslått.

22 22 2. Resultater 2.1 Induksjon av regulatoriske T-celler ved hjelp av hil-2-n88r Som egnet in-vivo-system for å teste effekten av de oppfinneriske muteinene, ble det brukt perifere mononukleære blodceller (PBMC-er). PBMC-er består av T- celler (~ 7 % CD4- og CD8-positive) og B- og NK-celler (~ 28 % positive) og danner dermed en cellepopulasjon som representerer immunsystemet godt. 1 PCMB-er fra seks friske forsøkspersoner ( 6 celler/ml) ble stimulert med villtype IL-2 (proleukin) eller IL-2-N88R [BAY , Charge #PR312C008 ("BAY#C008")] ved konsentrasjoner som lå mellom -11 og -6 M eller i positivkontrollen med det uspesifikke mitogenet fytohemagglutinin ("PHA") ved en konsentrasjon på µg/ml eller med bare kulturmedium ("med") På dag 0 og sjette dag etter stimuleringen ble andelen regulatoriske CD4 + CD2 + Foxp3 + -Tceller innenfor CD3 + -lymfocyttene fastslått. Resultatet er presentert i fig. 1 og etterfølgende tabell 3.

23 23 Av dette eksperimentet går det frem at hil-2-n88r fører til en tydelig induksjon i subpopulasjonen av de regulatoriske T-cellene ved konsentrasjoner på -7 M og -6 M. Induksjonen er derved tydelig større enn ved en stimulering av PBMCer ved hjelp av hil-2-villtype. I en annen batch ble økningen i subpopulasjonen av regulatoriske T-celler CD4 + CD2 - Foxp3 + undersøkt etter stimulering med hil-2-n88r sammenlignet med hil-2-villtype. Resultatet er presentert i fig. 2, eventuelt etterfølgende tabell 4.

24 24 Også her viser det seg at stimulering med hil-2-n88r fører til en tydelig økning i subpopulasjonen av regulatoriske T-celler CD4 + CD2 - Foxp3 +, ved konsentrasjoner på -6 M er økningen tydelig større enn ved en stimulering med hil-2-villtype. 2.2 hil-2-n88r induserer regulatoriske T-celler i melanompasienter 1 I neste trinn ble det undersøkt om det oppfinneriske hil-2-muteinet N88R også stimulerer immuncellers antigenspesifikke aktivitet. Til dette formålet ble PCMBer ( 6 celler/ml) fra tre melanompasienter stimulert med hil-2-n88r (BAY , Charge #PR312C008) eller hil-2-villtype (proleukin) ved konsentrasjoner som lå mellom -11 og -6 M ved tilstedeværelse eller fravær av en melanomassosiert peptidpool med µg/ml PHA eller med bare kulturmedium. Deretter ble subpopulasjonene av de regulatoriske T-cellene CD4 + CD2 + Foxp3 + hhv. CD4 + CD2 - Foxp3 + fastslått. Resultatet er presentert i fig. 3 og tabell, eventuelt fig. 4 og tabell 6.

25 2

26 26 Derved viste det seg at administrasjonen av hil2-88r også i melanompasienter fører til en tydelig økning i regulatoriske T-celler. Denne er i tilfellet av subpopulasjonen CD4 + CD2 + Foxp3 + ved konsentrasjon på -7 M og -6 M, og ved subpopulasjon CD4 + CD2 - Foxp3 + ved en konsentrasjon på -6 M tydelig større enn ved en stimulering med tilsvarende konsentrasjoner av villtype-il-2 (proleukin). 2.3 hil-2-n88r induserer regulatoriske T-celler i pasienter med multippel sklerose

27 27 I neste trinn ble det undersøkt om det oppfinneriske hil-2-muteinet N88R også stimulerer immuncellers antigenspesifikke aktivitet. Til dette formålet ble PCMBer ( 6 celler/ml) fra to pasienter med multippel sklerose stimulert med hil-2- N88R (BAY , Charge #PR312C008) eller hil-2-villtype (proleukin) ved konsentrasjoner som lå mellom -11 og -6 M ved tilstedeværelse eller fravær av et multippel sklerose-assosiert peptid med µg/ml PHA eller med bare kulturmedium. Deretter ble subpopulasjonene av de regulatoriske T-cellene CD4 + CD2 + Foxp3 + hhv. CD4 + CD2 - Foxp3 + fastslått. Resultatet er presentert i fig. og tabell 7, eventuelt fig. 6 og tabell 8.

28 28

29 29 Det viste seg at administrasjonen av hil2-88r også i multippel sklerosepasienter fører til en tydelig økning i regulatoriske T-celler. Denne er i tilfellet av subpopulasjonen CD4 + CD2 + Foxp3 + ved konsentrasjon på -8 M og -7 M, og ved subpopulasjon CD4 + CD2 - Foxp3 + ved en konsentrasjon på -6 M tydelig større enn ved en stimulering med tilsvarende konsentrasjoner av villtype-il-2 (proleukin).

30 hil-2-n88r induserer bare minimal proliferasjon av cytotoksiske CD8 + -T-celler i pasienter med multippel sklerose og i friske forsøkspersoner Videre ble stimuleringen av cytotoksiske CD8 + central memory T-celler undersøkt. Til dette formålet ble PBMC-er fra friske forsøkspersoner eller multippel sklerose-pasienter som beskrevet under 2.3, behandlet. Prosentandelen CFSElow/CD3 + CD8 + CD4RO + -T-celler ble analysert. Resultatet er presentert i fig. 7 og tabell 9, samt fig. 8 og tabell.

31 31

32 32 hil-2-88-r fører i multippel sklerose-pasienter og i friske forsøkspersoner sammenlignet med hil-2-villtype bare til en begrenset proliferasjon av central me- mory CD8 + T-celler, og dette gjelder alle undersøkte konsentrasjoner.

33 33 2. Behandling med hil-2-mutein forhindrer utvikling av diabetes type I i dyremodellen Behandling av NOD-mus med hil-2-n88r fører sammenlignet med hil-2-villtype til en prosentvis høyere økning av FoxP3 + -celler innenfor CD4 + -cellene (fig. 9(A)). Disse CD4 + FoxP3 + positive cellene oppviser dessuten en høyere ekspresjon av CD2 (fig. 9(B)). Fig. viser at hil-2-n88r-behandling i musdiabetes-type-i-modellen i motsetning til hil-2-villtype forhindrer utviklingen av diabetes i alle musene. 3. Konklusjon: 1 Eksperimentene som oppfinnerne har gjennomført, tydeliggjør at det hos de oppfinneriske hil-2-muteinene og avsnittene av disse på grunn av potensialet de har til induksjon av regulatoriske T-celler (T Reg ) dreier seg om substanser som er egnet for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom, eventuelt til induksjon av T Reg i et levende vesen samt til dannelse av T Reg in vitro. Oppfinnerne viser dette ikke bare in vitro men også in vivo.

34 34 Sekvensprotokoll <1> AiCuris GmbH & Co. KG Wuppertal, Deutschland <120> Mittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Autoimmunerkrankung und zur Bildung von Regulatorischen T-Zellen <130> 43P8 <160> 3 <170> PatentIn ver. 2.0 <2> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 1

35 3 <2> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 <2> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz <220> MUTAGEN

36 36 <223> hil-2-n88r <400> 3

37 37 P a t e n t k r a v 1. Anvendelse av et mutein av humant interleukin-2 (hil-2-mutein) som er nummerert tilsvarende hil-2-villtype og har en aminosyresubstitusjon på minst en av posisjonene 20, 88 eller 126 for fremstilling av et legemiddel for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom, karakterisert ved at - det gjennom substitusjonen i posisjon 88 er byttet ut et asparagin med et arginin (hil-2-n88r) eller med et glysin (hil_2-n88g) eller med et isoleucin (hil-2-n881), - det gjennom substitusjonen i posisjon 20 er byttet ut en asparagin syre med et histidin (hil-2-d201-1) eller med et isoleucin (hil-2- D201) eller med et tyrosin (hil-2-d20y) og 1 - det gjennom substitusjonen i posisjon 126 er byttet ut et glutamin med et leucin (hil-2-q126l). 2. Anvendelse ifølge krav 1, karakterisert ved at legemiddelet i tillegg oppviser et immunsuppressivum Anvendelse ifølge krav 2, karakterisert ved at immunsuppressivet er valgt fra gruppen som består av: glukokortikoid, inkludert decortin, prednisol; azatioprin; cyklosporin A; mykofenolatmofetil; takrolimus; anti-t-lymfosyttglobulin, anti- CD3-antistoffer, inkludert muromonab; anti-cd2-antistoffer, inkludert basiliksimab og daclizumab; anti-tnf-α-antistoffer, inkludert infliksimab og adalimumab; azatioprin; metotreksat; ciklosporin; sirolimus; everolimus; fingolimod; CellCept; Myfortic; cyklofosfamid. 4. Anvendelse ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at den autoimmune sykdommen er valgt fra gruppen som består av: 30 diabetes-mellitus type I, reumatoid artritt, multippel sklerose, kronisk gastritt, morbus Crohn, morbus Basedow, morbus Bechterew, psoriasis,

38 38 myasteni gravis, autoimmun hepatitt, APECED, Chrug-Strauss-syndrom, ulcerøs kolitt, glomerulonefritt, Guillain Barré-syndrom, Hashimototyreoditt, lichen sclerolus, systemisk lupus erythematosus, PANDAS, revmatisk feber, sarkoidose, Sjögrens syndrom, stiff-man-syndrom, sklerodermi, wegeners granulomatose, vitilogo, autoimmun enteropati, Goodpastures syndrom, dermatomyositt, polymyositt, autoimmun allergi, astma og autoimmun reaksjon etter organtransplantasjoner.. Anvendelse i henhold til et av de foregående kravene, karakterisert ved at legemiddelet i tillegg oppviser en farmasøytisk akseptabel bærer Legemiddel for behandling og/eller profylakse av en autoimmun sykdom, karakterisert ved at det oppviser hil-2-muteinet i henhold til bruk etter et av kravene 1 til.

39 39

40 40

41 41

42 42

43 43

44 44

45 4

46 46

47 47

48 48