MALDI TOF MS i klinisk mikrobiologi Status 2018

Transkript

1 MALDI TOF MS i klinisk mikrobiologi Status 2018 André Ingebretsen Avdeling for mikrobiologi og Avdeling for smittevern Oslo universitetssykehus Identifisering/Klassifisering 1

2 Tidsforløp klassisk klinisk bakteriologi Kultur: Tid til ID og AST resultater: ~ 40 timer Prøvetaking Transport Registrering Hurtigtester, mikro Utsæd Inkubering Avlesning Identifikasjon Resistensbestemmelse Prøvesvar 4 timer 1 time 18 timer 18 timer 1 time Klassifisering av Bacteria Hug et al. Nat. Microbiol (2016) 2

3 Genomics& Proteomics i klinisk mikrobiologi Massespektrometri i klinisk mikrobiologi Emonet et al. CMI ;

4 Massespektrometri Massespektronomi er en analyseteknikk der man kan, v.h.a. et massespektrometer, kan bestemme molekylmassen av frie ioner i et vakum. Ionekilde Masseanalysator Detektor Electron impact (EI) Chemical ionization (CI) Fast atom bombardment (FAB) Electronspray ionization (ESI) Matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) Quadrupol Magnetic sector Electric sector Ion trap Ion cyclotron Time-of-flight Faraday cup Secondary electron multiplier (SEM) Scintillator Micro channel plate (MCP) MatrixAssistedLaser DesorptionIonizationTime Of Flight(MALDI TOF) Mass Spectrometry Matrix Assisted Krystalliserte molekyler med lav mol.vekt Høy absorption av UV eller IR hindrer ødeleggelse av protein Fremmer fordampning og ionisering Laser Desorption Ionization Matrix ionisering via laserpulser Delvis overføring av positiv ladning til proteiner Time Of Flight Ioneaksellering TOF korrelerer med masse og ladning Mass spectrometry 4

5 Protein fingerprinting Del Chierico et al Journal of Proteomics, Volume 97, 2014,

6 Kvalitet på spektra Høykvalitetsspektra gir Stor reproduserbarhet av data Høyere oppløslighet innenfor artskomplekser (subtyping) Muligheter for typing Avhengig av Alder på koloni Dyrkningsforhold Anvendt prosedyre for proteinekstraksjon Kolonitetthet 6

7 Andre proteiner? For Salmonellasp: Cold-shock-like protein (Csph) Translation initiation factor IF-1 Ribosome modulation factor Integration host factorsa & B Nucleoid-associated proteins H-NS RNA chaperone CspeE Glutaredoxin-1 Phosphocarrier protein HPr Andre? Dieckmann et al. Appl Env Microbiol 2008 Prøvepreparering fra kultur Direkte preparering ( smear prep ) En tynn film smøres direkte på MALDI målplata Direkte innokulering vha loop, pipettespiss etc. Fungerer godt med de fleste G-og mange G+ Rask ekstraksjon Tilsetter maursyre direkte på MALDI målplata. Etanol-Maursyre ekstraksjon Inaktivering av mikrober Anvendes i hovedsak på G+ og gjærsopp Gir generelt bedre scoreverdi Bibliotekoppbygging 7

8 Identifikasjon direkte fra prøvematerialet Clark et al Clin MicrobRev MALDI TOF MS direkte på blodkulturer Drancourt, M. CMI ;

9 ID direkte fra urinprøver Laura Ferreira et al. J. Clin. Microbiol. 2010;48: Hvordan bedre datakvaliteten? Standard operating procedures(sop) Samme arbeidsflyt Samme typer media ikke chromogene Samme alder på kultur Så fersk som mulig (>24t) Samme laserstyrke/flere laserskudd Hvis usikker på art stol på magafølelsen Bekreft med sekvensering 9

10 Antall arter i de kommersielle databasene Masserekkevidde: Da Hovedsakelig ribosomaleproteiner og noen husholdsproteiner Kommersielle databaser Bruker Daltonics: 2461 arter (DB6903) biomerieux: 1046 arter (V3 DB) Åpne databaser Forbedrede databaser Automatisert spotting på plate BioVendor MALDI Colonyst 10

11 Automatisert spotting på plate Scirobotics + Tecan: Pickolo Loadmaursyre og matriks Target plate settes i maskinen Velg om du vil ha maursyre/matriks eller bare matriks Marker posisjoner på target plate (spotting range) Start Testing: MBT Galaxy 11

12 Konklusjon av testing Ingen signifikant forskjell i score verdi Ingen kryss-kontaminering Minimum prosedyretid var 20 min Min antall prøver Manuell pipettering er raskere Redusrer hands-on time Reduserer kostnader på forbruksvarer Reduserer belastningsskader/reagensskader Karakterisering av sviknott Kaufmann et al. Parasitology February : pp

13 Identifikasjon av virus? Identifikasjon av Leishmania sp Cassagne et al. Clinical Microbiology and Infection, Volume 20, Issue 6, 2014,

14 MBT STAR-BL module (MBT Selective Testing of Antibiotic Resistance Beta-lactamase) MBT STAR-BL module Ampicillin Piperacillin Cefotaxime Ceftazidime Ertapenem Meropenem 14

15 Påvisning av cfia hos B.fragilis Nagy, E. et al. J Med Microbiol ; MBT ASTRA (Antibiotic sucseptibility testing rapid assay) O18 (Resistent) ATCC (Følsom) Kontroll u/ AB Meropenem 64 mg/l Metronidazol 32 mg/l Kontroll u/ AB Meropenem 64 mg/l Metronidazol 32 mg/l Sydenhamnet al. Poster P1236 ECCMID

16 MBT ASTRA (Antibiotic sucseptibility testing rapid assay) Resistent Følsom O18 (Resistent) ATCC (Følsom) Meropenem 64 mg/l Metronidazol 32 mg/l Meropenem 64 mg/l Metronidazol 32 mg/l Sydenhamnet al. Poster P1236 ECCMID 2015 Resistensbestemmelse på MALDI-TOF MS? Rask deteksjon av resistens Kan oppdage nye β-laktamaser Stemmer godt overens med referansemetoder Bør kunne være metode for å detektere alle enzymatiske resistens mekanismer 16

17 Resistensbestemmelse på MALDI-TOF MS? Ikke efflux mekanismer eller porin forandringer For få studier Fingerprint: for artsspesifikk? Autohydrolysering? Automatiserings-algoritmer Nye assaykrever ekspertise i MS Subtypingi utbruddsoppklaring/epidemiologi Jung et al Poster 17

18 Subtypingi utbruddsoppklaring/epidemiologi Jung et al Poster MALDI TOF biomarkører for typing Sauget et al Trends in Microbiology 18

19 Oppsummering MALDI Utbredt analyseverktøy i kliniske laboratorier Et viktig verktøy i identifisering av en rekke bakterier og eukaryoter Kan identifisere resistensmarkører Subtyping? Automatisere prosessen Universalverktøy 19