Muligheter og begrensninger med genotypisk påvisning av resistens DAGENS ARBEIDSFLYT. Whole genome sequencing (WGS)

Transkript

1 Muligheter og begrensninger med genotypisk påvisning av resistens TØ Antibakterielle resistensmekanismer, metoder for påvisning, tolkning og klinisk betydning Tromsø, Arnfinn Sundsfjord & Ørjan Samuelsen Nasjonal kompetansetjeneste for påvisning av antibiotikaresistens (K-res) Avdeling for mikrobiologi og smittevern Universitetssykehuset Nord-Norge Tromsø, Norge DAGENS ARBEIDSFLYT Didelot et al. Nat Rev Genet 2012;13:601 Whole genome sequencing (WGS) Didelot et al. Nat Rev Genet 2012;13:601 1

2 MORGENDAGENS ARBEIDSFLYT? Didelot et al. Nat Rev Genet 2012;13:601 MULIGE ANVENDELSOMRÅDER FOR WGS Deteksjon og påvisning Direkte i prøvemateriale Renkultur Resistenstesting Virulens Epidemiologi Utbrudd Overvåkning Genes Gene carriers IS, In, Tn, plasmids Host species Strains, clones, phylogenetic groups, virulence traits, co-resistance Patients Hospital / community setting; risk factors GENETISK RESISTENSTESTING Utfordringer: Terapi baserer seg på påvisning av følsomhet Du detekterer bare det du vet Stille gener, pseudo-gener or proto-resistens gener falskpositive resultater. Adaptiv resistens: regulatoriske adaptasjoner/gen-uttrykk Bioinformatikk Fordeler: JA/NEI svar om resistensmekanisme er tilstede Ikke avhengig av brytningspunkter kan variere fra land til land og mellom institusjoner Detektere resistens mekanismer som gir lavgradig resistens vanskelig å detektere fenotypisk Kan utføres direkte på klinisk prøvemateriale: Raskere svar Langsomt voksende/vanskelig dyrkbare organismer Hegstad K et al. Antibiotics in Laboratory Medicine

3 GENETISK RESISTENSTESTING WGS Databaser for identifisering av resistensgener: Eks. K. pneumoniae i ResFinder Animalske (Gris) stammer 2011: E. coli (n=50), E. faecalis (n=50), E. faecium (n=50) og S. Typhimurium (n=50) Sammenligning av WGS med AST-microdilution (MIC) EUCAST ECOFF (14-17 ulike antibiotika) ResFinder 98% ID Resultat: 43 forskjellige resistensgener identifisert 99.74% (!) overenstemmelse WGS og fenotypi Kromosomal resistens ekskludert β-lactam resistens Enterokokker Kinolon resistens E. coli & Salmonella Zankari E et al. J. Antimicrob. Chemother

4 74 E. coli & 69 K. pneumoniae: WGS + Phoenix/M.I.C Evaluator Egen database for resistensgener Plasmid/kromosomal resistens Stoesser N et al. J. Antimicrob. Chemother ,2% very major error (R fenotypi/s genotypi) 2,1% major error (S fenotypi/r genotypi) Stoesser N et al. J. Antimicrob. Chemother EPIDEMIOLOGI/UTBRUDD RESISTENTE MIKROBER Genes Gene carriers IS, In, Tn, plasmids Host species Strains, clones, phylogenetic groups, virulence traits, co-resistance Patients Hospital / community setting; risk factors 4

5 UTBRUDDSOPPKLARING 18 pasienter 11 døde KPC (ESBL CARBA-A )-produserende K. pneumoniae Snitkin ES et al. Sci. Transl. Med UTBRUDDSOPPKLARING WGS SNP analyse 3 uavhengige overføringer fra indeks pasient Snitkin ES et al. Sci. Transl. Med RESISTENSUTVIKLING I UTBRUDDET Indeks isolat kun S for GEN, TIG, COL Utvikling av colistin resistens observert i alle 3 gruppene Snitkin ES et al. Sci. Transl. Med

6 EPIDEMIOLOGI RESISTENTE MIKROBER Genes Gene carriers IS, In, Tn, plasmids Host species Strains, clones, phylogenetic groups, virulence traits, co-resistance Patients Hospital / community setting; risk factors Eks. E. coli ST131 Global superklon Eldre del av befolkningen Long-term-care-facility (LCTF) Assosiert med høyere frekvens av sepsis og persisterende/tilbakevendende UTI Assosiert med høy frekvens av resistens: ESBL A (CTX-M-15) Ciprofloxacin, aminoglykosider, trim-sulfa. Banerjee R et al. Antimicrob. Agents Chemother MOLEKYLÆR TYPNING AV ST131 6

7 Temocillin Amox-clav Piperacillin Pip-tazo Cefoxitin Cefuroxime Cefpodoxime Cefotaxime Ceftazidime Aztreonam Meropenem Ertapenem Imipenem Gentamicin Amikacin Tobramycin Colistin Ciprofloxacin Tigecycline Rifampicin Trim-sulfa Fosfomycin Globale spredningen og høye prevalensen av CTX-M-produserende E. coli ST131 forårsaket av et ST131 subklon. Price LB et al. mbio 2013; Banerjee R et al. Antimicrob. Agents Chemother ESBL-CARBA: JA eller NEI? Species: E. coli Prøvemateriale: Blodkultur Pasient innlagt på sykehus Mistanke om importsmitte: vet ikke Blanding av norsk og utenlandsk navn Meropenem MIC: 1mg/L Full fenotypisk pakke MIC-PROFIL > >256 > > ,5 0, > ,5 0,03 0,25 >32 >32 1 ESBL-CARBA: høy MIC TZP Utenfor WT Uvanlig at ESBL-CARBA isolater er CIP-S Oppfyller ikke kravene for OXA-48 testing Intermediær 7

8 FENOTYPISKE β-lactamase TESTER ROSCO AmpC confirm ID kit AmpC gradienttest CTX CTX-BO CTX-CL CAZ CAZ-BO CAZ-CL CTT CXT 10mm 12mm 12mm 10mm 10mm 10mm >32 >32 Negativ ESBL-A gradient tester CTX CTL CAZ CAL FEP FEL CTX CTX- CLA Inkonklusiv BD ESBL kombinasjonslapper CAZ CAZ- CLA >16 >1 >32 >4 >16 >4 10mm 14mm 7mm 11mm Inkonklusiv Inkonklusiv Inkonklusiv Negativ Negativ Negativ/inkonklusiv ESBL-A/AmpC FENOTYPISKE β-lactamase TESTER ROSCO KPC, MBL and OXA-48 Confirm kit MBL gradienttest TEMOC MRP MRPBO MRPCX MRPDP MRP MRD 21mm 21mm 21mm 21mm 26mm 0,38 (P) 0,047 Negativ OXA-48 Positiv Negativ KPC Positiv MBL NB: metall-kelatorer kan ha egen-effekt falsk-positive resultater CarbaNP test: Positiv Hodge test: Positiv NB: CarbaNP/Hodge test: falsk-positive/-negative observert ESBL-CARBA positiv; ESBL-CARBA-B MOLEKYLÆRE ANALYSER ESBL-CARBA-B real-time multiplex PCR bla VIM, bla IMP, bla NDM, bla GIM, bla SPM, bla SIM : NEGATIV ESBL-CARBA-D real-time PCR bla OXA-48-like : NEGATIV ESBL-CARBA-A real-time PCR bla KPC : NEGATIV ESBL-CARBA-D multiplex PCR bla OXA-23-like, bla OXA-24-like, bla OXA-58-like, bla OXA-51 : NEGATIV ESBL-A multiplex real-time PCR bla CTX-M gr. 1, bla CTX-M gr. 2, bla CTX-M gr. 8, bla CTX-M gr. 9, bla CTX-M gr. 25 : POSITIV CTX-M gr. 1 ESBL-M-C multiplex real-time PCR (bla CIT/CMY, bla MOX, bla FOX, bla DHA, bla ACC, bla EBC ): NEGATIV 8

9 ESBL-CARBA: JA eller NEI? ESBL-A (CTX-M-positiv) + impermabilitet? CarbaNP/Hodge: falsk-positive resultater observert Falsk-positive resultater metall-kelator baserte tester Gull-standard metode (imipenem-hydrolyse): Lysering Sentrifugering ESBL-CARBA POSITIV! OPPSUMMERING Utbrudd Epidemiologi Kan genotypi erstatte fenotypi? 9