QUANTA Lite TM Actin IgG For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM Actin IgG For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM Actin IgG er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av IgG-antistoffer mot aktin-komponenten til glattmuskel i humant serum. Forekomsten av aktinantistoffer kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester for å hjelpe i diagnosen av autoimmun leversykdom slik som autoimmun hepatitt (AIH) og primær biliær cirrhose (PBC). Sammendrag og forklaring av testen Antiaktin-autoantistoffer er hovedkomponenten til det som har blitt kalt glattmuskel-antistoffer (ASMA). Disse antistoffene viser spesifisitet mot aktin-komponenten til cytoskjelettet 1,2 og er vanligvis påvist ved indirekte immunfluorescens som bruker tynne bestanddeler av gnagerlever, -nyrer eller magesekk som substrat. 2,3 Antiaktin-antistoffer finnes hos 52-85% av pasienter med AIH eller kronisk aktiv hepatitt (CAH) og hos 22% av pasienter med primær biliær cirrhose (PBC). 3,4,5 Antiaktin-antistoffer har blitt rapportert, normalt i lave titere, i 3-18% av sera fra den generelt friske populasjonen. 6 Immunfluorescens prosedyrer for påvisning av aktin eller glattmuskel-antistoffer er subjektive og analysens prestasjonsevne avhenger av vevstypen som brukes, konjugatets spesifisitet, styrke på mikroskopsystemet brukt til å lese resultatene, samt observatørens erfaring. Nyere ELISA-metoder ble først rapportert i midten av 1980-årene til begynnelsen av 1990-årene 4,5,7,8 har potensialet for høyere og mer standardisert og automatiserbar prestasjonsevne. Det er blitt rapportert at anti-glattmuskelspesifisitet for aktin finnes hovedsakelig hos pasienter med CAH. Mens hos pasienter med virale infeksjoner slik som smittsom mononukleose, viral hepatitt, meslinger og kusma skyldes anti-glattmuskelreaktivitet ikke-aktin cytoplasma-antigener. 1,2,3,9,10 Glattmuskel-antistoffer og antinukleære-antistoffer er de immunserologiske kjennetegn på type 1 autoimmun hepatitt. 11 Glattmuskel-antistoffer rettes mot flere komponenter og den viktigste er aktin, men immunfluorescens kan også påvise antistoffer mot tubulin og intermediære filamenter. 12 Nylige studier har foreslått at det er antiaktin-antistoffene som har spesifisitet for autoimmun leversykdom og de har forsvart dem som bedre markører for autoimmun hepatitt enn anti-glattmuskler. 12,13,14 Faktisk har betegnelsen antiaktin hepatitt blitt bruk for å beskrive denne tilstanden. 15 Czaja et al. 14 har vist at antiaktin-antistoffer forekom hos 73 av 99 (74%) pasienter med type 1 autoimmun hepatitt og hos 0 av 83 friske blodgivere og hos 3-15% av pasienter med andre typer av kronisk hepatitt. Fra denne samme studien ble det fastslått at nesten alle (99%) av de aktin-positive pasientene også var positive for glattmuskel-antistoffer, mens 46% av den aktin-negative gruppen hadde glattmuskel-reaktivitet. Antiaktin-positive pasienter var mer tilbøyelige å være uimottakelige for kortikosteroidbehandling (16% vs. 4%) og var mer tilbøyelige å utvikle leversvikt (20% vs. 4%). 14 Prosedyreprinsipper Renset F-Actin-antigen er bundet til brønnene til en mikrotiterplate av polystyren under betingelsene som vil konservere antigenet i naturlig tilstand. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum blandes i separate brønner slik at tilstedeværende Sm-antistoff bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgG-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgG-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Etter å ha vasket bort enzym-merket anti-humant IgGantistoff som ikke har festet seg, måles gjenværende enzymaktivtet ved å tilsette et substrat og fargeutviklingen måles. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene med fargen i kontrollbrønnene

2 Reagenser 1. Mikrotiter ELISA-plate av polystyren dekket med renset Actin-antigen (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum uten humane antistoffer mot Actin, forhåndsfortynnet, 1,2mL 3. Actin ELISA lav positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med ikke-humane antistoff mot Actin, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 4. Actin ELISA høy positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med antistoff mot Actin, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 5. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 6. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning. 7. HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG, 1 ampulle blåfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10 ml 8. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10 ml 9. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10 ml Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal Actin ELISA lav positiv, Actin ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll behandles på samme måte som potensielt smittefarlig materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med blyeller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISA-brønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser

3 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRP-konjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 Actin ELISA-mikrotiteroplate (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet Actin ELISA lav positiv 1 1,2mL forhåndsfortynnet Actin ELISA høy positiv 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat - 3 -

4 Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av HRP-vaskekonsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i én uke ved 2-8 o C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN Actin ELISA lav positiv, Actin ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av Actin ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Tilsett 100µL av forhåndsfortynnet Actin ELISA lav positiv, Actin ELISA høy positiv, ELISA negativ kontroll og de fortynnede pasientprøvene til brønnene. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 3. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRPvaskebuffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 4. Tilsett 100μL av HRP-IgG-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 5. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 7. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMB-kromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 8. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. Actin ELISA lav positiv, Actin ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsetti for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da Actin ELISA lav positiv, Actin ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C

5 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet Actin ELISA høy positiv må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet Actin ELISA lav positiv, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet Actin ELISA høy positiv må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til Actin ELISA lav positiv må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,25. d. ELISA negativ kontroll og Actin ELISA høy positiv er ment for å kontrollere for substansiell reagensfeiling. Actin ELISA høy positiv vil ikke sikre presisjon ved analysens cut-off. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. Beregning av resultater OD-middelverdien for hvert sett av duplikater bestemmes først. Reaksjonen for hver prøve kan deretter beregnes ved å dele prøvens OD-middelverdi med OD-middelverdien for Actin ELISA lav positiv. Resultatet multipliseres med antall tildelte Actin ELISA lav positiv enheter som står oppgitt på etiketten. Prøve OD Prøveresultat = x Actin ELISA lav positiv (enheter) Actin ELISA lav positiv OD (enheter) Reaksjon er relatert til antistoffmengde fremstilt på ikke-lineært vis. Selv om økninger og minskinger av pasientens antistoffkonsentrasjoner vil gjenspeiles i form av tilsvarende stigning eller fall i reaksjon, er endringen ikke proporsjonal (dvs. en fordobling av antistoffkonsentrasjon vil ikke fordoble reaksjonen). Hvis det påkreves en nøyaktigere kvantifisering av pasientens antistoff, skal serielle fortynninger av pasientprøven kjøres og den siste fortynningen som måles positiv i analysen, skal rapporteres som pasientens antistofftiter. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. Prøven kan da klassifiseres som negativ, svakt positiv eller moderat positiv til sterkt positiv i henhold til tabellen nedenfor. Enheter Negative <20 Svakt positiv Moderat til Sterkt positiv >30 1. Et positivt resultat indikerer forekomst av Actin-antistoffer og antyder muligheten for autoimmune hepatitt eller kronisk aktiv hepatitt. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av Actin-antistoff eller nivåer under analysens cutoff. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA. Actin-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgG-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter. Prosedyrebegrensninger 1. Forekomsten av immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i pasientprøven kan forårsake et forhøyet nivå av ikke-spesifikk binding og produsere feilaktige positive analyseresultater

6 2. Ikke alle pasienter med kronisk aktiv hepatitt eller primær biliær cirrhose er positive for aktinantistoffer. 3. Ikke alle glattmuskel-positive prøver vil ha aktin-antistoffer. 4. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 5. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. 6. På dette tidspunktet er effekten av behandling av antiaktin-autoantistoffer ukjent. Forventede verdier Evnen til QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA for å påvise aktin-antistoffer ble evaluert ved sammenlikning med en kommersielt tilgjengelig immunfluorescenstest og ved evaluering av klinisk definerte pasientprøver. Resultatene av immunfluorescenstesten ble bestemt i henhold til fabrikantens vedlagte veiledning. Normalområde Normalområdestudien ble utført i forskningslaboratoriet ved INOVA Diagnostics, Inc. 150 tilfeldig utvalgte normalserumprøver ble valgt og testet med QUANTA Lite Actin IgG ELISA. Denne populasjonen bestod av 89 menn i alderen fra 18 til 70 år (gjennomsnittsalder 31) og 61 kvinner i alderen fra 17 til 74 år (gjennomsnittsalder 36). Bare 3 av disse 150 prøvene testet positivt. To prøver hadde et moderat til sterkt resultat med 75 og 31 enheter og den andre prøven var bare svakt positiv på 21 enheter. Den positive grensen for denne analysen er 20 enheter. Gjennomsnittsverdien for disse 150 normalprøvene var 7,3 enheter. De tre positive normalprøvene ble testet med det immunfluorescent-baserte NOVA Lite ANA Plussettet. De sterkt positive prøvene (75 og 31 enheter) reagerte med et tradisjonelt aktin-positivt glattmuskel-mønster. Disse prøvene produserte klare fluorescerende reaksjoner med de glatte musklene til nyrens blodkar, magesekkens muskularis og med kontraktil-proteintrådene som går mellom de gastriske parietalcellene. Den svakestes reaktive prøven (21 enheter) utviste en atypisk, mer retikulinaktig fargelegging av glatt muskelvev. Relativ overensstemmelse mellom ELISA og immunfluorescens 83 prøver innsendt for glattmuskel-antistofftesting fra tabellen over i tillegg til 150 normalprøver ble testet med både QUANTA Lite Actin IgG ELISA og en annen kommersielt tilgjengelig IFA-metode for å bestemme analysens relative sensitivitet og spesifisitet. Av de 233 prøvene som ble testet, var 65 positive og 136 negative med begge metodene. 32 prøver var positive med IFA, men ikke med ELISAmetoden. Av disse 32 prøvene som var IFA-positive og ELISA-negative, var 11 fra normalgruppen og 17 fra de resterende 21 prøvene var IFA-positive, men bare ved 1:40 fortynning. QUANTA Lite Actin IgG Positive Overensstemmelse 67,0% IFA Metode Negative Overensstemmelse 100% Generell Overensstemmelse 86,3% Klinisk sensitivitet og spesifisitet Det følgende er en samling av kliniske data tatt fra studier utført i laboratorier hos INOVA i tillegg til én ekstern studie. Pasientgruppe Antall Antall Positive % Positive Autoimmun hepatitt (AIH) ,4 Kryptogenisk hepatitt ,0 Autoimmun kolangitt ,5 Primær biliær cirrhose (PBC) ,0 AIH/PBC overlapping ,8-6 -

7 AIH/PSC overlapping ,0 Medikamentell indusert hepatitt ,0 Autoimmun hepatitt type ,0 Viral hepatitt 3 0 0,0 Cirrhose 1 0 0,0 Primær skleroserende kolangitt (PSC) 1 0 0,0 Autoantistoff positive kontroller ,0 Normalprøver ,8 Sensitivitet for AIH kan faktisk være høyere enn indikert, da mange av disse pasientene var under immunsuppressiv behandling før prøven ble tatt. Mange pasienter hadde i tillegg flere prøve. Seropositive for tabellen ovenfor ble definert som positivitet av første blodprøve. Syv AIH og én AIH/PBC og én AIH/PSC-pasient var i tillegg positiv på etterfølgende prøver og ga sensitiviteten på 75,7% for AIH-gruppen. Kryssreaksjoner For å vurdere potensiell kryssreaktivitet med andre autoantistoffer med QUANTA Lite Actin IgG ELISA ble totalt 68 forskjellige sera testet og hvert av disse inneholdt høye nivåer av flere autoantistoffer som vanligvis testes. Inkludert i denne gruppen av 68 prøver var det seks prøver fra pasienter med SLE som inneholdt høye nivåer av ANA og dobbelttråd DNA, to revmatoid faktorsera, seks sera positive for endomysium / vevstransglutaminase, syv sera positive for tyroid peroksidase (TPO). Det var åtte ANCA positive, fire p-anca og fire c-anca. En glomerulusbasalmembran (GBM), én lupus anti-koagulant positiv og fire hver av Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70 og Jo-1 prøver ble testet. Resterende sera var fire anti-kardiolipin, tre β 2 GPI, to protrombin positiv, én histon og tre prøver fra type I diabetikere som er ICApositive. Bare fire prøver ga et positivt resultat. To prøver var ganske sterkt positive med 83 og 66 enheter. Når testet med IFA på NOVA Lite ANA Plus (musenyre/magesekk)-settet, viste begge prøvene seg å være positive for glattmuskel-antistoff mot en titer på 1:320 og med et karakteristisk aktinmønster. To prøver var svakt positive hver med 26 enheter. Ingen av disse viste reaktivitet med glatt muskelvev med immunfluorescens. Begge prøvene var ANA/DNA-positive. Testing av 83 bekreftede glattmuskel-positive prøver Den følgende tabellen lister opp aktin-elisa-positivitet i henhold til glattmuskel IFA-titer. IFA-titer Antall Antall aktin-positive % Positive % % % % % % % TOTAL % Presisjon og reproduserbarhet Presisjonen og reproduserbarheten til analysen ble målt ved å kjøre seks gjentakelser hver av én negativ (14 enheter), svakt positiv (25 enheter) og sterkt positiv prøve (110 enheter) i seks separate analyser. Innenfor og mellom seriepresisjon ble kalkulert som følger: Standardavviket og variasjonskoeffisienten for hver prøve oppsummeres nedenfor. Negative Sterkt positiv Svakt positiv SD CV SD CV SD CV Samlet 1,3 9,7% 1,4 5,5% 4,5 4,1% Innen serien 1,1 8,0% 1,4 5,8% 3,8 3,5% Mellom serier 1,2 8,6% 1,3 5,3% 5,3 4,2% - 7 -

8 Referanser 1. Anderson P, et al. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26:57-66, Bottazzo GF, et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 129: , George, J and Shoenfeld Y. Actin Autoantibodies, p10-12 in Autoantibodies by JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, Bretherton L, et al. Elisa assay for IgG autotantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51: , Dighiero G, et al. Sera with high levels of antismooth muscle and anti mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeletal proteins. Clin Ept Immunol 82:52-56, Fagraeus A and Norberg R. Antiactin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82:1-13, DeScheerder I, et al. Post-Cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56: , Leibovitch L, et al. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Letters 48: , Kurki P, et al. Smooth muscle antibodies of actin and nonactin specificity. Clin Immuno Immunpathol 9: , Toh BH, et al. Viral infections and IgM autoantibody to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37:76-82, Alvarez F, et al. International autoimmune hepatitis group report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J of Hepatology 31: , Toh BH. Smooth muscle atuoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38: , Fusconi M, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem? J Immunol Mehtods 130:1-8, Czaja A, et al. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24: , Homberg J, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney micro 16. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service NOR November 2007 Rev