QUANTA Lite TM ANA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM ANA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM ANA er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av antinukleære-antistoffer (ANA) i humant serum. Forekomsten av ANA kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som støtte i diagnosen av revmatiske sykdommer slik som systemisk lupus erythematosus, Sjögrens syndrom, sklerodermi og kombinerte bindevevssykdommer. Analysen påviser kollektivt i én brønn totalt ANA mot kromatin (dsdna og histoner), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centromere og PCNA, i tillegg til antistoffer mot de diagnostisk viktige cytoplasmiske antigenene slik som Jo-1, mitokondria (M-2) og ribosomal-p protein. Positive sera for ukjente antigener med den tradisjonelle indirekte immunfluorescerende antistofftesten på HEp-2 celler vil også kunne påvises. Sammendrag og forklaring av testen Forekomsten av ANA er ett av kjennetegnene på systemiske autoimmune sykdommer. 1-4 ANA har typisk blitt påvist ved hjelp av en indirekte immunfluorescerende analyse (IFA) som bruker musenyrebestanddeler eller HEp-2 celler som substrat. 3 Videre testing av ANA-positive sera kan utføres ved hjelp av enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA), Western blot eller immunpresipitasjon for å identifisere spesifikke autoantistoffer i seraene. 1-4 En blanding av diagnostisk viktige antigener sammen med et HEp-2 celleekstrakt har nylig blitt brukt i ELISA for å påvise ANA. 5-9 Fordelene til ANA ELISA i forhold til IFA inkluderer enklere utførelse, ingen observatør- eller utstyrskjevhet, semikvantitative resultater og et redusert antall av biologisk feilaktige positive resultater. Ulempene til ELISA sammenliknet med IFA inkluderer manglende sensitivitet for ukjente nukleære og cytoplasmiske antigener og manglende ANAmønster som har tradisjonelt blitt rapportert med IFA. Den diagnostiske nytten av et ANA av ukjent spesifisitet er imidlertid ikke klart på nåværende tidspunkt, da mange friske mennesker er ANA-positive, men negative for diagnostisk viktige autoantistoffer. 11,12 Videre er det også slik at så snart en spesifikk reaksjon er identifisert i serumet, er ANA-mønsteret ikke lenger så viktig for diagnose. Derfor er det helt klart at det er nyttig å ha ANA ELISA i et klinisk laboratorium. Prosedyreprinsipper Høyrensede rensede individuelle antigener i tillegg til ekstrakter fra HEp-2 nukleuser og nukleoli bindes til overflaten av en mikrotiterplate. Antigenene inkluderer kromatin (dsdna og histoner), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centromere, PCNA, Jo-1, mitokondria (M-2) og ribosomal-p protein i tillegg til ekstraktene. Antikromatin reaktivitet har nylig blitt vist å være både en sensitiv og tidlig markør for SLE. 13 Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnede pasientsera tilsettes separate brønner for å la tilstedværende ANA antistoffer binde seg til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgG-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgGantistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Etter å ha vasket bort enzym-merket anti-humant IgG-antistoff som ikke har festet seg, måles gjenværende enzymaktivtet ved å tilsette et substrat og fargeutviklingen måles. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene med fargen i kontrollbrønnene. Reagenser 1. Mikrotiter ELISA-plate av polystyren dekket med renset nukleære og cytoplasmiske antigenene (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum uten humane antistoffer mot nukleære og cytoplasmiske antigenene, forhåndsfortynnet, 1,2mL 3. ANA ELISA lav positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med antistoff mot nukleære og cytoplasmiske antigenene, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 4. ANA ELISA høy positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med antistoff mot nukleære og cytoplasmiske antigenene, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 5. ANA prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 6. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning

2 7. HS HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG, 1 ampulle fiolettfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10 ml 8. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10 ml. 9. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10 ml Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal ANA ELISA lav positiv, ANA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll behandles på samme måte som potensielt smittefarlig materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISAbrønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRPkonjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis

3 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 ANA ELISA-mikrotiterplate (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet ANA ELISA lav positiv 1 1,2mL forhåndsfortynnet ANA ELISA høy positiv 1 50mL ANA-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HS HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av HRPvaskekonsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i én uke ved 2-8 o C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:41) for hver pasientprøve ved å blande 10µL fra prøven med 400µL av ANA-prøvediluent. IKKE FORTYNN ANA ELISA lav positiv, ANA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll. Fortynnedee prøver må bli brukt innenfor 8 timer etter fortynning. MERKNAD:Fortynnede prøver 1:41 i ANA-prøveløsning, hvis ønsket, kan også tilsettes direkte med pipette på et HEp-2 cellesubstrat for å bekrefte ANA-positivitet og bestemme ANA-mønsteret. Positive prøver kan fortynnes til endepunktet ved bruk av standard PBS som diluent. Opprinnelige pasientløsninger andre enn 1:41 i denne bufferen har ikke blitt testet. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av ANA ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Tilsett 100µL av forhåndsfortynnet ANA ELISA lav positiv, ANA ELISA høy positiv, ELISA negativ kontroll og de fortynnede pasientprøvene til brønnene. Dekk brønnene og - 3 -

4 sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 3. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRP-vaskebuffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 4. Tilsett 100μL av HS HRP-IgG-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 5. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 7. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMBkromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 8. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. ANA ELISA lav positiv, ANA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsetti for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da ANA ELISA lav positiv, ANA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet ANA ELISA høy positiv må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ANA ELISA lav positiv, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet ANA ELISA høy positiv må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,15. c. Absorbansen til ANA ELISA lav positiv må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,15. d. ELISA negativ kontroll og ANA ELISA høy positiv er ment for å kontrollere for substansiell reagensfeiling. ANA ELISA høy positiv vil ikke sikre presisjon ved analysens cut-off. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. Beregning av resultater OD-middelverdien for hvert sett av duplikater bestemmes først. Reaksjonen for hver prøve kan deretter beregnes ved å dele prøvens OD-middelverdi med OD-middelverdien for ANA ELISA lav positiv. Resultatet multipliseres med antall tildelte ANA ELISA lav positiv enheter som står oppgitt på etiketten. Prøve OD Prøveresultat = x ANA ELISA lav positiv (enheter) ANA ELISA lav positiv OD (enheter) Reaksjon er relatert til antistoffmengde fremstilt på ikke-lineært vis. Selv om økninger og minskinger av pasientens antistoffkonsentrasjoner vil gjenspeiles i form av tilsvarende stigning eller fall i reaksjon, er endringen ikke proporsjonal (dvs. en fordobling av antistoffkonsentrasjon vil ikke fordoble reaksjonen). Hvis det påkreves en nøyaktigere kvantifisering av pasientens - 4 -

5 antistoff, skal serielle fortynninger av pasientprøven kjøres og den siste fortynningen som måles positiv i analysen, skal rapporteres som pasientens antistofftiter. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. Prøven kan da klassifiseres som negativ, moderat positiv eller sterkt positiv i henhold til tabellen nedenfor. Enheter Negative <20 Moderat positiv Sterkt positiv >60 1. Et positivt resultat indikerer forekomst av ANA-antistoffer og antyder muligheten for revmatiske kydommer slik som systemisk lupus erythematosus, skleroderma og/eller kombinert bindevevssykdom. 2. Et negativt resultat indikerer at ingen av antistoffene som det ble testet for forekommer eller er under nivået for analysens negative grense. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA. ANA-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgG-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter. Prosedyrebegrensninger 1. Forekomsten av immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i pasientprøven kan forårsake et forhøyet nivå av ikke-spesifikk binding og produsere feilaktige positive analyseresultater. 2. Ikke alle pasientene med bindevevssykdommer er positive for antinukleære antistoffer. 3. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 4. Spesifisiteten til et reaktiv serum kan ikke bestemmes ved hjelp av denne analysen. Videre testing for forekomst av spesifikke antistoffer anbefales. 5. ANA ELISA lav positiv og ANA ELISA høy positiv kontroller utgjøres av et positivt serum for RNP. Dette antigenet er ett av de mest sensitive for degradering. Derfor er disse kontrollene også et sensitivt mål på integriteten til dette antigenet. Andre kontroller kan benyttes for å overvåke nivået av de forskjellige antigenene etter hvert enkelt laboratoriums skjønn. 6. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier Normalområde Grensen mellom et negativ og positivt resultat er på 20 enheter. Prøver fra 246 friske frivillige ble testet. Denne populasjonen var sammensatt av cirka 65% kvinner i aldersgruppen fra år og gjennomsnittsalderen var på 38 år. 23 (9,4%) var positive og ga en spesifisitet på 90,6%. 6 av de ELISA-positive prøvene var også positive med IFA på HEp-2 celler. Inkludert var de to sterkest positive prøvene fra de friske frivillige som var 40 og 50 enheter. Når vi tar hensyn til de seks ANA-positive prøvene fra de friske frivillige, var bare 6,9% biologisk feilaktig positive. De resterende positive prøvene fra de friske frivillige var alle 35 enheter eller mindre. Cirka 60% av panelet av friske frivillige var mindre enn 10 enheter. Relativ sensitivitet og spesifisitelt Sammenlikning med en annen kommersiell ANA ELISA-referansetest Klinisk definerte prøver ble kjørt både på INOVA QUANTA Lite ANA ELISA og en ANA ELISA-referansetest. Resultatene for den friske populasjonen og de fra pasientene med SLE, Sjögrens syndrom og sklerodermi vises i tabellen under. Sera som allerede hadde stadfestet forekomst av antistoffer reaktive mot SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, kromatin, ribosomal P og M2 ved hjelp av ELISA ble testet i tillegg. Det ble også testet prøver som var positive med immunfluorescens eller Western blot for centromere, P-80 koilin, nucleoli og PCNA. Settene ga nesten identiske resultater. Som beregnet fra tabellene under er relativ sensitivitet og relativ spesifisitet 89%

6 Sammenlikning av friske individer med INOVA og ANA ELISA-referansetestene Negative Positive Normale n = 134 Negative 106 6** Referansetest ANA ELISA Positive 13* 9*** * Disse prøvene varierte fra 1 til 1,6 referanseenheter, tilsvarende 20 til 33 INOVA-enheter. Fire av prøvene var ANA-positive med IFA på HEp-2 celler. ** Disse prøvene varierte fra 20 til 25 INOVA-enheter. To prøver var ANA-positive med IFA. *** Tre av disse prøvene var ANA-positive med IFA. Sammenlikning av pasienter med Systemisk Revmatiske Sykdommer (SRD) med INOVA og ANA ELISA-referansetester. Negative Positive SRD n=100 Negative 4* 1 ANA ELISA-referansetest Positive 6 89 *En av disse prøvene var negativ med IFA på HEp-2 celler. Sammenlikning av prøver med definert reaksjon med og ANA ELISAreferansetest Negative Positive Definert n=74 Negative 2* 7*** ANA ELISA-referansetest Positive 1** 64 * Det var én PCNA- og 1 Scl-70-prøve, begge ANA-positive med IFA på HEp-2 celler. ** Denne prøven var positiv for nukleolært mønster med IFA. *** Disse inkluderte én Scl-70, én RNP, én M2 og fire Jo-1-prøver, alle svakt til moderat positiv på. Scl-70 og RNP-prøver var ANA-positive i HEp-2 celler. De andre var ANAnegative og svakt cytoplasmisk positive med IFA, som forventet. Sammenlikning mellom QUANTA Lite ANA ELISA og IFA på NOVA Lite HEp-2 celler Alle de normale og klinisk definerte prøvene som ble kjørt på INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA ble også testet med IFA ved hjelp av NOVA Lite TM HEp-2 settet fra INOVA. Teknikeren som leste IFA visste ikke identiteten til prøvene for å sikre objektive resultater. ANA ELISA produserer et signifikant lavere antall ANA-positive prøver for den friske populasjonen enn IFAteknikken, slik det fremgår av den følgende tabellen. ELISA er, i tillegg, nesten like sensitiv som HEp-2-teknikken for å påvise ANA hos pasienter med SLE, Sjögrens syndrom og sklerodermi, slik det fremgår i den andre tabellen. Sammenlikning av på QUANTA Lite ANA ELISA og NOVA Lite HEp-2 celler Negative Positive Normalprøver n=134 Negative 91 10* IFA på HEp-2 celler Positive 28 5 * Disse prøvene var alle 35 enheter eller mindre. Sammenlikning av pasienter med SRD med QUANTA Lite TM ANA ELISA og NOVA Lite TM HEp-2 celler Negative Positive SRD n=100 Negative 1 3* IFA på HEp-2 celler Positive 9* 87 * Det var 3 prøver hver fra SLE, Sjögrens syndrom og sklerodermi med en hel rekke IFA ANAmønstre, flesteparten med svak ANA-intensitet. ** Disse var fra SLE-pasienter. En av disse var meget sterkt positiv med cytoplasmisk fluorescens og var positiv for ribosomal-p med ELISA. Sammenlikning av buffere for påvisning av ANA med IFA på HEp-2 celler Det er forventet at noen laboratorier vil bruke QUANTA Lite TM ELISA for å eksaminere og velge ut negative prøver og deretter bekrefte positive prøver med konvensjonell ANA IFA testing. ANA-prøvediluenten er kompatibel med tradisjonelle IFA-metoder for å gjøre dette arbeidet lettere. Et delsett av prøvene som ble testet for ANA med IFA på NOVA Lite TM HEp-2 settet ble også testet for ANA med IFA på HEp-2 celler ved bruk av ANA-prøvediluenten for å fortynne prøvene istedenfor PBS-diluenten som leveres sammen med NOVA Lite TM settet. Resultatene ved å bruke de to forskjellige diluentene ble praktisk talt det samme for pasienter med SLE, Sjögrens - 6 -

7 syndrom og sklerodermi. Bare 5 av 97 prøver var uoverensstemmende. ANA-prøvediluenten minket ikke-spesifikk binding og produserte en positiv tolkning av tidligere negative prøver tre ganger på grunn av lavere bakgrunnscytoplasmisk farging som gjorde at det ble vist et ANAmønster. Den produserte en negativ tolkning to ganger av tidligere svakt positive prøver på grunn av redusert nukleær farging. Det var, som forventet, mer uoverensstemmelse med hensyn til resultatene for normalpanelet, da svake eller negative IFA-resultater er vanskeligere å bestemme enn sterkt positive resultater. Ved å bruke PBS-diluenten var 33% av de friske frivillige positive, mens med ANA ELISA-fortynneren var 26% positive. Fersk faglitteratur rapporterer en 30% positiv ANA-ratio hos den friske normalpopulasjonen når denne testes ved en 1:40 løsning. 11 Titere av fire positive prøver ble bestemt ved seriell fortynning av den opprinnelige ANA-prøvediluenten 1:41 fortynninger med PBS. Disse endepunkttitere var innenfor en dobbel fortynning av prøver som innledningsvis ble fortynnet med NOVA Lite PBS. Opprinnelige pasientfortynninger andre enn 1:41 i denne ANA-prøvediluenten har ikke blitt testet. Klinisk Sensitivitet og Spesifisitet Positive Pasientegruppe Total Antall # % Sunn frivillig % Klinisk definerte pasienter SLE % Sjögrens syndrom % Scleroderma % Antigenetisk definerte* % * Mellom fire og ni prøver som allerede hadde vist seg positive for SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl- 70, Jo-1, kromatin, ribosomal-p og M2 ble testet. Det ble også testet prøver som var positive med immunfluorescens eller Western blot for centromere, P-80 koilin, nucleoli og PCNA. Klinisk sensitivitet til ANA ELISA for SLE er 93% og klinisk spesifisitet er 91% basert på studiet ovenfor. Prosentandelen av ANA-positive prøver for pasienter med SLE stemmer godt overens med det som er beskrevet i faglitteraturen. 1-4 Det skal også understrekes at noen av disse pasientene var under behandling med kortikosteroider når seraene fra disse ble tatt. Pasientene med Sjögrens syndrom og sklerodermi viste seg å være ANA-positive med IFA. Antall biologisk feilaktige ELISA-positive prøver hos den friske populasjonen var interessant nok signifikant mindre enn den som ble observert med HEp-2 celler IFA som generelt rapporteres som 20-30%. 11,12 Presisjon og reproduserbarhet Innen serien: Fem prøver ble kjørt 12 ganger hver på én ELISA-plate for å vurdere presisjonen innen serien til QUANTA Lite ANA ELISA. Resultatene oppsummeres i tabellen nedenfor. Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Mean 31 U 51 U 54 U 144 U 172 U SD 1,3 3,4 6,0 9,6 6,5 CV 4% 7% 11% 7% 4% Mellom seriene: Fire positive prøver og én sterkt negativ prøve ble kjørt én gang per dag i løpet av seks forskjellige dager for å vurdere presisjon mellom seriene. Resultatene oppsummeres i tabellen nedenfor. Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Mean 16 U 27 U 31 U 47 U 160 U SD 1,6 2,4 2,2 5,1 22,6 CV 10% 9% 7% 11% 14% - 7 -

8 Referanser 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24: (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44: (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105: (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40: (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17: (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122: (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4: (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25: (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40: (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2: (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42: (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service NOR November 2007 Rev