QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av centromer-antistoffer, spesielt reaktive mot CENP-A og CENP-B-antigenene i humant serum. Påvisning av disse antistoffene er en støtte i diagnosen av bestemte bindevevssykdommer slik som CREST-varianten av sklerodermi. Sammendrag og forklaring av testen Autoantistoffer reaktive med centromer-regionen til kromosomene ble først beskrevet i Disse antistoffene blir vanligvis påvist ved indirekte immunfluorescens ved bruk av vevskulturcellelinjer slik som HEp-2 som substrat. 2 Det som er referert til som centromer er nå kjent for å bestå av flere protein-subkomponenter og de viktigste her er CENP-A, CENP-B og CENP-C. 2 Mange av de centromeriske subenhetene har blitt isolert eller klonet. Analyser som bruker CENP-B-fusjonsproteiner har vært i bruk i flere år. 3 Autoantistoffer mot centromer viser seg oftest å ha spesifisitet for CENP-B og CENP-A. Det har blitt identifisert minst tre andre antigener, men antistoffer mot disse (CENP-D, CENP-E og CENP-F) gjenkjennes sjeldnere. 3,4 ELISA-analyser som inkorporer CENP-B rapporteres å ha en sensitivitet på 94-95% når sammenliknet med en god immunfluorescens-metode som bruker HEp-2 cellesubstrat. 3,5,6 CENP-A-proteinet ble klonet 7 og nylig utgitte data viser at ELISA-analyser som inkorporerer CENP-A og CENP-B produserer meget sammlikningsbare resultater med immunfluorescens og at sensitivitet til analyser som bruker begge proteiner er høyere enn analyser der man bruker hvert antigen separat. 8 Centromer-antistoffer er anerkjent som en serologisk markør til en form for systemisk sklerose eller sklerodermi som er vanligvis referert til som CREST-syndromet (kalsinose, Raynauds fenomen, oesophagusdysmotilitet, sklerodaktyli og teleangiektasier). 9 Pasienter med centromerantistoffer pleier å ha en mer godartet form for sklerodermi med mindre systemisk medvirkning og disse pasientene pleier ikke å produsere andre antinukleære antistoffer, inkludert Scl Prosedyreprinsipper Antigenet brukt i QUANTA Lite Centromere ELISA-testen er rekombinant avledet CENP-A og CENP-B. Disse antigenene bindes til overflaten av en mikrotiterplate. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum blandes i separate brønner slik at tilstedeværende Centromere-antistoff bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgG-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgG-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Etter å ha vasket bort enzym-merket anti-humant IgG-antistoff som ikke har festet seg, måles gjenværende enzymaktivtet ved å tilsette et substrat og fargeutviklingen måles. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene med fargen i kontrollbrønnene. Reagenser 1. Mikrotiter ELISA-plate av polystyren dekket med renset Centromere (CENP-A og CENP- B)-antigenet (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum uten humane antistoffer mot Centromere, forhåndsfortynnet, 1,2mL - 1 -

2 3. Centromere ELISA lav positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med ikke-humane antistoff mot Centromere, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 4. Centromere ELISA høy positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med antistoff mot Centromere, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 5. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 6. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning. 7. HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG, 1 ampulle blåfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10 ml 8. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10 ml 9. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10 ml Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal Centromere ELISA lav positiv, Centromere ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll behandles på samme måte som potensielt smittefarlig materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISAbrønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert - 2 -

3 enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRPkonjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 Centromere ELISA-mikrotiter (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet Centromere ELISA lav positiv 1 1,2mL forhåndsfortynnet Centromere ELISA høy positiv 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre - 3 -

4 Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av HRPvaskekonsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i én uke ved 2-8 o C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN Centromere ELISA lav positiv, Centromere ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av Centromere ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Tilsett 100µL av forhåndsfortynnet Centromere ELISA lav positiv, Centromere ELISA høy positiv, ELISA negativ kontroll og de fortynnede pasientprøvene til brønnene. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 3. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRP-vaskebuffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 4. Tilsett 100μL av HRP-IgG-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 5. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur

5 7. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMBkromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 8. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. Centromere ELISA lav positiv, Centromere ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsetti for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da Centromere ELISA lav positiv, Centromere ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet Centromere ELISA høy positiv må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet Centromere ELISA lav positiv, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet Centromere ELISA høy positiv må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til Centromere ELISA lav positiv må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,25. d. ELISA negativ kontroll og Centromere ELISA høy positiv er ment for å kontrollere for substansiell reagensfeiling. Centromere ELISA høy positiv vil ikke sikre presisjon ved analysens cut-off. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. Beregning av resultater OD-middelverdien for hvert sett av duplikater bestemmes først. Reaksjonen for hver prøve kan deretter beregnes ved å dele prøvens OD-middelverdi med OD-middelverdien for Centromere ELISA lav positiv. Resultatet multipliseres med antall tildelte Centromere ELISA lav positiv enheter som står oppgitt på etiketten. Prøve OD Prøveresultat = x Centromere ELISA lav positiv (enheter) Centromere ELISA lav positiv OD (enheter) Reaksjon er relatert til antistoffmengde fremstilt på ikke-lineært vis. Selv om økninger og minskinger av pasientens antistoffkonsentrasjoner vil gjenspeiles i form av tilsvarende stigning eller fall i reaksjon, er endringen ikke proporsjonal (dvs. en fordobling av antistoffkonsentrasjon vil ikke fordoble reaksjonen). Hvis det påkreves en nøyaktigere kvantifisering av pasientens - 5 -

6 antistoff, skal serielle fortynninger av pasientprøven kjøres og den siste fortynningen som måles positiv i analysen, skal rapporteres som pasientens antistofftiter. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. Prøven kan da klassifiseres som negativ, svakt positiv, moderat positiv eller sterkt positiv i henhold til tabellen nedenfor. Enheter Negative <20 Svakt positiv Moderat til Sterkt positiv >30 1. Et positivt resultat indikerer forekomst av Centromere-antistoffer og antyder muligheten for CREST syndrom. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av Centromere-antistoff eller nivåer under analysens cut-off. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) ELISA. Centromere-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgG-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter. Prosedyrebegrensninger 1. Forekomsten av immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i pasientprøven kan forårsake et forhøyet nivå av ikke-spesifikk binding og produsere feilaktige positive analyseresultater. 2. Ikke alle CREST-pasienter er positive for CENP-A eller CENP-B-antistoff. 3. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 4. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier Evnen til QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) ELISA for å påvise IgG centromerantistoffer ble evaluert ved sammenlikning med en annen IFA-basert test for påvisning av centromer-antistoff. I tillegg ble det sammenliknet resultater med gjeldende klinisk diagnose i en ekstern klinisk evaluering og i en intern studie. Normalområde Total ble det kjørt 150 tilfeldige normalprøver. Populasjonen var fordelt på 89 menn og 61 kvinner i alderen fra 17 til 74 år. Bare én prøve (0,6%) viste seg å være positiv. Den ene positive prøven var reaktiv med 51 enheter og var også centromer-antistoff positiv ved IFA på HEp-2- cellesubstrat. Relativ sensitivitet og spesifisitet 397 prøver testet av både QUANTA Lite Centromere ELISA og en annen kommersielt ANA test for Centromere-antistoff. Resultatene er sammenfattet under: - 6 -

7 Centromere ved immunfluorescens + - QUANTA Lite Relativ sensitivitet = 98,7% Centromere Relativ spesifisitet = 100% Klinisk sensitivitet og spesifisitet QUANTA Lite TM Centromere-antistoffsettet ble evaluert i en ekstern klinisk studie og i en intern klinisk studie. Følgende tabell oppsummerer resultatene både fra begge kliniske studier. Pasientegruppe No. No. Pos (%) Centromere* (98,7%) Annen ANA positives* 59 0 Scl-70 positives* 29 0 Normale 150 1** (0.6%) * Alle disse var positive på HEp-2-cellesubstrat. Alle av de centromer-positive prøvene ovenfor ble testet i laboratoriet til Professor Rene' Louis Humbel of the Central Hospital, Luxemburg. ** Denne ene prøven viste seg å være centromer-positiv på HEp-2. Kryssreaksjon QUANTA Lite Centromere-settet ble testet med 59 prøver med høye nivåer av andre autoantistoffer slik som ANA, dsdna, ENA og andre. Ingen viste seg å reagere. Det samme skjedde med alle 29 Scl-70-positive prøvene som viste seg å være negative. Presisjon og reproduserbarhet Presisjonen og reproduserbarheten til analysen ble målt ved å kjøre seks gjentakelser hver av negative, svakt positive og sterkt positive prøver i seks separate analyser. Gjennomsnittsverdien til den sterkt positive prøven var 128,7, til den svakt positive prøven, 24,99 og den negative, 2,46. Standardavviket og variasjonskoeffisienten for hver prøve oppsummeres nedenfor. Negative Sterkt positiv Svakt positiv SD CV SD CV SD CV Samlet 0,26 10,6% 5,24 3,9% 0,87 3,5% Innen serien 0,14 5,7% 4,76 3,6% 0,91 3,6% Mellom serier 0,27 11,3% 5,92 4,4% 0,84 3,4% - 7 -

8 Referanser 1. Moroi Y., et al. Autoantibody to Centromere (kinetochore) in sclerderma sera. Proc Natl Acad Sci USA 77: , McHugh NJ. Centromere autoantibodies pp In Autoantibodies, JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, Earnshaw WC., et al. Analysis of anticentromere autoantibodies using cloned autoantigen CENP- B. Proc Natl Acad Sci USA 84: , Rattner JB., et al. CENP-F is a ca. 400 kda kinetochore protein that exhibits a cell cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton 26: , Vazquez-Abad D, et al. AntiCentromere autoantibodies: Evaluation of an ELISA using recombinant fusion protein CENP-B as antigen. Arthritis Rheum 37: , Whyte J., et al. Frequency of autoantibodies to a major epitope as the carboxyl terminal fragment of CENP-B in patients with autoimmune disease. Brit J Rheumatol 34: , Sun D., et al. Detection of anticentromere antibodies using recombinant CENP-A protein. Arthritis Rheumatism 39: , Russo K., et al. Circulating anticentromere CENP-A and CENP-B antibodies in patients with diffuse and limited systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. J Rheumatology 27: , Tan EM., et al. Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis: Anticentromere antibody and its relationship to CREST syndrome. Arthritis Rheumatism 23: , McCarty GA., et al. Anticentromere antibody clinical correlations and association with favorable prognosis in patients with scleroderma variants. Arthritis Rheumatism 26: 1-7, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service NOR November 2007 Rev