QUANTA Lite TM β 2 GPI IgM For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM β 2 GPI IgM For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM β 2 GPI IgM er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av β 2 GPI IgM kardiolipin-antistoffer i humant serum. Tilstedeværelse av β 2 GPI IgM antistoffer kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som en hjelp til å bedømme risikoen for trombose hos individer med systemisk lupus erythematosus (SLE) eller lupuslignende forstyrrelser. Sammendrag og forklaring av testen Antikardiolipinantistoffer (ACA) har blitt sterkt assosiert med venøs og arteriell trombose. 1-5 Disse funn ble først observert under studier av systemisk lupus erythematosus, en sykdom hvis én av flere symptomer inkluderer trombose. 6,7 Nylige studier 8-12 har vist at en 50kD serum-kofaktor er nødvendig for kardiolipinantistoffer, indusert hos SLE-pasienter, for å binde seg til kardiolipinen som er coatet på plastikkplater. Kofaktoren har blitt identifisert som β 2 -glykoprotein og denne har jeg også gitt termen apolipoprotein H. 8,12,13,14 Mens β 2 GPI har blitt kjent som en in vitro-inhibitor av den indre blodkoagulasjonsbane-, 15 ADP-avhengig aggregasjons-, 16 og protrombinase-aktivitet av aktiverte blodplater, 17 er dens fysiologiske funksjon fremdeles uklar. Det er blitt klart at antikardiolipinantistoff fra pasienter med antifosfolipid syndrom (APS) gjenkjenner en modifisert β 2 GPI-struktur og ikke kardiolipin, naturlig β 2 GPI eller en epitop strukturelt definert av både kardiolipin og β 2 GPI Galli et al. 9 og Viard et al. 18 rapporterte hver for seg at antikardiolipinantistoff hentet fra autoimmune pasienter (dvs. SLE og/eller APS) ble rettet mot β 2 GPI-molekylet coatet polystyrenplatene. Koike 11 og Matsuura 12 viste videre en uttømmende måte at β 2 GPI virkelig er antigenet som mange antikardiolipinantistoffpasienter har antisoff som bindes til og de viste videre at fosfolipid bare brukes til å forbinde β 2 GPI til faststoffasen. Det eksisterer en velkjent mulighet for at tradisjonelle antikardiolipinantistofftester kan gi feilaktige positive resultater grunnet fosfolipidenes kryssreaksjon med bestemte infeksjonssykdomsprøver, spesielt syfilis, og også med bestemte andre autoantistoffer som dobbelttråd DNA. 2,3 Ved å eliminere fosfolipid fra faststoffasen og ved bare å bruke β 2 GPI blir testen enda mer spesifikk for påvisning av mulige koagulasjonsproblemer. Denne forbedrede spesifisitet har blitt vist på en uttømmende måte av flere grupper. 11,12,16,17,19,20,21,22 β 2 GPI-autoantistofftesten er en nyttig og mer spesifikk analyse for bruk sammen med de tradisjonelt brukte antikardiolipinantistoff og lupus antikoagulanttestene for støtte til diagnostikk av trombose hos risikopasienter. IgG-klasse β 2 GPI-antistoffer ble funnet hos 17 av 47 SLEpasienter (36%). 18 Ni av disse 47 pasientene med SLE hadde trombose og 8 av disse (89%) hadde β 2 GPI antistoff. Hisham et al. 20 fant IgG-klasse β 2 GPI-antistoffer hos alle fem pasientene (100%) med minst to dokumenterte kliniske symptomer på APS. Alle fem pasientene hadde høye nivåer av β 2 GPIantistoffer. 8 av 14 pasienter (57%) klassifisert med lave nivåer av β 2 GPI-antistoffer hadde i det minste én tromboseforekomst. Tsutsumi, et al. 22 fant IgG og IgM-antistoffer mot β 2 GPI hos 10,1% og 5,8% henholdsvis av 308 tilfeldig utvalgte japanske SLE-pasienter. IgG β 2 GPI-antistoffer var vanligere hos pasienter som tidligere hadde hatt trombose. Denne gruppen rapporterte også at av 15 pasienter med gjentatte fostertap, var 20% IgG β 2 GPI-positive. De viste også at pasienter som hadde hatt trombose hadde større sannsynlighet for å være positive for IgM β 2 GPI og at nivåene av IgM β 2 GPI var høyere i grupper med trombose enn i gruppene uten. Av 15 pasienter uten tidligere fostertap var ingen IgM β 2 GPI-positive. Cabiedes, et al. 23 undersøkte 94 patienter med SLE og 39 hadde kliniske symptomer på APS. Det var sterkere assosiasjon mellom β 2 GPI-antistoffer enn med konvensjonell positiv ACA-test og kliniske symptomer på APS. IgG β 2 GPI-antistoffer forekom i sera fra 16 av 18 pasienter (89%) med APS. Av 22 pasienter positive for ACA, fremdeles uten kliniske symptomer på APS, var ingen β 2 GPI positive

2 Cerrato, et al. 24 fant IgG anti-β 2 GPI hos 87,5% av en gruppe på 32 pasienter som hadde hatt trombose (APS). IgM anti-β 2 GPI ble funnet hos 71,9% av denne samme gruppen av 32 pasienter. Sebastiani, et al. 25 påviste IgG anti-β 2 GPI hos 110 pasienter (20,3%) og IgM hos 109 pasienter (20,1%) av totalt 542 pasienter med SLE. Forekomst av anti-β 2 GPI var sterkt assosiert med ACA (p < 10-5 ). De viste videre at IgG og IgM β 2 GPI-antistoffer var assosiert med både venøs og arteriell trombose. Prosedyreprinsipper Renset β 2 GPI-antigen er bundet til brønnene til en mikrotiterplate av polystyren under betingelsene som vil konservere antigenet i naturlig tilstand. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum blandes i separate brønner slik at tilstedeværende β 2 GPI IgM antistoffer bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgM-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgM-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene mot en fem punktkalibreringskurve. Resultater rapporteres halvkvantitativt i standard IgM anti-β 2 GPI-enheter (SMU). Reagenser 1. En ELISA-mikrotiterplate av polystyren dekket med renset β 2 GPI antigen, i tillegg til både bovint og humant β 2 GPI (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum utenhumane antistoffer mot β 2 GPI, forhåndsfortynnet, 1,2mL 3. β 2 GPI IgM ELISA kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med ikke-humane antistoff mot β 2 GPI, forhåndsfortynnet, 1,2mL 4. β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator A, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant 5. β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator B, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant 6. β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator C, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant 7. β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator D, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant 8. β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator E, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant 9. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 10. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning 11. HRP IgM-konjugat, (geit), anti-humant, 1 ampulle grønnfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10mL 12. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10mL. 13. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10mL Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Derfor skal β 2 GPI IgM ELISA kontroll, β 2 GPI IgM ELISA kalibratorer og ELISA negativ kontroll behandles på samme vis som potensielt infisert materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med blyeller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider

3 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISA-brønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRP-konjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene negativt. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8-3 -

4 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 β 2 GPI ELISA-mikrotiterplate (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator A 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator B 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator C 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator D 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator E 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HRP IgM-konjugat, (geit), anti-humant IgM 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentrat ut (1:40) ved å blande innholdet av HRP-vaskekonsentrat med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i en uke ved 2-8 C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN β 2 GPI IgM ELISA Kalibratorer, β 2 GPI IgM ELISA Kontroll og ELISA Negativ Kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av kalibrator og kontroll og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. 5. Forberedelse til standardkurve: Bruk FORHÅNDSFORTYNNET β 2 GPI IgM kalibratorer fra A til E direkte fra ampullen for punktene A til og med E på fempunktsstandardkurven. Fempunktsstandardkurven har følgende verdier: Punkt A Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator A 150,0 B Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator B 75,0 C Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator C 37,5 D Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator D 18,8 eller 18,75 E Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator E 9,4 eller 9,375 Standard IgM β 2 GPI Enheter (SGU) - 4 -

5 Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES OPP TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Bland 100 µl fra hver av de fem kalibratorene, fortynnede pasientprøver, ELISA negativ kontroll og β 2 GPI IgM ELISA kontroll i brønnene. MERKNAD: Både β 2 GPI IgM ELISA kontroll og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet og klare til bruk. Verdien og angitte grenser til β 2 GPI IgM ELISA kontroll er skrevet på ampulleetiketten. Hvis kontrollen ikke faller innenfor de angitte grensene skrevet på etiketten, skal du gjenta undersøkelsen. 3. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 4. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRP-buffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 5. Tilsett 100μl av HRP-IgM-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 3, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 6. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 8. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMB-kromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 9. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. β 2 GPI IgM ELISA kalibratorer, β 2 GPI IgM ELISA kontroll og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsett for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da β 2 GPI IgM kalibratorer, β 2 GPI IgM ELISA kontroll og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator A og β 2 GPI IgM ELISA kontroll må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgM ELISA Kalibrator A må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til β 2 GPI IgM ELISA kontroll må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,25. d. β 2 GPI IgM ELISA kontrollkonsentrasjon må være innenfor de angitte grensene som er skrevet på etiketten. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis

6 Beregning av resultater 1. Bestem gjennomsnittsverdien for alle duplikatavlesningene. 2. Plott gjennomsnittsabsorbansen til kalibratorene for IgM-analysen mot logaritmen til konsentrasjonene deres. Bruk en linje som best tilpasses kurveplottet. Du kan alternativt bruke et log/log plot. SMU-enhetene som tildeles kalibratorene står på kalibratorampullen. 3. Bestem den ukjente β 2 GPI IgM-konsentrasjonen i standard β 2 GPI IgM enheter (SMU) fra X- aksen ved å lese av tilhørende absorbans på Y-aksen. Kalibratorer og kontroll for dette settet viser til IgM β 2 Glycoprotien referansestandarder. 4. Negative verdier strekker seg fra 0-20 enheter. Positive resultater er høyere enn 20 SMU. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. 1. Et positivt resultat indikerer forekomst av β 2 GPI IgM-antistoffer og antyder muligheten for bestemte autoimmune troboemboliske forstyrrelser som for eksempel de sekundære forstyrrelsene til systemisk lupus erythematosus eller andre lupusaktige trombose sykdommer. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av β 2 GPI IgM-antistoff eller nivåer under analysens cut-off. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM β 2 GPI IgM-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgM-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter. Prosedyrebegrensninger 1. Den kliniske betydningen av β 2 GPI antisoffer i sykdommer andre enn SLE er i dag tema for forskning. 2. Når det blir funnet negative anti-β 2 -titere sammen med kliniske indikasjoner, kan en lupus antikoagulant, antikardiolipin eller annen tilleggstesting være nødvendig. 3. Diagnose kan ikke gjøres på grunnlag av β 2 GPI -resultatene alene. Disse resultatene må tolkes sammen med resultater fra legeundersøke. 4. Behandling må ikke begynne bare på grunnlag av et positiv anti-β 2 -titer alene. Underbyggende kliniske symptomer må også forekomme. 5. Det forventes at noen prøver kan være antikardiolipin-positive selv om de er anti- β 2 GPInegative. Anti-β 2 GPI-testen er en mer spesifikk markør for troboembolisk risiko. Antikardiolipintesten kan produsere feilaktige positive resultater grunnet kryssreaksjon med dsdna eller bestemte infeksjonssykdomsantistoffer. 6. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier og Spesifikke Prestasjoner Karakteristikker Totalt 313 normalprøver ble testet med QUANTA Lite β 2 GPI IgM-settet. Denne gruppen var grovt inndelt mellom menn og kvinner i aldersgruppen fra 18 til av disse prøvene (2,6%) var positive for IgM β 2 GPI-antistoffer. Middelverdien for denne normalpopulasjonen var 2,8 SMU. Tabellen nedfor oppsummerer interne og eksterne kliniske studier av QUANTA Lite β 2 GPI IgM-testen. Pasientgruppe Antall Antall Positive (%) SLE + APS* (72,8) APS (60,0) SLE (Ingen APS) 60 7 (11,7) Revmatoid artritt 15 0 (0,0) Infeksjonssykdommer** (3,0) Normalprøver (2,6) *APS = Antifosfolipid syndrom - 6 -

7 Klinisk sensitivitet til IgM β 2 GPI antistofftesten er 66,5%, basert på tabellen ovenfor. Spesifisitet og klinisk overensstemmelse er henholdsvis 96,4% og 89,3%. Relativ sensitivitet og spesifisitet Konkordans med IgM kardiolipin IgM β 2 GPI-settet ble sammenliknet side om side med en IgM antikardiolipin (ACA)-test. 20 normale sera, 17 APS-pasienter og 22 SLE-sera fra pasienter uten entydige trombotiske sykdomsforløp ble evaluert. Dette sammenlikningsstudiet kan oppsummeres i den følgende tabellen. IgM β 2 GPI + - IgM ** Relativ sensitivitet 83,3% ACA Relativ spesifisitet 93,6% - 3* 44 Relativ effektivitet 91,5% * To av disse tre pasientene var fra APS-gruppen. ** En av disse to pasientene var fra normalgruppen og den andre var fra APS-gruppen. Ti prøver var positive med begge metodene. Ni av disse ti pasientene var fra APS-gruppen og én var fra SLE-gruppen. 44 prøver var negative med begge metodene. Det var to prøver som var ACA positive, men β 2 GPI negative. En av disse prøvene var fra normalgruppen og den andre var fra APS-gruppen. Det var tre prøver som var IgM ACA negative, men β 2 GPI positive. To av disse to pasientene var fra APS-gruppen og én var fra SLE-gruppen. SLE-prøven var svakt positiv med 26 SMU. Når regresjonene beregnes for IgM ACA og GPI-verdiene for de 20 normalseraene, produseres en r - verdi på 0,844 med en retningskoeffisient på 1,47 for de 17 APS- og 22 SLE-pasientene. Presisjon og reproduserbarhet Presisjons- og reproduserbarhetsdata ble beregnet ved å kjøre en negativ, sterk og moderat positiv prøve seks ganger om morgenen og om ettermiddagen i løpet av tre dager etter hverandre. Middelverdien til den negative prøven var 18,7, til den moderat positive prøven, 37,2 og den sterkt positive, 77,7. Resultatene innenfor og mellom forsøkene oppsummeres i tabellen nedenfor. Negative Moderat positiv Sterk positiv SD CV SD CV SD CV Samlet 0,77 4,2% 2,84 7,6% 2,05 2,6% Innen serien 0,55 3,0% 1,83 4,9% 1,76 2,3% Mellom serier 0,70 3,8% 2,47 6,6% 1,93 2,5% Referanser 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: , Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: , Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: , Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: , McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: , Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: , Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: ,

8 8. McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: , Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P. J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: , Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: , Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: , Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: , Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: , Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: , Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: , Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: , Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and clinical relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: , Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: , Tsutsumi, A., et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and clinical manifestations in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: , Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, Sebastiani, G.D., et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabrikkert av: Technical Service NOR November 2007 INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road Rev. 0 San Diego, CA United States of America Authorized Representative in the EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: